梁 冰 赫天蘭 徐西林 趙 兵△

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(Knee Osteoarthritis,KOA)是一種好發(fā)于中老人群的慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)病,主要以膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨退行性病變和關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生為病理特征?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于KOA的治療以延緩軟骨退化、降低疼痛、提高其功能、重建受損軟骨為主,但治療后易于復(fù)發(fā),毒副作用明顯,因此需要更好的治療方法。近年來隨著中醫(yī)藥介入KOA的治療,KOA的臨床療效得以顯著提高,但其作用機(jī)制尚不明確。為進(jìn)一步探明中藥改善KOA的作用機(jī)制,

本實(shí)驗(yàn)選取治療KOA的狗脊多糖作為研究對象,膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶建立膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型建立膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型,用蛋白質(zhì)印記法檢測膝關(guān)節(jié)軟骨組織半胱氨酸天冬氨酸蛋自酶1(Caspase-1)/Nod樣受體蛋白3 (NLRP3)的蛋白表達(dá)。以期為狗脊多糖改善KOA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物實(shí)驗(yàn)選擇SPF級健康成年雄性SD大鼠60只[哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部提供,許可證號:SCXK(黑)2019-001]體質(zhì)量(200±20)g。實(shí)驗(yàn)操作遵照實(shí)驗(yàn)動物倫理保護(hù)標(biāo)準(zhǔn),飼養(yǎng)箱設(shè)置溫度 20～23 ℃,濕度控制在50%～60%,每日6 h光照模擬。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后稱重實(shí)驗(yàn)造模。

1.1.2 主要藥品及試劑狗脊多糖提純方法:稱取中藥飲片狗脊多糖100 g,粉碎后過200目篩檢,取狗脊細(xì)粉50 g,石油醚冷萃脫酯除去雜質(zhì),水提法粗提狗脊多糖,按照料液比1∶10比例,每次在80 ℃溫度提取3小時,分別進(jìn)行3次提取,合并提取液在55 ℃進(jìn)行減壓濃縮,將濃縮液以3500 r/min離心10 min,加入氯仿-正丁醇混合溶液進(jìn)行充分振搖,經(jīng)離心分離去除蛋白雜質(zhì),90%乙醇分級沉淀,3500 r/min離心10 min收集沉淀,無水乙醇洗滌收集物,經(jīng)低溫干燥獲得狗脊多糖。按照人-大鼠體表面積折算公式計算狗脊多糖給藥劑量,按照120、60、30 mg/kg階梯濃度給藥。狗脊多糖濃度檢測方法:苯酚-硫酸比色法檢測狗脊多糖的含量。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑主要儀器木瓜蛋白酶(規(guī)格:25 g,型號:P3250,批號:Lot# O51M1847V,由美國Sigma公司生產(chǎn))。丙二醛試劑盒、超氧化物歧化酶試劑盒、白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-a酶連免疫吸附試劑盒,胱氨酸天冬氨酸蛋自酶1、Nod樣受體蛋白3抗體(購自上海生物工程有限公司)。Fax-20100型酶標(biāo)儀購自美國INStat公司;尼康SMZ745型光學(xué)顯微鏡購自上海普赫生物科技有限公司;ChemiDoc-MP全能型凝膠成像分析儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 造模方法大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食水24 h,稱重,采用10%的水合氯醛溶液按30 mg/kg劑量進(jìn)腹腔注射麻醉。大鼠仰臥固定于處置板上,大鼠膝關(guān)節(jié)屈曲位,備皮充分暴露注射點(diǎn)位,以骸骨下極白色骸鍵外緣的膝眼為進(jìn)針點(diǎn),向髁間窩方向注射木瓜蛋白酶(木瓜蛋白酶注射劑量0.1 ml/kg),注射后碘伏常規(guī)消毒,棉簽按壓注射針孔15 s。實(shí)驗(yàn)于第1、3、6天進(jìn)行注射給藥,3次注射后完成造模。向空白組大鼠,右膝關(guān)節(jié)注射生理鹽水。

