王晉,高飛,江燕,方巧飛,余海霞,張小軍,4

1(浙江海洋大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江 舟山,316022)2(浙江融創(chuàng)食品工業(yè)有限公司,浙江 舟山,316100) 3(浙江大學(xué)舟山海洋研究中心,浙江 舟山,316021)4(浙江省海洋水產(chǎn)研究所,浙江 舟山,316021)

金槍魚(yú)肌肉蛋白質(zhì)含量高且氨基酸種類豐富,是一種優(yōu)質(zhì)蛋白資源[1]。但是金槍魚(yú)蛋白溶解性較差,乳糜液體系不穩(wěn)定,蛋白變性后其功能特性會(huì)隨著熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性的降低而降低,出現(xiàn)油水分離、蛋白沉淀、肉質(zhì)粗糙等現(xiàn)象,使其在食品加工業(yè)的應(yīng)用受到限制[2]。因此要大力開(kāi)發(fā)具有優(yōu)良特性的蛋白質(zhì)資源,添加混合物對(duì)現(xiàn)有的蛋白質(zhì)進(jìn)行改造[3]。隨著營(yíng)養(yǎng)健康需求的不斷增長(zhǎng),雙蛋白乳糜液體系由于卓越的營(yíng)養(yǎng)和功能特性而備受關(guān)注,有研究表明將動(dòng)植物蛋白混合能夠改善單個(gè)蛋白的特性并幫助解決環(huán)境和資源稀缺問(wèn)題,在大多數(shù)情況下,雙蛋白乳糜液體系在食品工業(yè)的應(yīng)用過(guò)程中表現(xiàn)出出色的凝膠性、成膜性和其他表面功能特性[4]。

大豆蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,具有良好的乳化性,廣泛應(yīng)用于嬰幼兒配方食品中,且有研究表明在肉制品中適量添加大豆蛋白可以增加肉品穩(wěn)定性和持水性,增強(qiáng)口感[4-6]。乳清蛋白屬于全價(jià)蛋白,必需氨基酸含量明顯高于普通的食用蛋白,易被人體吸收[7-8]。在食品生產(chǎn)中將乳清蛋白代替部分水產(chǎn)蛋白,與植物蛋白搭配形成的共混體系,在降低生產(chǎn)成本的同時(shí)可以更好地起到乳化的效果,提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性[9-10]。任廣旭等[11]研究發(fā)現(xiàn)由乳清蛋白和大豆蛋白組成的雙蛋白體系具有優(yōu)良的消化特性,能維持血液中必需氨基酸的持續(xù)性供給,從而促進(jìn)肌肉蛋白的合成。此外,為使制品獲得良好的乳化性能和細(xì)膩口感,添加適量的油脂能夠促使混合蛋白與脂質(zhì)相互作用形成蛋白-脂質(zhì)復(fù)合物,從而明顯改善制品的乳化性,獲得較好口感[12-14]?？傮w而言,動(dòng)植物蛋白-油脂混合體系具有較為全面的營(yíng)養(yǎng)和功能特性,為開(kāi)發(fā)新型營(yíng)養(yǎng)功能性食品提供了一種有廣泛應(yīng)用前景的方法。

本研究選取油脂、大豆蛋白和乳清蛋白作為混合蛋白體系的關(guān)鍵影響因素,在單因素的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以大豆蛋白、乳清蛋白、油脂含量為自變量,以金槍魚(yú)混合蛋白乳糜液的乳化特性為響應(yīng)值,使用Design-Expert 13軟件對(duì)蛋白體系的乳化性和乳化穩(wěn)定性進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn),根據(jù)分析優(yōu)化獲得最佳的金槍魚(yú)-植物蛋白濃度,建立穩(wěn)定的金槍魚(yú)-植物蛋白乳糜體系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金槍魚(yú)柳,浙江融創(chuàng)食品工業(yè)有限公司;葵花油,益海嘉里金龍魚(yú)糧油食品股份有限公司;大豆蛋白,山東嘉華保健品股份有限公司;乳清蛋白,潤(rùn)嘉生物科技有限公司;十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS),北京索萊寶有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JYL-C16V料理機(jī),九陽(yáng)股份有限公司;XHF-DY高速分散器,寧波新芝生物股份有限公司;高速冷凍離心機(jī),賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限公司;SQP電子天平秤,賽多利斯科技儀器有限公司;VORTEX-5旋渦混合器,海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司;ColorFlex EZ 45/0 Hunterlab色度計(jì),德國(guó)HunterLab公司;Zetasizer NanoZS90粒徑電位儀,英國(guó)馬爾文儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 復(fù)合蛋白乳糜液的制備

