沈瑜琦,陳 帥,李維波,牛 然,邵登科,張春源,賴澤成,葉文雨

(1.國家菌草工程技術(shù)研究中心,福建 福州 350002;2.植物與微生物相互作用福建省高校重點實驗室,福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002;3.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護學(xué)院,福建 福州 350002)

麥冬(Ophiopogonjaponicus)是一種常綠草本,是中醫(yī)處方中的常見藥材。麥冬的野生資源較為豐富,且由于市場需求量較大,人工種植面積在不斷地擴大中。藥用麥冬種植范圍相當(dāng)廣泛,主產(chǎn)于浙江、四川等地[1-2]。麥冬大都生長于海拔2 000 m以下的山坡較為陰暗潮濕處、靠近水源處或林下[3]。因藥用麥冬具有一定的醫(yī)療價值,所以其內(nèi)生菌產(chǎn)生的抗藥活性可能高于普通植物[4],具有較高的研究價值。麥冬味甘、微苦性微寒,其入藥部位主要為果實和小塊根,具有調(diào)節(jié)心律、調(diào)節(jié)體內(nèi)微循環(huán)、滋陰潤肺等功效[5]。

內(nèi)生菌指能于植物各組織內(nèi)正常生長,但不引起該植物產(chǎn)生病征的一類微生物[6]。一些內(nèi)生細(xì)菌為提高宿主對環(huán)境的適應(yīng)能力,利用自身擁有某些機制來實現(xiàn)此目的[7]。研究顯示,許多藥用植物的有效成分受到內(nèi)生菌的影響[8-12]。從植物組織器官中分離出來的內(nèi)生菌,經(jīng)過篩選后,部分能產(chǎn)生與植物相似或相同的有效成分,通過培養(yǎng)這些藥用植物內(nèi)生菌可以突破藥用植物本身生長的限制[13],對藥材的品質(zhì)和質(zhì)量都能有進一步的改善。

本研究以麥冬為材料,分離和純化得到其內(nèi)生細(xì)菌,通過形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)方法鑒定所得菌株,進一步研究菌株的生理生化特性,以期為藥用植物內(nèi)生細(xì)菌的功能菌株的篩選和開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株來源

本試驗所用麥冬植株采自福建省三明市福建盤古中藥材有限公司,采集樣品為健康生長的植株,采樣方法為五點采樣法,采集后放置于4 ℃冰箱備用。

圖1 麥冬采樣圖Fig.1 Ophiopogon japonicus sampling illustration

1.1.2 培養(yǎng)基配方

LB固體培養(yǎng)基,LB液體培養(yǎng)基,淀粉牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基,均采用《微生物學(xué)實驗技術(shù)》中的配制方法[14]。

1.1.3 PCR引物

本試驗所用PCR引物購自北京擎科生物科技股份有限公司,細(xì)菌通用引物27F為擴增麥冬內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA片段序列的上游引物,1492R為下游引物(表1)。

表1 PCR引物Table.1 PCR primer

表2 PCR反應(yīng)體系Table.2 PCR reaction system

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離與純化

將新鮮的麥冬葉片用清水沖洗直至表面無泥沙塵土附著,用濾紙吸干麥冬葉片表面水分。將麥冬葉片浸泡于75%乙醇中5 min后用無菌水沖洗3遍及以上,用2%次氯酸鈉溶液浸泡2 min,后用蒸餾水沖洗5～7遍。將表面消毒好的麥冬葉片在研缽內(nèi)充分研磨,取葉片組織研磨液適量涂布至LB培養(yǎng)基上,28 ℃恒溫培養(yǎng)12 h,待培養(yǎng)基平板內(nèi)細(xì)菌長出后,依據(jù)培養(yǎng)基平板內(nèi)各菌落的形態(tài)、顏色、大小等外觀差異,挑取外觀不同的單菌落進行3 次平板劃線,經(jīng)過純化后對菌株進行編號保存。

1.2.2 菌株的形態(tài)特征

將LB固體培養(yǎng)基倒平板后,劃線,放置于37 ℃培養(yǎng)24 h,觀察菌落形態(tài)特征。

1.2.3 分子鑒定

挑單菌落進行菌株的活化,利用上述表1引物,以菌液為模板利用16S rRNA基因序列進行PCR擴增。

25 μL反應(yīng)體系如下:

PCR反應(yīng)條件:

94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 變性 30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min 30 s,共設(shè)35 個循環(huán);72 ℃延伸 7 min 。PCR產(chǎn)物通過北京擎科生物科技股份有限公司進行測序。將所得序列在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST序列對比,使用Mega 11軟件采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,確定細(xì)菌種屬。

