鄧雨詩，夏民權(quán)，馬靜，周元華，孫衛(wèi)青

水合環(huán)境/磁場對肌紅蛋白氧化穩(wěn)定性的作用機制

1長江大學生命科學學院，湖北荊州 434023；2長江大學機械工程學院，湖北荊州 434023

【目的】探究磁場作用下水合環(huán)境影響肌紅蛋白（myoglobin，Mb）氧化穩(wěn)定性的作用機制，為改善Mb的氧化穩(wěn)定性提供依據(jù)?！痉椒ā吭? ℃下，設(shè)置低強度（3 mT）和高強度（12 mT）兩種磁場環(huán)境，磁場分別處理Mb水溶液、Mb粉末、去離子水（磁場處理去離子水后再溶解Mb），磁場處理時間為1 h，以未經(jīng)磁場處理的Mb水溶液作為對照。通過高鐵肌紅蛋白的相對含量、血紅素鐵含量以及紫外吸收帶的變化情況來分析Mb的氧化穩(wěn)定特性；同時，利用圓二色譜、拉曼光譜和熒光光譜技術(shù)分析Mb二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)及卟啉鐵結(jié)構(gòu)的變化，探究磁場對Mb氧化穩(wěn)定性的作用機理?！窘Y(jié)果】磁場直接處理Mb粉以及磁場處理溶劑水，然后再溶解Mb，兩種處理方式均對高鐵肌紅蛋白相對含量無顯著影響（＞0.05），而3 mT和12 mT磁場處理Mb水溶液均顯著提高了高鐵肌紅蛋白的相對含量。血紅素鐵含量和血紅素邵氏帶紫外吸收結(jié)果顯示，血紅素卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)對磁場環(huán)境很敏感，不同強度的磁場對Mb血紅素結(jié)構(gòu)均有顯著的破壞，并且高強度的磁場環(huán)境對卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)破壞程度相對更大。Mb三級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)結(jié)果表明，3 mT磁場先處理溶劑水再溶解Mb，以及3 mT和12 mT磁場處理Mb水溶液均顯著促進Mb二級結(jié)構(gòu)的展開和側(cè)鏈基團色氨酸和酪氨酸殘基的氧化損傷。拉曼光譜結(jié)果顯示，12 mT磁場處理Mb水溶液促使Mb通過二硫鍵進行交聯(lián)?！窘Y(jié)論】Mb水溶液中水合作用直接影響磁場對肌紅蛋白氧化特性的作用效應(yīng)，磁場處理促進Mb中心鐵以及血紅素卟啉環(huán)的氧化，可能是磁場改變了水分子的介電性、電離程度等物理性質(zhì)，以及Mb與水之間的氫鍵狀態(tài)，進一步影響了Mb的結(jié)構(gòu)，螺旋結(jié)構(gòu)展開，側(cè)鏈基團暴露，加速了血紅素結(jié)構(gòu)的破壞和血紅素鐵的流失，促進了中心鐵的氧化。

肌紅蛋白；磁場；水合環(huán)境；氧化；卟啉

0 引言

【研究意義】肌紅蛋白（myoglobin，Mb）是肉及肉制品的主要色素成分，其氧化穩(wěn)定性直接影響肉及肉制品的色澤和商品價值。提高肌紅蛋白氧化穩(wěn)定性的有效對策成為肉類研究的重點關(guān)注對象之一。研究磁場處理對Mb氧化穩(wěn)定性的影響是否為磁場作用于水，改變了Mb的水合環(huán)境，從而影響肌紅蛋白的構(gòu)象及氧化特性，以通過磁場調(diào)控來控制肌紅蛋白的相對穩(wěn)定，對推進磁場處理技術(shù)在肉類加工領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】She等[1]利用高強度磁場對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進行處理，通過傅里葉變換紅外光譜技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)磁場環(huán)境對細菌蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)均有顯著影響。Silva等[2]研究磁場環(huán)境對牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液理化性質(zhì)和超濾性質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)磁場作用下，BSA溶液預(yù)處理能夠改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，提高超濾膜的性能。劉勇[3]和于靜波[4]研究了磁場對酶和酶促反應(yīng)的影響，結(jié)果表明，磁場環(huán)境下，過氧化氫酶、-淀粉酶、脲酶、脂肪酶、纖維素酶構(gòu)象的二級結(jié)構(gòu)均發(fā)生顯著變化。ZHONG等[5]也曾報道，10 T強度的磁場環(huán)境能促使蛋白質(zhì)溶液的黏度增大，磁場環(huán)境消失時，蛋白質(zhì)溶液粘度恢復(fù)到初始值。SHOKROLLAHI等[6]研究了含鐵大豆蛋白在磁場環(huán)境下理化性質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯變化，但是其三級結(jié)構(gòu)、大小和活性均有顯著變化，并且推測磁場對蛋白質(zhì)的影響效果可能與含鐵的數(shù)量有關(guān)。同時，筆者課題組也研究發(fā)現(xiàn)磁場處理能顯著影響Mb的氧化穩(wěn)定性[7-8]。前人報道磁場作用會改變水的氫鍵的鍵長[9]，會改變水的pH、溶解性、電導(dǎo)率等理化性質(zhì)[10]，而蛋白質(zhì)表面結(jié)合著水分子，其在維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象中具有重要的作用?！颈狙芯壳腥朦c】磁場處理對含鐵蛋白的功能特性具有較大的影響[3-4,10-14]，而蛋白質(zhì)的構(gòu)象強烈依賴于介質(zhì)水的性能，磁場對水的性能影響必然會影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象以及功能特性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以Mb為研究對象，利用不同強度的磁場分別處理Mb水溶液、Mb粉末（Mb粉末先經(jīng)磁場處理后再用水溶解）、溶解Mb的去離子水（磁場先處理去離子水，然后再用其溶解Mb），研究水合環(huán)境/磁場對肌紅蛋白氧化穩(wěn)定性的作用機制。

