曾友才 唐紹軍

急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）是一種突發(fā)性疾病，多發(fā)于老年人，指腦部血液發(fā)生中斷而引起的腦組織壞死，該疾病具有發(fā)病率高、致死率高的特點[1]。腦側(cè)支循環(huán)是指當腦部血管發(fā)生堵塞時，側(cè)邊潛在的血管開通或生成，從而達到血液代償?shù)淖饔?，具有提高腦血管再通概率，并減少出血轉(zhuǎn)化、改善預后的重要作用[2]。AIS 的具體發(fā)病機制尚未明晰，但有研究顯示，頸動脈粥樣硬化參與AIS 的進程[3]。而頸動脈粥樣硬化斑塊的形成及其穩(wěn)定性與血清miR-34a、sirt1 水平異常關系密切[4]。miR-34a 參與血管內(nèi)皮損傷過程，在心腦血管疾病中具有重要作用[5]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，sirt1）作為miR-34a 的靶基因之一，具有保護細胞、抗凋亡、減緩炎癥的作用，參與疾病的進展程度[6]。本研究主要通過檢測miR-34a、sirt1 的表達水平，旨在探究二者與AIS 患者側(cè)支循環(huán)及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017 年2 月至2020 年2 月浙江省義烏復元醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的87 例AIS 患者為研究對象。根據(jù)側(cè)支循環(huán)評估結(jié)果將其分為側(cè)支循環(huán)不良組（36 例）和側(cè)支循環(huán)良好組（51 例）。選取同期健康體檢者為對照組（60 例）。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準[倫審（2017）第05 號]。所有研究對象均知情同意。

1.2 納入及排除標準 納入標準：（1）臨床確診為AIS[7]；（2）首次病發(fā)AIS；（3）年齡≥18 歲；（4）從發(fā)病到進行數(shù)字減影血管造影檢查不超過7 d。排除標準：（1）患有肝腎心嚴重疾病患者；（2）妊娠期女性；（3）患有惡性腫瘤及感染性疾病者；（4）不積極配合治療者。

1.3 主要試劑及儀器 離心機購自貝克曼庫爾特國際貿(mào)易（上海）有限公司（型號Avanti JXN-30）；超低溫冷藏箱購自山東博科（型號BDF-86V348）；Trizol試劑購自于齊一生物科技（上海）有限公司（批號ml095476）；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號4366596）、qRT-PCR 試劑盒（批號11791200）、qRT-PCR 儀均購自于賽默飛世爾科技（中國）有限公司（型號Pikoreal）；生工生物工程（上海）股份有限公司進行引物合成，引物序列：miR-34a 正向：5'-TCTGTCTCTCTTGGCAGTGTCTT-3'，反向5'-AATGGTTGTTCTCCACTCTCTCTC-3'；U6 正向：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'；反向5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；sirt1 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司（批號ml038429）。

1.4 觀察指標 收集入組者臨床資料，包括性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、入院時美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（the National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）評分[8]、梗死體積。

1.5 方 法

1.5.1 樣品采集 采集所有受試者空腹靜脈血3～5 mL，離心（3000 r/min，10 min）取上清液后，儲存于-80 ℃。

1.5.2 DSA 檢查及側(cè)支循環(huán)評估 在右側(cè)股動脈處進行穿刺（改良的Seldinger 穿刺技術(shù)），放入5F 動脈鞘。在主動脈弓處置入5F 的Pigtail 導管，進行造影。雙側(cè)頸總動脈、雙側(cè)椎動脈處、雙側(cè)鎖骨下動脈、頸內(nèi)動脈在更換5F 椎動脈造影管后進行DSA 檢查。采用ASITN/SIR 血流分級系統(tǒng)對其側(cè)支循環(huán)進行評估[9]，分為側(cè)支循環(huán)不良組（0～1 級）和側(cè)支循環(huán)良好組（2～4 級）。

1.5.3 qRT-PCR 法檢測血清miR-34a 表達水平采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測血清miR-34a 水平。在各血清樣品中加入Trizol 試劑進行總RNA 的提取，并檢測其純度。嚴格按照RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒試驗步驟將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR擴增反應條件為：95 ℃，5 min；95 ℃，30 s；60 ℃，30 s，共計40 個循環(huán)，其中以U6 為對照。采用2-ΔΔCT法計算miR-34a 的相對表達水平。

