莊麗麗,宋林眉,王芳,李玉群,張柱岐,劉凱*

(1.濱州職業(yè)學(xué)院,山東濱州 256603;2.濱州高新區(qū)青田街道辦事處,山東濱州 256603)

核桃(JuglansregiaL.)是中國廣泛栽培的經(jīng)濟林樹種,具有較高的生態(tài)、社會和經(jīng)濟效益,深受消費者喜愛,被列為“四大堅果”之一。目前,外界惡劣環(huán)境嚴(yán)重影響核桃樹體的正常生理活動[1]。鈣依賴型蛋白激酶(calcium dependent protein kinase,CDPK)是植物體內(nèi)一類重要的Ca2+結(jié)合蛋白,通過Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與植物響應(yīng)非生物脅迫的過程[2]。CDPKs家族各成員間的蛋白結(jié)構(gòu)比較保守,均含有4個高度保守的結(jié)構(gòu)域:N端可變域(N-terminal variable domain)、絲氨酸/蘇氨酸激酶域(protein kinase domain)、自抑制域(auto-inhibitory domain)和類鈣調(diào)素結(jié)合域(calmodulin-like domain)[2]。CDPKs家族蛋白是由一個編碼CaMK的基因與一個編碼鈣調(diào)素的基因在進化中融合而形成的[3]。目前CDPK家族基因已在擬南芥[4]、水稻[5]、辣椒[6]、黃瓜[7]、西瓜[8]、梨樹[9]、楊樹[10]等許多植物中被鑒定出來。有研究指出CDPKs依賴脫落酸途徑緩解干旱脅迫帶來的影響[11],而且參與植物對低溫脅迫的響應(yīng)過程[12]。研究表明CDPKs通過磷酸化激活下游目標(biāo)基因來參與響應(yīng)逆境過程[13]。本研究通過生物信息學(xué)分析鑒定核桃基因組中的CDPK家族成員,分析該家族成員結(jié)構(gòu),并研究其在冷脅迫和不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平,為進一步明確核桃CDPKs家族基因響應(yīng)冷脅迫應(yīng)答機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

轉(zhuǎn)錄組測序材料為2年生盆栽的嫁接苗,品種為清香,砧木為贊美;將盆栽苗通過人工氣候室模擬0.5 ℃冷脅迫,分別放置時間為0,4,8,12,24,36,48 h,采樣及測序參照劉凱[14,15]方法。測序數(shù)據(jù)已上傳到國家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中心,網(wǎng)址為(https://bigd.big.ac.cn/?lang=zh),項目編號為 PRJCA006073。

不同組織(根、嫩莖、嫩葉、雄花、雌花、老葉)參照劉凱[14]方法采樣后進行RNA測序。

1.2 試驗方法

1.2.1核桃CDPK基因家族分析 根據(jù)Uniport(https://www.uniprot.org/)擬南芥CDPK家族蛋白序列構(gòu)建隱馬爾科夫模型,并于NCBI搜索下載核桃蛋白序列(GCF_001411555.2),結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析對家族成員進行鑒定。

利用NCBI在線分析軟件ORF Finder (https://www.ncbi. nlm.nih.gov /orffnder/)查找CDPK基因家族成員的ORF。蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)使用ExPASy (https://web.expasy.org/ protparam/)在線網(wǎng)站分析;利用ngLOC與Nuc-PLoc在線軟件(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Nuc-PLoc/)進行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.2.2核桃CDPK家族基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析 冷脅迫48 h后分析清香的轉(zhuǎn)錄表達(dá),以FPKM(每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的fragments)為測定標(biāo)準(zhǔn)進行基因轉(zhuǎn)錄水平分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃基因組CDPK家族成員鑒定及分析