1 材料與方法

試驗于2017—2020年在長江大學生命科學學院實驗樓進行。

1.1 材料與試劑

95%—100%的馬骨骼肌肌紅蛋白購于美國Sigma-Aldrich公司。連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）、乙二胺四乙酸（EDTA）、三羥基氨基甲烷（Tris）、尿素、十二烷基硫酸鈉（SDS）、鹽酸、氫氧化鈉購于天津市福晨化學試劑廠，三氯乙酸（TCA）、抗壞血酸（ASC）、三氯化鐵、硫氰酸銨、硫酸亞鐵、甲醇購于國藥集團化學試劑有限公司，-巰基乙醇、8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS）、過氧化氫、氯仿購于麥克林試劑公司，甘氨酸購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1900紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司），BR-2000渦流混勻器（BIO-RAD Laboratories公司），BSA224S分析天平（德國賽多利斯股份公司），F(xiàn)97熒光分光光度計（海棱光技術(shù)有限公司）上，J-1500圓二色性旋光分光儀（日本JASCO分光株式會社），Zetersizer Nano ZS納米粒度及電位分析儀（英國Malvern儀器有限公司），AA-6300C原子吸收分光光度計（日本島津儀器有限公司），Labram HR800激光共焦拉曼光譜儀（法國Horiba Jobin Yvon公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預(yù)處理 參考TANG等[15]的方法，略做調(diào)整，稱取100 mg的肌紅蛋白原料，溶于50 mL超純水中，加入500 mg連二亞硫酸鈉（連二亞硫酸鈉，Na2S2O4），溶解后倒入超濾杯中，通入氮氣，氣壓為0.25 MPa，低勻速磁力攪拌，超濾時間約3 h，超濾一次后，向杯中倒入50 mL超純水洗脫一次。超濾完成后，用10 mL超純水將超濾膜上的肌紅蛋白沖洗下來，濾液倒入到充滿氮氣的凍干盒中，置于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.3.2 磁場處理 磁場處理方式設(shè)計3種，分別是磁場處理Mb粉末，然后溶解在去離子水中（標記為TA）；磁場處理去離子水，然后溶解未處理的Mb粉末（標記為TB）；磁場處理Mb水溶液（標記為TC）。處理的磁場強度分別設(shè)置為低強度3 mT（標記為1），高強度12 mT（標記為2），以未經(jīng)磁場處理的Mb水溶液作為對照（標記為C）。磁場設(shè)備由長江大學自主定制，磁場強度范圍為0—25 mT，通過調(diào)節(jié)電流、電壓進行控制，磁場強度用高斯計實時檢測。磁場處理時間均為1 h，溫度為4 ℃。

1.3.3 不同形態(tài)Mb高鐵肌紅蛋白含量的測定 取不同處理的Mb樣品，參考KRZYWICKI[16]，張同剛等[17]和馮哲等[18]的方法，測定磁場處理后Mb水溶液樣品在572、565、545和525 nm處的吸光值，采用以下公式計算總Mb濃度及高鐵肌紅蛋白（metmyoglobin，MetMb）的比例。

