許海峰,宋長(zhǎng)艷,傅茂潤(rùn) ,王貴芳,沈廣寧, 陳新*

(1.山東省果樹(shù)研究所/國(guó)家核桃板栗種質(zhì)資源圃,山東泰安 271000;2.東平街道農(nóng)業(yè)生產(chǎn)綜合服務(wù)隊(duì),山東東平 271500;3.齊魯工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東濟(jì)南 250353)

核桃 (JuglansregiaL.)屬于胡桃科 (Juglandaceae) 核桃屬 (Juglans) 落葉喬木,是世界四大堅(jiān)果(核桃、榛子、杏仁和腰果)之一[1]。核桃仁營(yíng)養(yǎng)豐富,能夠有效預(yù)防心血管疾病,是Ⅱ型糖尿病人的首選食品,被譽(yù)為“21 世紀(jì)的超級(jí)食品”[2,3],同時(shí)作為中國(guó)木本油料樹(shù)種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值。中國(guó)栽培核桃已有 2 000 多年的歷史,種質(zhì)資源豐富, 南北均有分布[4]。據(jù)《中國(guó)林業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒(2018)》記載,2018年中國(guó)核桃種植面積達(dá)816.57萬(wàn)hm2(1.22余億畝),產(chǎn)量達(dá)382萬(wàn)t,居世界第一位[5]。

隨著核桃集中栽培面積的擴(kuò)大和抗病良種的缺乏,炭疽病已成為核桃生產(chǎn)中的災(zāi)難性病害,嚴(yán)重制約了中國(guó)核桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[6,7]。核桃炭疽病主要由膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosprioides)引起[8],但在一些感病核桃中也分離出部分暹羅炭疽菌(Colletotrichumsiamense)、果生刺盤胞菌(Colletotrichumfructicola)和尖孢炭疽菌(Colletotrichumacutatum)等[9-11]。核桃炭疽病主要危害葉片和果實(shí)(圖1),在6～7月開(kāi)始發(fā)病,8～9月最為嚴(yán)重,癥狀表現(xiàn)為斑近圓形、黑褐色,病斑中心區(qū)凹陷產(chǎn)生黑色小點(diǎn)[12]。目前,核桃炭疽病防治主要以苯并咪唑和咪鮮胺類殺菌劑等化學(xué)藥劑為主[13-15],長(zhǎng)期單一使用此類藥劑,導(dǎo)致了抗藥性產(chǎn)生和對(duì)環(huán)境造成危害,選育抗病品種是炭疽病防治最理想的方法。然而,中國(guó)主栽核桃品種的炭疽病抗性鑒定和評(píng)價(jià)還不夠全面。筆者采用膠孢炭疽菌室內(nèi)接種方法,初步鑒定和評(píng)估了中國(guó)103個(gè)主栽核桃品種對(duì)膠孢炭疽病的抗性,以期為核桃抗病性品種選育和炭疽病的綜合防治提供理論依據(jù)。

圖1 炭疽病核桃果實(shí)受害狀

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試菌株膠孢炭疽菌,由山東省果樹(shù)研究所果樹(shù)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。選取無(wú)損傷、無(wú)病蟲害的103份果實(shí)(樹(shù)齡一致、花后120 d同期采收)用于膠孢炭疽菌接種,采摘于山東省果樹(shù)研究所金牛山核桃種質(zhì)資源圃。核桃品種(系)信息如下:

表1 山東省果樹(shù)研究所金牛山核桃種質(zhì)資源圃103個(gè)核桃品種(系)信息

1.2 馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基配置

按照蒸餾水、馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂質(zhì)量比為100∶20∶2∶2的比例配制培養(yǎng)基。將未發(fā)芽的馬鈴薯去皮、清洗、切塊后置于蒸餾水中,在電爐上加熱并使其保持沸騰狀態(tài)20 min,冷卻后經(jīng)8層紗布過(guò)濾,然后加入一定量去離子水補(bǔ)足至所需量,再加入稱取好的葡萄糖、瓊脂,搖勻,于滅菌鍋中121 ℃下滅菌20 min,冷卻至室溫培養(yǎng)基待用。

1.3 菌株活化

采用劃線活化的方式,將膠孢炭疽菌在PDA培養(yǎng)基上于 28 ℃ 恒溫培養(yǎng) 5 d后,用打孔器取適量菌餅放入離心管中,加入無(wú)菌蒸餾水,渦旋振蕩器震蕩10 s,混勻后用2層無(wú)菌紗布過(guò)濾,最后借助血細(xì)胞計(jì)數(shù)板將孢子懸浮液濃度調(diào)整至 1×106個(gè)/mL,備用。