1.5.4 ELISA 法檢測血清sirt1 表達水平 采用特定的ELISA 試劑盒檢測血清中sirt1 水平，其具體操作步驟嚴格遵守試劑盒說明書。

1.6 隨 訪 對AIS 患者進3 個月的隨訪評估其神經(jīng)功能恢復狀態(tài)，采用改良Rankin 量表評分[10]，當分數(shù)≤2 分時表示預后良好，＞2 分時則表示預后不良。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 23.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料均符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用配對樣本t 檢驗；計數(shù)資料用百分比表示，采用χ2檢驗。miR-34a、sirt1 水平對AIS 患者預后的診斷價值通過受試者工作特征曲線（ROC）進行分析。AIS 患者發(fā)生不良預后的危險因素通過多因素Logistic 進行分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組研究對象一般臨床資料比較 對照組、側(cè)支循環(huán)不良組、側(cè)支循環(huán)良好組之間的年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），側(cè)支循環(huán)不良組患者入院時NIHSS 評分、梗死體積較側(cè)支循環(huán)良好組較高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組研究對象一般臨床資料比較

2.2 各組研究對象血清miR-34a、sirt1 表達水平比較 miR-34a 水平在側(cè)支循環(huán)不良組、側(cè)支循環(huán)良好組中顯著高于對照組，而且側(cè)支循環(huán)不良組較側(cè)支循環(huán)良好組miR-34a 水平升高（P＜0.05）；sirt1 水平側(cè)支循環(huán)不良組、側(cè)支循環(huán)良好組中顯著低于對照組，而且側(cè)支循環(huán)不良組較側(cè)支循環(huán)良好組水平下降（P＜0.05）。見表2。

表2 各組研究對象血清miR-34a、sirt1 表達水平比較（±s）

表2 各組研究對象血清miR-34a、sirt1 表達水平比較（±s）

注：sirt1 為沉默信息調(diào)節(jié)因子1；與對照組比較，aP＜0.05；與側(cè)支循環(huán)良好組比較，bP＜0.05

組別對照組側(cè)支循環(huán)良好組側(cè)支循環(huán)不良組F 值P 值例數(shù)60 51 36 miR-34a/U6 1.02±0.28 1.69±0.51a 2.46±0.67ab 101.966<0.001 sirt1（μg/L）2.16±0.54 1.06±0.27a 0.64±0.16ab 203.098<0.001

2.3 AIS 預后良好與預后不良患者miR-34a、sirt1水平及相關指標比較 預后良好組73 例，預后不良組14 例。與預后良好組相比，預后不良組AIS 患者血清miR-34a 水平、入院時NIHSS 評分、梗死體積較高（P＜0.05），而sirt1 水平較低（P＜0.05）。見表3。

表3 AIS 預后良好與預后不良患者miR-34a、sirt1 水平及相關指標比較（±s）

表3 AIS 預后良好與預后不良患者miR-34a、sirt1 水平及相關指標比較（±s）

注：sirt1 為沉默信息調(diào)節(jié)因子1；NIHSS 為美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表

組別預后良好組預后不良組t 值P 值例數(shù)73 14 miR-34a/U6 1.86±0.55 2.78±0.71 5.462<0.001 sirt1（μg/L）0.94±0.24 0.61±0.14 4.970<0.001 NIHSS 評分（分）11.79±3.36 19.75±4.61 7.622<0.001梗死體積（cm3）6.13±2.34 10.57±3.32 6.051<0.001

2.4 ROC 曲線分析miR-34a、sirt1 水平對AIS 患者預后的診斷價值 miR-34a、sirt1 水平對AIS 患者預后不良的診斷AUC 分別為0.830、0.840，截斷值分別為2.216，0.807 μg/L，敏感性分別為85.70%、92.90%，特異性分別為65.80%、69.90%。見表4，圖1。