總肌紅蛋白（mmol?L-1）=-0.166A572+0.086A565+ 0.088A545+0.099A525

MetMb（%）=(-2.514R1+0.777R2+0.800R3+1.098) ×100

式中，R1、R2、R3分別為吸光度比值A(chǔ)572nm/A525nm、A565nm/A525nm、A545nm/A525nm。

1.3.4 Mb邵氏帶吸收及血紅素鐵含量變化 參照BENJAKUL等[19]的方法，通過紫外分光光度計記錄Mb樣品在300—440 nm處的紫外吸收峰。記錄每組樣品在525 nm處的紫外吸收，計算出樣品中肌紅蛋白的含量（毫摩爾消光系數(shù)為7.6，肌紅蛋白分子量為17 600 Da）。血紅素鐵含量以肌紅蛋白計算，肌紅蛋白含鐵0.35%，結(jié)果以mg?mL-1蛋白質(zhì)展示。

1.3.5 內(nèi)源熒光分析 Mb固有的內(nèi)源熒光分析參考WANG等[20]和馬君燕等[21]的方法。以430 nm激發(fā)波光長，1 000 nm?min-1速度掃描200—900 nm的發(fā)射波長。另取樣品，以280 nm激發(fā)波長光，1 000 nm?min-1速度掃描200—900 nm范圍的發(fā)射波長，增益電壓（PMT）均為650 V。每個樣品設(shè)置3個平行，每個平行掃描3次。

1.3.6 圓二光譜測定 參照ZOU等[22]、BANERJEE等[23]和ZHU等[24]的方法進行調(diào)整。通過圓二色性旋光分光儀動態(tài)光譜掃描記錄Mb樣品（0.4 mg?mL-1）遠紫外區(qū)（250—190 nm）光譜變化。使用空白（去離子水）進行基線掃描。容器選擇1.00 mm×1.00 cm比色皿。速度為200 nm?min-1，帶寬為1.00 nm，響應(yīng)時間為1.00 s。

1.3.7 拉曼光譜分析 拉曼光譜測定參照XIA等[25]和XIA等[26]的方法，略有調(diào)整。通過激光共焦拉曼光譜儀記錄樣品在400—2 000 cm-1的光譜振動情況，選用785 nm激發(fā)光源，激光強度為50%，每個樣品均進行多點掃描，24 ℃環(huán)境溫度下測定。

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用軟件SPSS 25.0，單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）用Tukey檢驗，結(jié)果表示為平均值±標準差（＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 不同處理Mb樣品的氧化變化

Mb樣品的氧化情況通過MetMb[27-28]、血紅素邵氏帶以及血紅素鐵[29]的變化表征。由圖1可知，磁場直接處理Mb粉末以及磁場預(yù)先處理溶劑水對Mb自然氧化形成MetMb均無顯著影響，而磁場處理Mb水溶液可以顯著提高MetMb的形成（TC1和TC2組MetMb分別增加了19.47%和28.48%，＜0.05）。

不同小寫字母表示樣品間差異顯著（P＜0.05）。C：對照；TA1：3 mT磁場處理Mb粉末，然后溶解在去離子水中；TA2：12mT磁場處理Mb粉末，然后溶解在去離子水中；TB1：3 mT磁場處理去離子水，然后溶解未處理的Mb粉末；TB2：12 mT磁場處理去離子水，然后溶解未處理的Mb粉末；TC1：3 mT磁場處理Mb水溶液；TC2：12 mT磁場處理Mb水溶液。下同

血紅素的氧化損傷情況通過邵氏帶的紫外吸收信號峰的強弱來間接反映，血紅素的卟啉結(jié)構(gòu)以及其衍生物在400 nm附近有較強的吸收帶（邵氏帶）[30]，由圖2-A看出，與對照組C相比，處理組TA1和TA2的Mb卟啉結(jié)構(gòu)信號峰分別降低了23.79%和26.98%，處理組TB1和TB2的信號峰分別降低了40.48%和46.60%，處理組TC1和TC2的信號峰分別降低了27.67%和42.29%。說明3種磁場處理方式均會導(dǎo)致血紅素結(jié)構(gòu)不同程度的破壞，其中，磁場預(yù)先處理溶劑水然后再溶解Mb，對血紅素結(jié)構(gòu)破壞最嚴重；同時，磁場強度也顯著影響血紅素結(jié)構(gòu)，12 mT的磁場對Mb血紅素結(jié)構(gòu)的破壞程度比3 mT的磁場影響更大。

血紅素破壞的另一個結(jié)果為血紅素中心鐵元素的流失。由圖2-B中Mb樣品血紅素鐵含量測定結(jié)果可知，TA、TB和TC 3種磁場處理方式均顯著加速了血紅素鐵的流失，其變化趨勢與血紅素邵氏帶的變化趨勢一致，進一步驗證了血紅素結(jié)構(gòu)的破壞。