1.4 核桃果實(shí)接種

供試核桃果實(shí)經(jīng)0.5%的NaClO溶液浸泡30 s后用清水沖洗干凈,自然陰干,備用。用無(wú)菌的不銹鋼釘在所有青皮核桃果實(shí)赤道表面的中心部位扎孔(大小一致),在每個(gè)傷口中注入15 μL 1×106個(gè)/mL膠孢炭疽菌孢子懸浮液,選擇無(wú)菌蒸餾水接種做對(duì)照,在室溫下自然風(fēng)干,每個(gè)品種重復(fù)3個(gè)果實(shí)。然后將 103份核桃果實(shí)分別移入塑料筐(長(zhǎng)320 mm、寬240 mm、高100 mm)內(nèi),用0.03 mm的聚乙烯保鮮袋封口,放置在保鮮柜中(溫度25 ℃、濕度90%),在損傷接種后的0、2、4、6、8 d觀察103份核桃果實(shí)炭疽病感病情況,拍照記錄。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

采用十字交叉法量取病斑直徑并進(jìn)行分析,用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 103份核桃果實(shí)炭疽病感染情況

103份核桃果實(shí)膠孢炭疽菌接種后發(fā)病趨勢(shì)及感病情況見(jiàn)圖2。

圖2 103個(gè)核桃品種果實(shí)膠孢炭疽菌接種后8 d內(nèi)感病情況

可以看出,膠孢炭疽菌接種后4 d內(nèi),所有的核桃果實(shí)都沒(méi)有感病;從第6 d開(kāi)始,103份核桃果實(shí)青皮表現(xiàn)出不同的發(fā)病趨勢(shì),表明室內(nèi)接種膠孢炭疽菌可能存在6 d的緩沖期,但此時(shí)仍有53份果實(shí)未發(fā)病;至第8 d,不同品種核桃果實(shí)已表現(xiàn)出明顯感病差異,梨園12號(hào)(編號(hào)93)病斑幾乎覆蓋整個(gè)果實(shí)青皮,表明此品系對(duì)膠孢炭疽菌的抗性最弱。

2.2 103份核桃果實(shí)抗病性評(píng)價(jià)

由上述知,膠孢炭疽菌接種后第6 d,103份核桃果實(shí)呈現(xiàn)不同的發(fā)病趨勢(shì),至第8 d病斑呈現(xiàn)明顯差異。測(cè)量接種后第8 d果實(shí)病斑直徑大小(圖3,圖4)可對(duì)不同核桃果實(shí)抗病性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。結(jié)果表明:有40份核桃果實(shí),如魯核1號(hào)(編號(hào)13)、元林(編號(hào)25)、中林1號(hào)(編號(hào)44)、強(qiáng)特勒(編號(hào)56)、魯康8號(hào)(編號(hào)102)、魯康10號(hào)(編號(hào)103)等病斑直徑為0,對(duì)膠孢炭疽菌表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗性;有3份核桃果實(shí),梨園5號(hào)(編號(hào)86)、梨園12號(hào)(編號(hào)93)、下港薄皮(編號(hào)98)病斑直徑大于4 cm,對(duì)膠孢炭疽菌表現(xiàn)極敏感性;其余60份核桃果實(shí)病斑直徑差異不等,對(duì)膠孢炭疽菌表現(xiàn)輕中度感染。

圖3 膠孢炭疽菌接種8 d后編號(hào)1-50核桃果實(shí)病斑直徑

圖4 膠孢炭疽菌接種8 d后編號(hào)51-103核桃果實(shí)病斑直徑

3 小結(jié)與討論

炭疽病的發(fā)生和缺乏有效的防控技術(shù)是影響中國(guó)核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一,核桃炭疽病主要由膠孢炭疽菌引起[8],是全球公認(rèn)的第八類重要植物病原菌之一[16],已被國(guó)家林業(yè)局確定為林木有害微生物[17]。膠孢炭疽菌以半活養(yǎng)寄生的方式完成其致病過(guò)程,該病菌的特點(diǎn)是潛伏期長(zhǎng)、發(fā)病時(shí)間短、暴發(fā)性強(qiáng),主要對(duì)葉和果實(shí)進(jìn)行侵染。室內(nèi)接種膠孢炭疽菌能較好的排除田間環(huán)境因素的影響,最大程度保證條件一致,對(duì)篩選抗病核桃品種(系)和抗性物質(zhì)具有重要參考價(jià)值[18]。本研究通過(guò)室內(nèi)接種膠孢炭疽菌鑒定了103個(gè)核桃品種(系)對(duì)膠孢炭疽菌感染情況,結(jié)果表明,室內(nèi)接種膠孢炭疽菌后第6 d,103份果實(shí)病斑表現(xiàn)出不同發(fā)病趨勢(shì),至第8 d呈現(xiàn)明顯差異,表明室內(nèi)接種膠孢炭疽菌可能存在一定緩沖期,魯核1號(hào)、元林、中林1號(hào)、強(qiáng)特勒、魯康8號(hào)、魯康10號(hào)等40份核桃果實(shí)無(wú)明顯病斑,高度抗病,梨園5號(hào)、梨園12號(hào)、下港薄皮3份核桃果實(shí)病斑直徑大于4 cm,極敏感染病,此外,另60份核桃果實(shí)均有輕中度感染。依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,按照病斑大小、抗病性強(qiáng)弱對(duì)103份核桃果實(shí)進(jìn)行了初步抗病性評(píng)價(jià),研究結(jié)果可為核桃抗病性品種選育和炭疽病綜合防治提供理論依據(jù)。