造模試劑:木瓜蛋白酶(規(guī)格:25 g,型號:P3250,批號:Lot# O51M1847V,由美國Sigma公司生產(chǎn))。試劑配制方法[1]:將木瓜蛋白酶生理鹽水分別配成4%濃度,注射大鼠膝關(guān)節(jié)腔。

1.3 動物分組及給藥方法將75只大鼠隨機(jī)分為隨機(jī)分為對照組、模型及狗脊多糖高、中、低劑量組,每組15只,成功復(fù)制動物模型后對照組、模型組給予2 ml生理鹽水灌胃,狗脊多糖高、中、低劑量組給予120、60、30 mg/kg階梯濃度給藥(灌胃治療前將狗脊多糖溶解于2 ml生理鹽水中),每日1次連續(xù)灌胃治療4周。

1.4 標(biāo)本采集與數(shù)據(jù)檢測方法末次給藥24 h后,大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉處死,大鼠眼眶取血,檢測血清中白細(xì)胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子a(TNF-α)。

大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織研磨液制備:大鼠行頸椎脫臼處死,置于處置臺手術(shù)剪打開雙側(cè)膝關(guān)節(jié),充分暴露膝關(guān)節(jié),采用尖手術(shù)刀剝離脛骨側(cè)軟骨、內(nèi)外側(cè)股骨骼關(guān)節(jié)軟骨。集中收集軟骨,剪碎處理,組織大小約 1 mm3/單位體積,大鼠軟骨組織經(jīng)液氮冷卻3 min,將軟骨組織、研磨粒15 mm磨珠放入研磨罐內(nèi),放入已經(jīng)在-80 ℃度冰箱預(yù)冷好的適配器中,加入變性液,β-巰基乙醇,組織研磨儀上以3000 r/min研磨10 min,得到勻漿狀的大鼠軟骨組織研磨液。移液器吸取大鼠軟骨組織研磨液0.02 ml,以3%乙酸溶液0.40 ml稀釋緩沖,標(biāo)本生物學(xué)纖維鏡下觀察標(biāo)本內(nèi)白細(xì)胞計數(shù)。ELISA試劑盒檢測大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織研磨液MDA、SOD含量,使用酶標(biāo)儀讀取吸光度值,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活性。

Caspase-1/NLRP3蛋白檢測方法:大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織研磨液加入組織裂解液,充分裂解離心對上清液定量參照試劑盒說明書操作流程進(jìn)行蛋白檢測,每組檢測取50 μg樣本進(jìn)行SDS-聚丙乙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn),常規(guī)轉(zhuǎn)模、脫脂牛奶封閉、一抗5 ℃孵育過夜(NLRP3按照1∶3000、Caspase-1按照1∶2000、比例稀釋),孵育洗滌后加入辣根過氧化物酶2抗室溫孵育 2 h,暗室顯色試劑盒顯色曝光,檢測蛋白灰度值與β-actin灰值比較計算蛋白表達(dá)含量。

2 結(jié)果

表1模型組中大鼠組織研磨液白細(xì)胞數(shù)量明顯高于對照組及各劑量治療組,治療組藥物劑量增加組織研磨液隨之降低,表明狗脊多糖對炎性關(guān)節(jié)組織具有顯著抗炎作用;表2狗脊多糖高中低劑量組治療結(jié)束后IL-6、TNF-α炎癥因子表達(dá)與模型組比較顯著降低,表明通過IL-6、TNF-α抑制炎癥反應(yīng);表3數(shù)據(jù)表明狗脊多糖可降低軟骨組織MDA含量,提高組織SOD含量,治療效果隨治療劑量而遞增;表4高中低劑量治療組Caspase-1/NLRP3相對蛋白含量表達(dá)與模型組比較顯著降低,表明狗脊多糖可抑制Caspase-1/NLRP3蛋白表達(dá)從而抑制炎癥反應(yīng)。

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)組織研磨液白細(xì)胞數(shù)量比較

表2 各組大鼠血清中IL-6 TNF-α含量比較

表3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織MDA SOD含量比較 (只,

表4 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織Caspase-1/NLRP3相對蛋白含量表達(dá)(灰度值)比較 (只,