2.2 不同處理Mb結(jié)構(gòu)的變化

2.2.1 內(nèi)源熒光性分析（三級結(jié)構(gòu)） Mb內(nèi)源熒光掃描分析可以反映其三級結(jié)構(gòu)基團微環(huán)境的變化[13]，其中284 nm附近表示酪氨酸殘基，325 nm附近表示色氨酸殘基，565 nm附近表示卟啉鐵。由圖3可以看出，3種磁場處理方式，均沒有導(dǎo)致色氨酸和酪氨酸殘基以及卟啉鐵峰位置的紅移或藍移，但是熒光強度均發(fā)生了一定程度的降低，其中磁場處理Mb水溶液（TC處理組）熒光強度降低最顯著。說明磁場處理會導(dǎo)致Mb側(cè)鏈以及卟啉鐵發(fā)生不同程度的氧化變化，而水作為介質(zhì)會加速這種變化。

圖2 不同處理組Mb樣品的血紅素變化

2.2.2 不同處理Mb二級結(jié)構(gòu)的變化 圖4圓二光譜圖中，190—202 nm表現(xiàn)為正性光譜曲線，202—240 nm表現(xiàn)為負性光譜曲線，表明Mb不同結(jié)構(gòu)對圓二左、右旋偏振光的吸收率不同。從圓二光譜數(shù)據(jù)分析得到圖5所示的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，TC1處理組的-折疊結(jié)構(gòu)顯著降低（＜0.05），-螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)顯著升高（＜0.05），其他處理組的Mb二級結(jié)構(gòu)無顯著變化。說明適當強度磁場處理Mb水溶液，可以通過對蛋白表面結(jié)合水的作用而影響蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。

圖3 Mb樣品熒光圖譜

圖4 Mb樣品圓二光譜圖譜

2.3 不同處理Mb樣品的拉曼光譜分析

拉曼光譜的一些特征帶反映了蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)酰胺區(qū)構(gòu)象、C-C伸縮振動的變化，局部微環(huán)境情況，色氨酸殘基、酪氨酸雙重態(tài)、脂肪族氨基酸帶以及蛋白質(zhì)分子間相互作用的變化等（圖6）。

圖5 Mb樣品二級結(jié)構(gòu)

如表1所示，在TB2和TC2處理時，I759/I1003的強度顯著高于空白對照（＜0.05），表明高強度（12 mT）磁場處理去離子水或Mb水溶液均能影響色氨酸殘基的微環(huán)境，導(dǎo)致色氨酸殘基的掩埋[31]。與空白對照組相比，TA1和TC2處理組的I1360/I1340強度分別減少了9.29%和8.00%（＜0.05），表明這兩組處理色氨酸殘基微環(huán)境的親水性增加。830 cm-1和850 cm-1附近的拉曼光譜帶能夠反映蛋白質(zhì)酪氨酸殘基微環(huán)境的變化[32]。當酪氨酸殘基雙峰（I850/I830）強度范圍為0.9—1.45時，表明此時酪氨酸殘基暴露于極性環(huán)境中或作為中等或弱的氫鍵受體；而在0.7—1.0時則表明酪氨酸殘基被包埋在疏水環(huán)境中或作為強氫鍵的供體[28]。本試驗中，各組樣品的I850/I830比值均在0.8—0.9，且無顯著性差異（＞0.05），而TB和TC處理組的熒光結(jié)果表明酪氨酸殘基發(fā)生了顯著的氧化損傷，說明磁場先處理Mb溶劑水以及磁場處理Mb水溶液，其樣品的酪氨酸殘基均會作為強氫鍵的供體。不同處理組的I1450/I1003強度與對照組相比均無顯著性差異（＞0.05），表明試驗范圍內(nèi)的磁場環(huán)境對樣品脂肪族殘基的微環(huán)境無影響。510 cm-1附近的信號峰歸因于C-C-S-S-C-C二硫鍵的振動[29]。本試驗中，I510/I1003反映的二硫鍵變化，在12 mT磁場處理Mb水溶液（TC2組）表現(xiàn)出顯著的增加（增加了2.73倍），說明僅在水合環(huán)境中，高強度磁場（12 mT）導(dǎo)致肌紅蛋白形成了二硫鍵形式的氧化交聯(lián)，也進一步證實了水合環(huán)境是磁場改變肌紅蛋白結(jié)構(gòu)的重要環(huán)境因素。

圖6 Mb樣品拉曼光譜分析

表1 拉曼光譜統(tǒng)計學分析肌紅蛋白分子間相互作用狀態(tài)

3 討論

3.1 水合環(huán)境/磁場對Mb氧化的作用效應(yīng)

肉色變化的本質(zhì)是Mb狀態(tài)的改變，這種變化由Mb不同形態(tài)氧化和還原的速率共同決定[2]。在肉及肉制品加工貯藏過程中，一些理化因素的改變可能會影響Mb的結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部的血紅素輔基與珠蛋白結(jié)合能力的改變可能會影響血紅素輔基中心卟啉鐵的價位，從而影響Mb的氧化還原狀態(tài)，繼而影響肉及肉制品顏色[33]。