選取金槍魚(yú)靠近背鰭的中段魚(yú)肉,手動(dòng)去除皮膚、骨骼和暗色肌肉,并將背部的白色肉切成小塊(邊長(zhǎng)約1 cm的立方體),然后將魚(yú)塊和冰水以料液比1∶9(g∶mL)漂洗2次,每次漂洗10 min,然后用濾網(wǎng)去除多余的水分。將300 g沖洗過(guò)的魚(yú)肉與200 g純凈水充分混合并用料理機(jī)在250 W下強(qiáng)力粉碎5 min得到魚(yú)肉漿。將不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的油脂(5%、10%、15%、20%、25%)、大豆蛋白(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)、乳清蛋白(1%、2%、3%、4%、5%)加入金槍魚(yú)分散液中,使用高速均質(zhì)機(jī)以7 000 r/min的轉(zhuǎn)速分別在4 ℃條件下均質(zhì),樣液循環(huán)均質(zhì)3次,制備出乳糜液,4 ℃下貯藏備用。

1.3.2 持水力的測(cè)定

參照BUAMARD等[15]的方法測(cè)定持水力,并做適當(dāng)修改。將5 g(X)的金槍魚(yú)混合蛋白乳糜液與25 mL (V1) 的超純水在50 mL塑料離心管中混合。渦旋振蕩后以5 000 r/min離心10 min。通過(guò)帶有單層濾紙的布氏漏斗收集上層中過(guò)量的水(V2),重復(fù)測(cè)定3次,并使用公式(1)計(jì)算:

(1)

式中:X為金槍魚(yú)乳糜液的質(zhì)量;V1和V2分別代表加入金槍魚(yú)乳糜液體系中水的體積和金槍乳糜液離心之后釋放的水的體積;持水力為每克金槍魚(yú)乳糜液保留水的體積。

1.3.3 白度的測(cè)定

將金槍魚(yú)乳糜液倒入透明培養(yǎng)皿中,以黑色杯子為背景。用色差計(jì)在室溫下3次重復(fù)測(cè)量樣品的白度值。白度按公式(2)計(jì)算:

(2)

式中:W為白度值;L*表示明度;a*和b*表示色度,且a*正值表示偏紅,負(fù)值表示偏綠;b*正值表示偏黃,負(fù)值表示偏藍(lán)。

1.3.4 粒徑的測(cè)定

采用THAGELE等[16]的方法對(duì)乳糜液粒徑進(jìn)行測(cè)定。將10 g金槍魚(yú)乳糜液置于50 mL離心管中,蓋好蓋子在90 ℃水浴中加熱20 min。用粒徑電位儀測(cè)定蒸煮液的粒徑。設(shè)定樣品折射率為1.42,分散介質(zhì)折射率為1.33。

1.3.5 乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

參照LI等[17]的方法測(cè)定其乳化性和乳化活性,從金槍魚(yú)乳糜液底部吸取50 μL乳糜液,與5 mL的0.1 g/mL SDS溶液混合,用可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定吸光度。乳糜液乳化性(emulsifying activity index,EAI)、乳化穩(wěn)定性(emulsifying stability index,ESI)的計(jì)算分別如公式(3)、公式(4)所示:

(3)

(4)