1.2.4 過氧化氫酶試驗

挑取預(yù)先培養(yǎng)在LB固體培養(yǎng)基上細(xì)菌的單菌落,將其輕輕涂抹在干凈的載玻片上,一個載玻片上涂上下兩處,相互之間留出一定間距,將其中一組設(shè)置為對照組。滴加3%過氧化氫溶液3 mL,觀察反應(yīng)現(xiàn)象。

1.2.5 淀粉水解試驗

將含淀粉的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基滅菌后融化并冷卻至50～60 ℃,而后在超凈臺中倒板,靜置,按無菌操作法將接種針燒紅3遍,冷卻。將預(yù)先培養(yǎng)好的生長在固體培養(yǎng)基上的菌落中挑取單菌落至平板,每個菌株接種兩板,一板為對照,每板接種三個單菌落,等距排布,做好標(biāo)記,在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d。待形成菌落后,在平板上滴加碘液4～5滴,可輕微旋轉(zhuǎn)使碘液鋪滿全皿,觀察結(jié)果,并拍照。

1.2.6 甲基紅試驗

取滅菌后的葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液分裝至已提前滅過菌的干燥試管中,每管5 mL,將已培養(yǎng)好的菌株挑取單菌落至試管中,做好標(biāo)記,于37 ℃搖床內(nèi)培養(yǎng)1 d。在培養(yǎng)好的裝有菌液的試管內(nèi)滴加各甲基紅試劑3～4滴,充分搖勻,觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

MD1 菌落邊緣較為整齊,淡黃色,表面光滑,不透明,單菌落小而凸起,圓形,較為粘稠濕潤,易被挑起(圖2A)。

圖2 細(xì)菌菌落的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of bacterial colonies

MD2菌落邊緣也較為整齊,白色,表面光滑,不透明,單菌落小而凸起,圓形,較為粘稠濕潤,易被挑起(圖2B)。

2.2 菌株的分子鑒定

將兩株菌株DNA擴增后得到PCR產(chǎn)物,結(jié)果得到大小在1 500 bp 左右的片段。

將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST序列比對,利用Mega 11軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果顯示,菌株MD1與路德維希腸桿菌(Enterobacterludwigii)聚在同一分支,相似性達到100%,可初步判斷該MD1菌株為路德維希腸桿菌(Enterobacterludwigii)(圖3A);菌株MD2與節(jié)桿菌(Arthrobacterwoluwensis)聚在同一分支,相似性達到98%,可初步判斷該MD2菌株為節(jié)桿菌(Arthrobacterwoluwensis)(圖3B)。

圖3 基于16S rRNA序列構(gòu)建MD1、MD2的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree construction of MD1 and MD2 based on 16SrRNA sequences

2.3 菌株的生理生化特性鑒定

2.3.1 淀粉酶水解試驗

將 MD1、MD2 菌株分別點種于淀粉水解培養(yǎng)基上培養(yǎng),一個皿等距點種三個。結(jié)果表明,兩株菌株都產(chǎn)生了水解圈,在淀粉水解酶試驗中均為陽性,兩菌株都能產(chǎn)生胞外淀粉酶。淀粉遇碘變藍色,若菌株周圍出現(xiàn)透明的水解圈,則說明該菌株無法直接利用大分子的淀粉,需要分泌胞外淀粉酶來分解淀粉為葡萄糖或麥芽糖,再被細(xì)菌吸收利用,這就使得碘液無法與淀粉反應(yīng)變藍,從而產(chǎn)生透明的水解圈(圖4A)。

圖4 菌株MD1和MD2的部分生理生化特性Fig.4 Selected physiological and biochemical properties of strains MD1 and MD2

2.3.2 甲基紅試驗

菌株MD1、MD2在甲基紅試驗中,MD1顏色為紅色,結(jié)果為陽性,MD2顏色呈黃色,結(jié)果為陰性。MD1菌株使甲基紅試液變紅,說明該菌株分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸后,可以使丙酮酸分解產(chǎn)生大量酸性物質(zhì),溶液pH降低,甲基紅指示劑遇酸變紅;而MD2 菌株所在的試驗組,試液為黃色,說明該菌株產(chǎn)生丙酮酸后很快將丙酮酸脫羧成醇等物質(zhì),溶液pH仍在6.2以上,甲基紅指示劑呈黃色(圖4B)。