本研究表明磁場處理Mb水溶液會顯著促進其卟啉環(huán)側(cè)鏈基團和中心鐵的氧化，高強度（12 mT）磁場處理對其破壞更顯著。主要原因可能是磁場改變了水中氫鍵形成和斷裂的動態(tài)平衡，水分子締合影響了Mb的水合作用和血紅素的溶解狀態(tài)[34]，使其側(cè)鏈基團暴露，再加上磁化水會增加氧在水中的溶解度[35-36]，從而促進了卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)和側(cè)鏈基團的氧化。另外，可能是由于磁場具有一定的能量，蛋白質(zhì)的某些極性基團（如卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)）能夠吸收來自磁場的能量，引發(fā)Mb鍵位的振動，改變了Mb的分子構(gòu)象，導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的展開，使從蛋白質(zhì)內(nèi)部游離出來的巰基和氨基成為內(nèi)環(huán)境中自由基攻擊的首選目標，從而延緩了血紅素卟啉環(huán)中心鐵元素的氧化，相對減緩了MetMb的形成。

丁振瑞等[34]研究表明，正常狀態(tài)下，水分子間主要存在著氫鍵相互作用，氫鍵處于形成和斷裂的動態(tài)平衡之中，磁場對水的作用，會改變水分子周圍電子分布，從而影響其氫鍵的動態(tài)平衡，導(dǎo)致水分子締合成較大的水分子團，影響其表面張力。朱元保等[35]和費慶志[36]的研究也表明，水作為極性分子，在磁場環(huán)境中，會受到洛倫茲力的影響而產(chǎn)生螺旋運動，同時磁化水能提高氧氣在水中的溶解度。水是磁場作用于Mb的良好介質(zhì)，沒有水存在的條件下，磁場環(huán)境對Mb的作用效果會顯著削弱。

3.2 水合環(huán)境/磁場影響Mb的二級、三級結(jié)構(gòu)

本研究中，用磁場預(yù)先處理的去離子水溶解Mb，對Mb卟啉結(jié)構(gòu)的破壞最顯著，同時顯著促進了色氨酸、酪氨酸殘基的氧化損傷；適當強度磁場處理Mb水溶液，可以通過對溶劑水的作用使蛋白質(zhì)的-折疊結(jié)構(gòu)向-螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。另外，3和12 mT磁場環(huán)境處理Mb水溶液均顯著促進了Mb側(cè)鏈基團色氨酸和酪氨酸的氧化。根據(jù)Mb拉曼光譜側(cè)鏈基團的結(jié)果，分析主要原因可能是磁場處理促進了水分子間氫鍵的形成，微環(huán)境的親水性增加，極性水分子受磁場洛倫茲力影響，加速了環(huán)境中氧與Mb分子間的碰撞，促進了Mb側(cè)鏈基團的氧化損傷。

磁場直接處理Mb粉，其二級結(jié)構(gòu)無顯著變化，低強度（3 mT）磁場處理Mb水溶液顯著促進其二級結(jié)構(gòu)由-折疊向-螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，高強度（12 mT）磁場處理Mb水溶液，顯著促進其形成二硫鍵形式的氧化交聯(lián)，其原因可能是，水作為一種極性分子，其偶極矩并不能對稱抵消，受到磁場因素影響，水分子的運動狀態(tài)發(fā)生改變，從而影響了水的介電性、表面黏度、電離程度、滲透壓[10]、蒸發(fā)量、比熱容、沸點[37]等性質(zhì)，進一步導(dǎo)致Mb分子氧化狀態(tài)的改變。說明磁場可以通過對Mb水合環(huán)境的作用而影響其二級和三級結(jié)構(gòu)，從而影響其功能特性，而水合環(huán)境是磁場改變Mb結(jié)構(gòu)的重要環(huán)境因素。

4 結(jié)論

磁場處理Mb水溶液，均顯著促進了Mb的氧化，提升了MetMb的含量，而磁場直接處理Mb粉再加水溶解和磁場先處理溶劑水再溶解Mb均對MetMb相對含量的提高無顯著促進作用。3種處理方式對血紅素結(jié)構(gòu)均有顯著破壞，且較強的磁場環(huán)境（12 mT）對卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)破壞程度更大。3 mT強度磁場處理水、3 mT和12 mT磁場環(huán)境處理Mb水溶液均顯著導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開和氨基酸基團（色氨酸和酪氨酸殘基）的氧化損傷，12 mT磁場環(huán)境處理Mb水溶液顯著影響二硫鍵的振動。磁場主要是通過作用于水合環(huán)境，改變水分子的偶極性、運動狀態(tài)及碰撞頻率，影響水的介電性、溶氧性等理化性質(zhì)，從而進一步影響肌紅蛋白結(jié)構(gòu)的展開，加速血紅素鐵的流失，以促進肌紅蛋白的氧化。

[1] SHE Z C, HU X, ZHAO X S, REN Z M, DING G J. FTIR investigation of the effects of ultra-strong static magnetic field on the secondary structures of protein in bacteria. Infrared Physics & Technology, 2009, 52(4): 138-142.