式中:A0,勻漿后的吸光度;N為稀釋因子,100;C為樣品的質(zhì)量濃度,g/mL;F為原油乳狀液的體積分?jǐn)?shù)(25%);A0,0 min時(shí)所測(cè)吸光值;A10,10 min時(shí)所測(cè)吸光值。

1.3.6 乳糜液穩(wěn)定性優(yōu)化設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素比較試驗(yàn)結(jié)果,依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,考察3因素之間的交互作用并結(jié)合實(shí)際考慮。以乳化活性和乳化穩(wěn)定性為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)3因素3水平的試驗(yàn)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface method experiment

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果每組重復(fù)3次,數(shù)據(jù)采用Excel 2017、Origin 2018和IBM SPSS Statistics 22.0進(jìn)行圖像繪制及處理,采用Design Expert 13.0軟件對(duì)響應(yīng)面數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白和油脂添加量對(duì)乳糜液白度和持水力的影響

持水力的大小反映出蛋白質(zhì)分子之間的相互作用和結(jié)構(gòu)狀態(tài),會(huì)影響產(chǎn)品的組織狀態(tài)、口感以及穩(wěn)定性[18-19]。白度的變化一定程度上反映了物質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化[20-21]。由表2可知,隨著油脂和蛋白添加量的增加,亮度(L*)、紅色(a*)和黃色(b*)逐漸增加,金槍魚(yú)乳糜的白度從54.49連續(xù)增加到72.77,可能是親水基團(tuán)的暴露使大豆蛋白和乳清蛋白的顏色中和掉部分暗灰色金槍魚(yú)乳液,動(dòng)植物蛋白溶解在一起形成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)作為乳化劑對(duì)油脂進(jìn)行乳化,增加了乳液的白度[22-23]。隨著油脂和蛋白添加量的增加,持水力均呈先增大后減小的趨勢(shì),低于20%的油脂添加量可增加乳糜液的保水能力,大豆蛋白的添加量為1.5%左右時(shí)持水力達(dá)到最大值,為0.49 mL/g,乳清蛋白的添加量為3%左右時(shí)持水力達(dá)到最大值,為0.52 mL/g,表明適當(dāng)?shù)氖杷鶊F(tuán)暴露有利于蛋白質(zhì)重新聚集,形成孔隙均勻的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),具有較好持水力。但過(guò)量添加則作用相反,可能是由于過(guò)多的油脂會(huì)使乳糜液體系過(guò)稀,肌原纖維蛋白分子過(guò)度展開(kāi)而難以再形成致密凝膠網(wǎng)絡(luò),不利于水分子包埋于凝膠網(wǎng)絡(luò),從而降低持水力[24]。

表2 蛋白和油脂的添加量對(duì)乳糜液白度和持水力的影響Table 2 Effect of protein and oil addition on the whiteness and water retention of chylous fluid

2.2 蛋白和油脂添加量對(duì)乳糜液粒徑的影響

乳糜液屬于熱不穩(wěn)定體系,會(huì)依據(jù)動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性原理以一定速度分離成互不相容的油、水兩相,出現(xiàn)絮凝、聚集、粒徑偏移等現(xiàn)象[25-26],乳狀液粒子越小,乳析速度越慢,乳析率越低,乳液也就越穩(wěn)定[27]。由圖1可知,隨著油脂添加量的增加,乳糜液平均粒徑從5%油脂添加量的531.2 nm逐漸增大到15%油脂添加量的651.2 nm,當(dāng)油脂添加量達(dá)到25%時(shí),平均粒徑達(dá)到了695.01 nm,說(shuō)明蛋白質(zhì)在乳化體系中結(jié)合油的能力有限,過(guò)多的油會(huì)析出,導(dǎo)致體系不穩(wěn)定。隨著大豆蛋白和乳清蛋白添加量的增加,乳糜液的平均粒徑均呈現(xiàn)先增加而減小的趨勢(shì),乳狀液的穩(wěn)定性也明顯改善。HU等[28]在研究蛋白質(zhì)量濃度對(duì)乳糜液穩(wěn)定性的影響中也得到了同樣的結(jié)論。結(jié)合圖2,大豆蛋白和乳清蛋白的添加可以增加乳糜液蛋白濃度,乳糜液粒徑減小,絮凝現(xiàn)象減少,蛋白分子之間結(jié)構(gòu)更加致密均勻。因此,大豆蛋白添加量應(yīng)高于1%,乳清蛋白應(yīng)高于2%,以此來(lái)控制乳糜液平均粒徑在600 nm以下,從而改善產(chǎn)品細(xì)膩度及適口性。