圖1 miR-34a、sirt1 水平對AIS 患者預后診斷價值的ROC曲線

表4 ROC 曲線分析血清miR-34a、sirt1 水平對AIS 患者預后的診斷價值

2.5 AIS 患者不良預后多因素Logistic 分析 以NIHSS 評分、梗死體積、miR-34a 及sirt1 水平為自變量，以表3 中為P＜0.05 的指標因變量進行Logistic多因素分析，結(jié)果顯示，梗死體積、miR-34a 水平是AIS 患者不良預后的獨立危險因素，高水平sirt1 是其獨立保護因素（P＜0.05）。見表5。

表5 AIS 患者不良預后多因素Logistic 分析

3 討 論

AIS 是指腦部組織局部發(fā)生供血不足或者完全中斷，而造成腦組織環(huán)死的疾病[10]。患者的缺血半暗帶、梗死體積、病情嚴重程度及預后與側(cè)支循環(huán)的形成有密切的關系[11]。目前腦血管造影是臨床上評估側(cè)支循環(huán)的有效標準，但是需要進行侵入操作，部分患者因某些原因并不能接受，因此尋找簡單、快速有效的生物標志物對側(cè)支循環(huán)的形成及AIS 患者的預后有重要的意義。

細胞增殖、分化是新血管生成的重要依據(jù)。miRNA 在轉(zhuǎn)錄后與靶基因結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用，在心腦血管疾病中扮演著重要角色。miR-34a 在腦、心等血管內(nèi)皮生成、細胞凋亡中有重要作用[12]。趙茹等[13]研究表明，AIS 側(cè)支循環(huán)不良組患者入院時大面積腦梗死例數(shù)、NIHSS 評分顯著高于側(cè)支循環(huán)良好組。在本研究中，與對照組相比，側(cè)支循環(huán)良好組、側(cè)支循環(huán)不良組患者血清miR-34a 明顯上調(diào)，而且側(cè)支循環(huán)不良組較側(cè)支循環(huán)良好組miR-34a 水平、NIHSS評分、梗死體積較高，提示miR-34a 可能參與了AIS患者側(cè)支循環(huán)的形成。

sirt1 是miR-34a 潛在的靶基因之一，是一種依賴NAD+的去乙?；?，具有保護細胞，抗炎癥反應的作用[14]。鄢曉麗等[15]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，血清sirt1 水平在慢性心力衰竭患者中明顯降低，且心功能分級越差，sirt1 水平越低。有研究證實，miR-34a通過靶向調(diào)節(jié)sirt1，能夠保護細胞，從而減少細胞凋亡[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，sirt1 水平側(cè)支循環(huán)不良組、側(cè)支循環(huán)良好組中顯著低于對照組，而且側(cè)支循環(huán)不良組較側(cè)支循環(huán)良好組水平下降，其差異均有統(tǒng)計學意義，提示sirt1 參與了AIS 患者側(cè)支循環(huán)的形成。

朱艷玲等[17]研究證實，腦梗死后認知功能障礙患者外周血miR-34a、sirt1 水平呈異常表達，并表明高水平miR-34a 是影響其發(fā)生的獨立危險因素，高水平sirt1 是影響其發(fā)生的獨立保護因素。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與預后良好組相比，預后不良組AIS 患者血清miR-34a 水平較高，而sirt1 水平較低，提示miR-34a、sirt1 水平的異常表達可能與AIS 患者的不良預后有關。miR-34a、sirt1 水平診斷AIS 患者預后不良AUC 分別為0.830、0.840，敏感性分別為85.70%、92.90%，特異性分別為65.80%、69.90%，提示miR-34a、sirt1 對AIS 患者是否發(fā)生不良預后有較高的預測效能，且當miR-34a 水平大于2.216，sirt1 水平<0.807 μg/L 時，AIS 患者有發(fā)生不良預后的風險。

綜上所述，AIS 患者miR-34a 水平升高，而sirt1水平下降，二者均對AIS 患者是否發(fā)生不良預后有較高的預測效能。但本研究仍存在一些問題，如樣本量較少，患者的隨訪時間較短，需進一步深入研究miR-34a、sirt1 與AIS 復雜機制之間的關系。