[2] SILVA F L, ZIN G, REZZADORI K, LONGO L C, TIGGEMANN L, SANTOS SOARES L, CUNHA PETRUS J C, VLADIMIR DE OLIVEIRA J, DI LUCCIO M. Changes in the physico-chemical characteristics of a protein solution in the presence of magnetic field and the consequences on the ultrafiltration performance. Journal of Food Engineering, 2019, 242: 84-93.

[3] 劉勇. 磁場對酶及酶促反應(yīng)過程的影響[D]. 天津: 天津大學, 2007.

LIU Y. Effect of magnetic field on enzyme and enzymatic reaction process [D]. Tianjin: Tianjin University, 2007. (in Chinese)

[4] 于靜波. 磁場對脂肪酶和纖維素酶的影響[D]. 天津: 天津大學, 2009.

YU J B. Effect of magnetic field on lipase and cellulase[D]. Tianjin: Tianjin University, 2009. (in Chinese)

[5] ZHONG C W, WAKAYAMA N I. Effect of a high magnetic field on the viscosity of an aqueous solution of protein. Journal of Crystal Growth, 2001, 226(2/3): 327-332.

[6] SHOKROLLAHI S, GHANATI F, SAJEDI R H, SHARIFI M. Possible role of iron containing proteins in physiological responses of soybean to static magnetic field. Journal of Plant Physiology, 2018, 226: 163-171.

[7] XIA M Q, CHEN Y X, MA J, YIN X L, WANG L, WU W J, XIONG G Q, SUN W Q, ZHOU Y H. Effects of low frequency magnetic field on myoglobin oxidation stability. Food Chemistry, 2020, 309: 125651.

[8] XIA M Q, CHEN Y X, MA J, YIN X L, LI Z S, XIONG G Q, WANG L, WU W J, SUN W Q, ZHOU Y H. Low frequency magnetic fields modification on hydrogen peroxide oxidized myoglobin-isolate and mechanisms underlying the chain reaction process. Food Chemistry, 2020, 312: 126069.

[9] ATEF M M, ABD EI-BASET M S, ELL-KAREEM A, AIDA S, FADEL M A. Effects of a static magnetic field on haemoglobin structure and function. International Journal of Biological Macromolecules, 1995, 17(2): 105-111.

[10] 柳士鑫. 磁化水性質(zhì)的變化對蛋白質(zhì)分子和大腸桿菌蛋白質(zhì)的影響[D]. 天津: 天津大學, 2007.

LIU S X. Effects of changes in properties of magnetized water on protein molecules andprotein [D]. Tianjin: Tianjin University, 2007. (in Chinese)

[11] ZHENG J B, HAN Y R, GE G, ZHAO M M, SUN W Z. Partial substitution of NaCl with chloride salt mixtures: impact on oxidative characteristics of meat myofibrillar protein and their rheological properties. Food Hydrocolloids, 2019, 96: 36-42.

[12] LIU R, LONERGAN S, STEADHAM E, ZHOU G H, ZHANG W G, HUFF-LONERGAN E. Effect of nitric oxide on myofibrillar proteins and the susceptibility to calpain-1 proteolysis. Food Chemistry, 2019, 276: 63-70.

[13] UTRERA M, MORCUENDE D, ESTéVEZ M. Fat content has a significant impact on protein oxidation occurred during frozen storage of beef patties. LWT - Food Science and Technology, 2014, 56(1): 62-68.

[14] 孫攀. 超聲波處理對金槍魚肌原纖維蛋白理化特性、結(jié)構(gòu)和凝膠特性的影響[D]. 錦州: 渤海大學, 2019.

SUN P. Effects of ultrasonic treatment on physicochemical properties, structure and gel properties of tuna myofibrillar protein [D]. Jinzhou: Bohai University, 2019. (in Chinese)

[15] TANG J, FAUSTMAN C, HOAGLAND T A. Krzywicki revisited: equations for spectrophotometric determination of myoglobin redox forms in aqueous meat extracts. Journal of Food Science, 2006, 69(9): C717-C720.

[16] KRZYWICKI K. The determination of haem pigments in meat. Meat Science, 1982, 7(1): 29-36.

[17] 張同剛, 羅瑞明, 李亞蕾, 周亞玲. 基于拉曼光譜法測定冷鮮牛肉中肌紅蛋白相對含量. 食品科學, 2018, 39(2): 210-214.