a-油脂;b-大豆蛋白;c-乳清蛋白圖1 蛋白和油脂添加量對(duì)乳糜液粒徑的影響Fig.1 Effect of the addition of different mass fractional proteins and oils on chylac fluid particle size

2.3 蛋白和油脂添加量對(duì)乳糜液乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響

乳化活性一定程度上反映出水油結(jié)合形成乳化液的能力,乳化穩(wěn)定性則反映油水混合乳狀液維持穩(wěn)定的能力,二者受物質(zhì)顆粒大小、加工方式、加工溫度和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度等因素綜合影響[29]。由圖2可知,隨著油脂含量升高,界面面積增大,乳糜液的乳化活性也隨之提高,而乳化穩(wěn)定性減小,可能是由于油含量的增加使乳狀液油滴形成的保護(hù)膜較薄,導(dǎo)致蛋白質(zhì)相互聚集下沉或油滴相互聚集上浮,蛋白在油滴外圍形成的剛性結(jié)構(gòu)強(qiáng)度不大,從而失去穩(wěn)定性。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)狀況考慮到添加過(guò)多的油脂容易析出,且不利于人體健康,因此油脂添加應(yīng)控制在10%左右。大豆蛋白和乳清蛋白的添加可顯著增加乳糜液的乳化活性,說(shuō)明乳糜液凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成以及在界面上的吸附和擴(kuò)散作用增加,促使疏水性基團(tuán)的暴露,蛋白質(zhì)分子彼此靠在一起形成膠束,更迅速地轉(zhuǎn)移至油-水界面,有效降低了表面張力[9,30]。但當(dāng)大豆蛋白濃度繼續(xù)增加至2%、乳清蛋白濃度增加至4%,即達(dá)到膠束臨界濃度后,乳糜液乳化性和乳化穩(wěn)定性趨于平穩(wěn)。

a-油脂;b-大豆蛋白;c-乳清蛋白圖2 蛋白和油脂添加量對(duì)乳糜液乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of the addition of different mass fractional proteins and oils on the emulsification activity and emulsification stability of chylous fluid

2.4 響應(yīng)曲面法優(yōu)化設(shè)計(jì)

依據(jù)表3的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行最小二乘法擬合回歸分析,得到二次多元回歸方程模型為:

Y1=98.75+8.66×A-5.04×B+0.103 8×C-0.392 5×AB+3.01×AC-5.50×BC-5.49×A2-14.46×B2-10.05×C2

Y2=77.33+8.68×A-3.95×B-0.692 5×C-0.742 5×AB+2.77×AC-5.28×BC-5.56×A2-12.31×B2-8.60×C2

方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值Table 3 Program of Box-Behnken experimental design and response value

表4 Y1回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance for regressive equation

由表4可知,該模型P<0.000 1,表明模型極顯著(P<0.01);失擬項(xiàng)P值不顯著,表明建立的模型擬合度較好;方程的校正決定系數(shù)R1Adj=0.980 3,表明約有98.03%的響應(yīng)值變化能由該模型進(jìn)行解釋,實(shí)際實(shí)驗(yàn)與模型建立的方程擬合度較好,能用于分析和預(yù)測(cè)混合蛋白金槍乳糜液的工藝優(yōu)化。結(jié)合圖3可知,對(duì)乳糜液乳化性的影響極顯著(P<0.01)的因素為A、B、BC、A2、B2、C2,其他因素均不顯著。模型的F值越大對(duì)乳濁液乳化活性的影響越大?？梢?jiàn),各因素對(duì)乳糜液乳化活性的影響程度為:A(油脂)>B(大豆蛋白)>C(乳清蛋白)。