2.3.3 過氧化氫酶試驗

菌株 MD1、MD2在過氧化氫酶試驗中,MD1、MD2菌株肉眼都能觀察到產(chǎn)生大量氣泡,為陽性。在該試驗中,兩組試驗組肉眼能夠觀察到大量氣泡,說明該菌株含有過氧化氫酶,過氧化氫酶是一類含有鐵的蛋白,能夠催化過氧化氫產(chǎn)生大量氧氣,在此過程中起到傳遞電子的作用。(圖4C)。

3 結(jié)論與討論

本試驗從麥冬葉片中分離了兩株內(nèi)生細(xì)菌,編號為MD1和MD2,經(jīng)過形態(tài)觀察、分子生物學(xué)鑒定以及生理生化試驗,最終確定MD1菌株是路德維希腸桿菌(Enterobacterludwigii),淀粉水解試驗、甲基紅試驗和過氧化氫酶試驗均為陽性;MD2菌株是節(jié)桿菌(Arthrobacterwoluwensis),淀粉水解試驗和過氧化氫酶試驗均為陽性,而甲基紅試驗為陰性。本結(jié)果為麥冬內(nèi)生細(xì)菌的功能菌株的篩選和多樣性研究提供理論基礎(chǔ)。

植物內(nèi)生菌的發(fā)現(xiàn)歷史可以回溯到100 多年前,因其自身特性而不被人們重視,一直到二十世紀(jì)三十年代,牲畜中毒后,研究發(fā)現(xiàn)因為食用感染內(nèi)生菌的牧草,才真正引起人們重視。近20 年來,內(nèi)生細(xì)菌受到了廣大學(xué)者的高度關(guān)注[15-17]。研究發(fā)現(xiàn),它們與植物的關(guān)系有三種:一是中性,對植物生長無影響;二是有益,能促進植物生長或者抑制病原物侵染;三是有害,在一定條件下能引起植物病害[18,19]。

植物內(nèi)生細(xì)菌通過與寄主植物的相互影響,相互促進,協(xié)同生長,是一種寶貴的資源[20],因而在植物體內(nèi)分離出的內(nèi)生菌可能在其他領(lǐng)域發(fā)揮作用,如植物病蟲害的防治,促進植物生長[21]。從藥用植物分離發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生菌的次生代謝產(chǎn)物很可能是抗癌、抗炎等新型活化物質(zhì)的來源[22],但內(nèi)生菌的分離受到時間空間等條件上的限制[23],在操作時需選擇最佳條件進行研究。

Hoffmann等[24]于2002年首次發(fā)現(xiàn)路德維希腸桿菌(Enterobacterludwigii)并報道。近年對該細(xì)菌在其他領(lǐng)域的報道漸漸增加,路德維希腸桿菌(Enterobacterludwigii)除一開始在人類病原菌中發(fā)現(xiàn)外,在發(fā)酵蔬菜、植物根際土、根結(jié)節(jié)和石油管道的微生物群落等地都有分離得到[25]。其作用亦具有多樣性,如產(chǎn)胞外多糖[26]、生物控制能力以及烴降解能力[27]等。但目前國內(nèi)對路德維希腸桿菌的研究較少,主要集中于該菌在特定環(huán)境污染的修復(fù)[28]。在植物促生方面,路德維希腸桿菌(Enterobacterludwigii)被發(fā)現(xiàn)在海雀稗、番茄和達烏里胡枝子中均能促進植物根系生長,其中在達烏里胡枝子體內(nèi)分離出的菌株能夠促進植物有更好的耐鹽堿特性[29],因而在后續(xù)研究中,可以增加對該菌株其他方向的研究。

節(jié)桿菌是水體和土壤中的優(yōu)勢細(xì)菌,近年來對其在環(huán)境污染物降解的研究較多[30,31],例如節(jié)桿菌屬細(xì)菌能夠降解多環(huán)芳烴、N-雜環(huán)化合物等環(huán)境有機污染物。關(guān)于其固氮能力和對植物的促生能力也在進一步研究中[32]。節(jié)桿菌大都為非致病性菌株,因而對其致病機理的研究較少,但由于分布的廣泛性,可能存在的致病性、治病機理和耐藥性都應(yīng)引起重視[33]。此外,節(jié)桿菌因分布廣泛,能在多種環(huán)境下生存,對其進行多基因組水平的解析,能夠從另一個角度了解其在環(huán)境污染改善方面的潛力[34]。因此,可以利用節(jié)桿菌對土壤的修復(fù)作用制作生物肥料。