核桃基因組CDPK家族成員基本信息。利用擬南芥CDPK家族蛋白序列構(gòu)建隱馬爾科夫模型,以此來搜索核桃CDPK蛋白數(shù)據(jù),初步篩選出52個核桃CDPK家族基因。利用Pfam結(jié)構(gòu)域分析,去除冗余后最終獲得38個核桃CDPK家族基因,編碼38條蛋白質(zhì)序列,根據(jù)染色體位置并對其命名。這些CDPKs基因開放閱讀框長度在399～2 181 bp,翻譯后蛋白長度在132～645個氨基酸;等電點在5.34～9.14之間;利用ExPasy進行穩(wěn)定性預(yù)測,結(jié)果顯示該家族有10個成員為不穩(wěn)定蛋白;利用ngLOC和Nuc-PLoc在線軟件預(yù)測結(jié)果顯示,38個核桃CDPKs 蛋白均定位于細(xì)胞核。

2.2 不同物種 CDPK 家族進化樹分析

本研究對核桃(38個)、擬南芥(18個)CDPK家族蛋白進行了系統(tǒng)發(fā)育分析(圖1)。結(jié)果表明,核桃與擬南芥 CDPK家族基因有一定的同源性,將有助于進一步研究該基因家族成員功能的研究。

圖1 CDPK家族基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

2.3 核桃CDPK家族成員轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

將清香盆栽苗在人工氣候室0.5 ℃條件下,進行不同時長冷處理,進行RNA-seq分析后結(jié)果表明,核桃JrCDPK家族38個基因出現(xiàn)不同的響應(yīng)(圖2),其中0～36 h時,JrCDPK4轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平呈明顯上升趨勢,48 h時開始下降。通過對不同組織進行轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析,結(jié)果表明JrCDPK4、JrCDPK25、JrCDPK26在根中轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平較高;JrCDPK28在雌花中轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平較高;JrCDPK25在芽中轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平較高。

圖2 JrCDPK家族基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析注:左為冷害脅迫處理不同時間,T0為對照,T4、T8、T12、T24、T36、T48分別代表了冷脅迫處理4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h。右為不同組織表達(dá),CH:雌花;G:根;LY:老葉;NJ:嫩莖;NY:嫩葉;XH:雄花;Y:芽。

3 討論與結(jié)論

CDPK家族基因在植物的生長發(fā)育、代謝調(diào)節(jié)、逆境脅迫過程中均有著重要作用[16]。隨著全基因組的測序,目前在多種植物中已經(jīng)鑒定出CDPK轉(zhuǎn)錄因子家族,其中辣椒30個[6]、西瓜22個[8]、梨樹31個[9]、楊樹30個[10]等。本研究通過生物信息學(xué)在核桃全基因組中挖掘鑒定出38個CDPK家族基因,并對其成員進行結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析,豐富了植物CDPK基因家族種類。本研究對核桃的38個與擬南芥的18個CDPK家族蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)現(xiàn)核桃與擬南芥 CDPK家族基因有一定的同源性,與林歡[6]等研究結(jié)果一致。

目前,已有研究證實CDPK基因能夠響應(yīng)冷害脅迫。高圓麗[17]等采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,利用pPZP221-CDPK20對煙草葉片進行遺傳轉(zhuǎn)化,驗證了山藥CDPK20基因在山藥植株中耐低溫性的作用;ZHAO[18]等根據(jù)桃子采后不同處理的RNA-seq數(shù)據(jù),證明PpCDPK2、PpCDPK7、PpCDPK10、PpCDPK13與采后冷脅迫相關(guān);劉偉[19]驗證了CDPK基因在棉花低溫脅迫響應(yīng)中起著重要作用。本研究通過清香, 0.5 ℃冷處理48 h后進行轉(zhuǎn)錄組測序,發(fā)現(xiàn)冷脅迫48 h后核桃JrCDPK4轉(zhuǎn)錄水平顯著升高,并在根和嫩葉中轉(zhuǎn)錄水平較高,推測該基因可能參與響應(yīng)冷脅迫以及核桃根、嫩葉的生長發(fā)育,將為揭示核桃CDPK基因響應(yīng)冷脅迫機理奠定基礎(chǔ)。