圖3 Y1=f(A,B,0);Y1=f(A,C,0);Y1=f(B,C,0)響應(yīng)曲面Fig.3 Response surface of f(A,B,0), f(A,C,0), f(B,C,0)

由表5可知,P<0.000 1,表明模型極顯著(P<0.01);失擬項(xiàng)P值不顯著,表明建立的模型擬合度較好;方程的校正決定系數(shù)R2Adj=0.985 3,表明約有98.53%的響應(yīng)值變化能由該模型進(jìn)行解釋,實(shí)際實(shí)驗(yàn)與模型建立的方程擬合度較好,能用于分析和預(yù)測(cè)混合蛋白金槍乳糜液的工藝優(yōu)化。結(jié)合圖4可知,對(duì)乳糜液乳化穩(wěn)定性的影響極顯著(P<0.01)的因素為A、B、BC、A2、B2、C2,對(duì)乳糜液乳化穩(wěn)定性的影響顯著(P<0.05)的因素為AC,其他因素均不顯著。模型的F值越大對(duì)乳糜液乳化活性的影響越大?？梢?jiàn),各因素對(duì)乳糜液乳化活性的影響程度為:A(油脂)>B(大豆蛋白)>C(乳清蛋白)。

表5 Y2回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance for regressive equation

圖4 Y2=f(A,B,0);Y2=f(A,C,0);Y2=f(B,C,0)響應(yīng)曲面Fig.4 Response surface of f(A,B,0), f(A,C,0), f(B,C,0)

經(jīng)Design-Expert 13軟件分析得出最佳配方為:油脂含量9.41%、大豆蛋白1.47%、乳清蛋白2.99%;相應(yīng)的模型預(yù)測(cè)乳糜液乳化活性為96.10 mL/g,乳化穩(wěn)定性為74.55%。選取最佳配比制備復(fù)合蛋白乳液,測(cè)定其乳化性和乳化穩(wěn)定性。乳液乳化活性為95.34 mL/g,乳化穩(wěn)定性為76.87%。實(shí)際值與預(yù)測(cè)值相近,說(shuō)明該模型能夠較好地預(yù)測(cè)乳液穩(wěn)定性條件。

3 結(jié)論

a)油脂的添加可提高金槍魚(yú)乳糜液的持水力,但過(guò)多的油脂會(huì)使乳糜液體系過(guò)稀,結(jié)果顯示持水力降低,添加量超過(guò)20%后油脂析出,粒徑達(dá)到了695.01 nm,乳化穩(wěn)定性降低。大豆蛋白和乳清蛋白的添加對(duì)金槍魚(yú)乳糜體系乳化作用顯著(P<0.05),適量添加可增加產(chǎn)品白度和持水力,疏水基團(tuán)的暴露有利于蛋白質(zhì)重新聚集,乳糜液粒徑減小,絮凝現(xiàn)象減少,同時(shí)乳糜液界面面積增大,乳化活性上升,乳化穩(wěn)定性趨于平穩(wěn),產(chǎn)品細(xì)膩度及適口性得到改善。

b)以乳糜液乳化活性和乳化穩(wěn)定性為響應(yīng)值,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)曲面分析法對(duì)復(fù)合蛋白金槍魚(yú)乳糜液進(jìn)行優(yōu)化,建立的二次回歸方程高度顯著,模型擬合度好。根據(jù)模型及響應(yīng)面分析,進(jìn)行修正后確定較理想乳化劑的復(fù)配條件為:油脂含量9.41%、大豆蛋白含量1.47%、乳清蛋白含量2.99%,此時(shí)的乳化活性為96.10 mL/g,乳化穩(wěn)定性為74.55%,乳糜液產(chǎn)品穩(wěn)定性好,不易析出。