ZHANG T G, LUO R M, LI Y L, ZHOU Y L. Determination of myoglobin in chilled beef based on Raman spectroscopy. Food Science, 2018, 39(2): 210-214. (in Chinese)

[18] 馮哲, 陳輝, 郭麗萍, 熊雙麗, 黃業(yè)傳. 高壓結(jié)合熱處理對豬肉肌紅蛋白的影響. 食品工業(yè)科技, 2016, 37(2): 160-164, 175.

FENG Z, CHEN H, GUO L P, XIONG S L, HUANG Y C. Effects of high pressure combined with thermal treatment on myoglobin in pork. Science and Technology of Food Industry, 2016, 37(2): 160-164, 175. (in Chinese)

[19] BENJAKUL S, BAUER F. Biochemical and physicochemical changes in catfish (Linne) muscle as influenced by different freeze–thaw cycles. Food Chemistry, 2001, 72(2): 207-217.

[20] WANG Z M, HE Z F, EMARA A M, GAN X, LI H J. Effects of malondialdehyde as a byproduct of lipid oxidation on protein oxidation in rabbit meat. Food Chemistry, 2019, 288: 405-412.

[21] 馬君燕, 鄭學仿, 郭明, 唐乾, 馬靜, 高大彬, 胡皆漢. 熒光法研究光誘導(dǎo)肌紅蛋白的去氧過程. 中國科學B輯, 2008, 38(1): 55-59.

MA J Y, ZHENG X F, GUO M, TANG Q, MA J, GAO D B, HU J H. Study on photo-induced deoxygenation of myoglobin by fluorescence method. Scientia Sinica Chimica, 2008, 38(1): 55-59. (in Chinese)

[22] ZOU Y, XU P P, WU H H, ZHANG M H, SUN Z L, SUN C, WANG D Y, CAO J X, XU W M. Effects of different ultrasound power on physicochemical property and functional performance of chicken actomyosin. International Journal of Biological Macromolecules, 2018, 113: 640-647.

[23] BANERJEE S, CHAKRABORTI A S. Structural alterations of hemoglobin and myoglobin by glyoxal: A comparative study. International Journal of Biological Macromolecules, 2014, 66: 311-318.

[24] ZHU Z H, WANG Y Q, KANG Y J, ZHANG H M, ZHANG Z M, FEI Z H, CAO J. Graphene oxide destabilizes myoglobin and alters its conformation. Carbon, 2017, 114: 449-456.

[25] XIA M Q, CHEN Y X, GUO J J, FENG X L, YIN X L, WANG L, WU W J, LI Z S, SUN W Q, MA J. Effects of oxidative modification on textural properties and gel structure of pork myofibrillar proteins. Food Research International, 2019, 121: 678-683.

[26] XIA W Y, MA L, CHEN X K, LI X Y, ZHANG Y H. Physicochemical and structural properties of composite gels prepared with myofibrillar protein and lecithin at various ionic strengths. Food Hydrocolloids, 2018, 82: 135-143.

[27] LEDWARD D A. Post-slaughter influences on the formation of metyyoglobin in beef muscles. Meat Science, 1985, 15(3): 149-171.

[28] FAUSTMAN C, SUN Q, MANCINI R, SUMAN S P. Myoglobin and lipid oxidation interactions: Mechanistic bases and control. Meat Science, 2010, 86(1): 86-94.

[29] ESTéVEZ M, CAVA R. Lipid and protein oxidation, release of iron from heme molecule and colour deterioration during refrigerated storage of liver paté. Meat Science, 2004, 68(4): 551-558.

[30] PACE A D, CUPANE A, LEONE M, VITRANO E, CORDONE L. Protein dynamics. Vibrational coupling, spectral broadening mechanisms, and anharmonicity effects in carbonmonoxy heme proteins studied by the temperature dependence of the Soret band lineshape. Biophysical Journal, 1992, 63(2): 475-484.

[31] HERRERO A M. Raman spectroscopy for monitoring protein structure in muscle food systems. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2008, 48(6): 512-523.

[32] ZHANG Z Y, YANG Y L, TANG X Z, CHEN Y J, YOU Y. Chemical forces and water holding capacity study of heat-induced myofibrillar protein gel as affected by high pressure. Food Chemistry, 2015, 188: 111-118.

[33] 王甜甜, 朱逸宸, 謝勇, 周凱, 廖鮮艷, 黃俊逸, 徐寶才. 肌紅蛋白在加工貯藏過程中結(jié)構(gòu)與功能特性的變化及其對肉制品色澤的影響研究進展. 食品科學, 2023, 44(3): 393-399.