3 討論

中國人口逐漸老齡化,KOA成為骨科常見疾病。在隨著年齡變化骨骼鈣鹽流失,膝關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨質(zhì)、滑膜、關(guān)節(jié)囊結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大改變,伴隨著老年人體質(zhì)量的增加,膝關(guān)節(jié)已經(jīng)不能支撐人體負(fù)荷,在運(yùn)動后出現(xiàn)疼痛,嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量。疾病發(fā)展過程中累及骨骼肌肉,最終形成關(guān)節(jié)畸形,發(fā)展初期伴有明顯的膝關(guān)節(jié)疼痛,疼痛因個體的耐受能力因人而異,但均伴有一定程度的膝關(guān)節(jié)活動受限。中醫(yī)治療早期辨證以痹證為主,疾病發(fā)展后期以痿病為主。臨床以關(guān)節(jié)部位的疼痛、關(guān)節(jié)僵硬等癥狀伴隨始終,具有很高的致殘率[2]。KOA發(fā)病過程中,關(guān)節(jié)內(nèi)氧自由基含量的異常表達(dá)可通過介導(dǎo)氧化反應(yīng)引起軟骨細(xì)胞膜及胞內(nèi)線粒體正常結(jié)構(gòu)的破壞,影響細(xì)胞內(nèi)能量生成,阻礙基質(zhì)蛋白多糖與膠原的合成,并誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)細(xì)胞線粒體凋亡途徑發(fā)生,最終引起細(xì)胞發(fā)生自溶[3,4]。

狗脊具有祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)腰膝的功效,臨床中用于治療風(fēng)濕痹痛,腰膝酸軟等骨關(guān)節(jié)疾病。 現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,狗脊中的化學(xué)成分主要含有多糖、糖苷類化合物、揮發(fā)油淀粉、芳香族、甾體類、萜類、黃酮類等化合成分。狗脊的70%乙醇提取物對去卵巢誘導(dǎo)的高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松大鼠體內(nèi)的抗骨質(zhì)疏松活性研究中證實(shí),具有提高大鼠骨強(qiáng)度,阻止骨小梁微觀結(jié)構(gòu)惡化作用[5]。

臨床中使用的狗脊多為產(chǎn)自中國華東、華南及西南地區(qū)的金毛狗脊,以干燥的根莖部位入藥。味苦、甘,性溫。骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中氧化反應(yīng)的轉(zhuǎn)歸影響較大的因素主要有以MDA和NO為代表的促氧化因子和以SOD為主的抗氧化因子[6,7]。

Nod樣受體蛋白3 (NLRP3)炎癥小體能夠調(diào)節(jié)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1 (Caspase-1)活化,誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥,是各種炎癥性疾病治療的靶點(diǎn)[8]。綜上所述,狗脊多糖可降低膝關(guān)節(jié)骨細(xì)胞炎癥因子表達(dá),抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),緩解大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織損傷,減少關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎性滲出,其機(jī)制可能與抑制NLRP3/Caspase-1信號通路相關(guān),為臨床上使用狗脊多糖治療KOA提供了理論依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)大鼠在完成3次關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶注射后,關(guān)節(jié)腔均出現(xiàn)不同程度關(guān)節(jié)滑膜組織損傷,膝關(guān)節(jié)組織研磨液白細(xì)胞計數(shù)升高,大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中超氧化物歧化酶含量升高,丙二醛含量降低、大鼠血清中白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-α含量升高,炎癥因子明顯升高符合滑膜炎表現(xiàn)。與模型組相比狗脊多糖低、中、高劑量組膝關(guān)節(jié)組織研磨液中超氧化物歧化酶含量呈升高趨勢,大鼠血清中的腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6含量、丙二醛含量呈下降趨勢;與模型組比較狗脊多糖低、中、高劑量組膝關(guān)節(jié)軟骨組織半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1/Nod樣受體蛋白3表達(dá)呈下降趨勢,結(jié)果表明狗脊多糖主要通過抑制大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng),并通過抑制胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1/Nod樣受體蛋白3表達(dá)治療大鼠模型。