WANG T T, ZHU Y C, XIE Y, ZHOU K, LIAO X Y, HUANG J Y, XU B C. Research progress on changes in structure and functional properties of myoglobin during processing and storage and their effect on the quality of meat products. Food Science, 2023, 44(3): 393-399. (in Chinese)

[34] 丁振瑞, 趙亞軍, 陳鳳玲, 陳金忠, 段書興. 磁化水的磁化機理研究. 物理學報, 2011, 60(6): 432-439.

DING Z R, ZHAO Y J, CHEN F L, CHEN J Z, DUAN S X. Magnetization mechanism of magnetized water. Acta Physica Sinica, 2011, 60(6): 432-439. (in Chinese)

[35] 朱元保, 顏流水, 曹祉祥, 文陵飛, 陳宗璋. 磁化水的物理化學性能. 湖南大學學報, 1999, 26(1): 21-25, 32.

ZHU Y B, YAN L S, CAO Z X, WEN L F, CHEN Z Z. Physical and chemical properties of magnetized water. Journal of Hunan University, 1999, 26(1): 21-25, 32. (in Chinese)

[36] 費慶志. 磁化對水性能的影響. 大連鐵道學院學報, 1998(1): 85-89.

FEI Q Z. Influence of water function by magnetizing. Journal of Dalian Railway Institute, 1998(1): 85-89. (in Chinese)

[37] WANG Y K, WEI H N, LI Z W. Effect of magnetic field on the physical properties of water. Results in Physics, 2018, 8: 262-267.

Mechanism of Hydration Environment/Magnetic Field Effects on the Oxidative Stability of Myoglobin

1College of Life Science, Yangzte University, Jingzhou 434020, Hubei;2College of Mechanical Engineering, Yangzte University, Jingzhou 434020, Hubei

【Objective】To investigate the mechanism of action of hydration environment affecting the oxidative stability of myoglobin (Mb) in the presence of a magnetic field, and to provide a basis for improving the oxidative stability of Mb. 【Method】Two magnetic field environments of low intensity (3 mT) and high intensity (12 mT) were set up at 4℃, the magnetic field treated Mb aqueous solution, Mb powder, and deionized water (the magnetic field treated deionized water and then dissolved Mb), respectively, and the magnetic field treatment time was 1 h. The Mb aqueous solution without magnetic field treatment was used as the control. The oxidative stability properties of Mb were analyzed by the relative content of high iron myoglobin, heme iron content and the variation of UV absorption bands, while the changes of Mb secondary structure, tertiary structure and porphyrin iron structure were analyzed by circular dichroism, and Raman spectroscopy and fluorescence spectroscopy techniques were employed to investigate the mechanism of the effect of magnetic field on the oxidative stability of Mb. 【Result】Both magnetic field treatment of Mb powder directly and magnetic field treatment of solvent water followed by dissolution of Mb had no significant effect (＞0.05) on the relative content of methemoglobin, while both 3 mT and 12 mT magnetic field treatment of Mb aqueous solution significantly increased the relative content of methemoglobin. The results of heme iron content and heme Shore band UV absorption showed that the heme porphyrin ring structure was sensitive to the magnetic field environment, and the magnetic field of different intensities had significant damage to the Mb heme structure, while the high intensity magnetic field environment had relatively greater damage to the porphyrin ring structure. Mb tertiary and secondary structure results showed that both 3 mT magnetic field treatment of solvent water before dissolving Mb, and 3 mT and 12 mT magnetic field treatment of Mb aqueous solution significantly promoted the unfolding of Mb secondary structure and oxidative damage of tryptophan and tyrosine residues of side chain groups. Raman spectroscopy results showed that 12 mT magnetic field treatment of Mb aqueous solution induced the cross-linking of Mb through disulfide bonds. 【Conclusion】Hydration in Mb aqueous solution directly affected the effect of magnetic field on the oxidative properties of myoglobin, and magnetic field treatment promoted the oxidation of Mb central iron as well as heme porphyrin ring, probably because the magnetic field changes the physical properties of water molecules, such as dielectricity and degree of ionization, as well as the hydrogen bonding state between Mb and water, which further affected the structure of Mb with the unfolding of-helix structure and the exposure of side chain groups, accelerating the destruction of heme structure and loss of heme iron, and promoting the oxidation of central iron.

myoglobin; magnetic field; hydrated environment; oxidation; porphyrin

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.22.013

2023-04-25；

2023-07-03

國家自然科學基金（31771993）

鄧雨詩，E-mail：1796337434@qq.com。夏民權(quán)，E-mail：13339732276@163.com。鄧雨詩和夏民權(quán)為同等貢獻作者。通信作者孫衛(wèi)青，E-mail：sunweiqing@yangtzeu.edu.cn

（責任編輯 趙伶俐）