張鵬濤,竹瑋,2,胡延如,戚元成,申進(jìn)文,文晴,王風(fēng)芹

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南 鄭州 450046; 2.信陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,河南 信陽 464000)

氮是生物體生長發(fā)育重要的必需營養(yǎng)元素之一[1]。氮含量對食用菌菌絲生長、原基分化和子實(shí)體形成具有重要影響,不同食用菌對培養(yǎng)料中氮含量要求不同。廣葉繡球菌在培養(yǎng)料碳氮比值為39.2∶1～80.8∶1時(shí),菌絲生長速率無顯著差異,在碳氮比值為48.8∶1～55.9∶1時(shí),生物學(xué)效率最高[2];秀珍菇在培養(yǎng)料碳氮比值為67∶1～69∶1時(shí),菌絲生長最好,在碳氮比值為69∶1時(shí),生物學(xué)效率最高[3];猴頭菇在培養(yǎng)料碳氮比值為38∶1時(shí),生長最快,長勢最好,子實(shí)體生物學(xué)效率最高[4];斑玉蕈在培養(yǎng)料碳氮比值為33∶1時(shí),生物學(xué)效率最高[5]。杏鮑菇菌絲生長速率與培養(yǎng)料的碳氮比值呈負(fù)相關(guān)[6],而灰樹花、金針菇、姬松茸的菌絲生長速率都與培養(yǎng)料碳氮比值呈正相關(guān)[7-9]。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

糙皮側(cè)耳(Pleurotusostreatus)新831菌株由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用真菌研究室保存并提供。

1.2 供試原料

棉籽殼(碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)39.81%、氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.45%、碳氮比值為27.5∶1)購自虞城縣潤達(dá)棉業(yè)有限公司;麥麩(碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)40.80%、氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.25%、碳氮比值為12.6∶1)購自許昌盛沃糧油有限公司;尿素(分析純)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;石灰和輕質(zhì)碳酸鈣均購自三門峽市三山石膏粉廠。

1.3 栽培試驗(yàn)

培養(yǎng)料配方來自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用真菌研究室,以棉籽殼作為主料,尿素和麥麩作為氮源,共16種(配方1-1～1-8,配方2-1～2-8),其中以不加尿素(配方1-1)和不加麥麩(配方2-1)為對照組,具體見表1。根據(jù)配方準(zhǔn)確稱取栽培原料并混合攪拌均勻,然后加水?dāng)嚢?調(diào)整培養(yǎng)料含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)65%。培養(yǎng)料拌勻后裝入22 cm×36 cm×0.004 cm的聚乙烯折角袋,用塑料套環(huán)封口,每袋裝濕料1.75 kg,100 ℃常壓滅菌16 h。當(dāng)料袋溫度降至30 ℃以下時(shí),無菌接入糙皮側(cè)耳固體菌種,保證接種量一致(200 g),套環(huán)封口。料袋接種后搬入同一培養(yǎng)室發(fā)菌。保持發(fā)菌環(huán)境清潔衛(wèi)生,控制環(huán)境溫度22 ℃,在氧氣充足、黑暗且干燥條件下培養(yǎng)。觀察糙皮側(cè)耳菌絲長勢,測定菌絲生長長度,計(jì)算菌絲生長速率。每個(gè)配方200袋,設(shè)置3次重復(fù)。

表1 培養(yǎng)料配方Table 1 Culture substrates formulas g·kg-1

菌絲滿袋后搬入出菇車間出菇。子實(shí)體生長期間,控制溫度15 ℃、空氣相對濕度90%及二氧化碳體積分?jǐn)?shù)在0.1%以下,給予100 lx散射光使糙皮側(cè)耳子實(shí)體正常生長。糙皮側(cè)耳子實(shí)體八分成熟(即菌蓋邊緣基本平展)時(shí)及時(shí)采收。記錄出菇時(shí)間、子實(shí)體質(zhì)量等指標(biāo)。每潮菇采收后,停水養(yǎng)菌7 d,然后按照上述方法重復(fù)進(jìn)行出菇管理。對三潮菇進(jìn)行采收。

1.4 培養(yǎng)料碳、氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

每個(gè)處理隨機(jī)選取3個(gè)滅菌后的栽培袋,將培養(yǎng)料揉碎混勻,然后稱取200 g于65 ℃烘干至恒質(zhì)量。參考申進(jìn)文等[13]所述方法測定培養(yǎng)料中碳、氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.5 糙皮側(cè)耳菌絲生長和生物學(xué)效率測定

糙皮側(cè)耳菌絲長勢、菌絲生長速率和一、二、三潮菇子實(shí)體生物學(xué)效率及子實(shí)體總生物學(xué)效率的測定和計(jì)算參考申進(jìn)文等[13]所述方法。

1.6 子實(shí)體營養(yǎng)成分測定

取不同處理的第一潮子實(shí)體500 g,烘干至恒質(zhì)量。參考申進(jìn)文等[13]所述方法測定子實(shí)體蛋白質(zhì)、總糖、粗脂肪和粗纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)等指標(biāo),每個(gè)處理5次重復(fù)。

1.7 培養(yǎng)料中含量測定

1.8 培養(yǎng)料中基質(zhì)降解酶活性測定

1.8.1 粗酶液制備 按照1.7的方法取發(fā)菌培養(yǎng)料5.0 g于25 mL磷酸緩沖鹽(phosphate buffered saline,PBS)溶液中,220 r·min-1、4 ℃水浴搖床低溫提取4 h后在8 000×g、4 ℃條件下離心10 min,取上清液即得胞外酶粗酶液,-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｃ看螠y定3袋,每袋取3個(gè)樣。

1.8.2 漆酶活力測定 參考郭艷艷等[15]所述方法測定粗酶液中的漆酶活性。漆酶酶活力單位(U)定義:1 min內(nèi)催化2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)生成1 mmol ABTS自由基的酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.8.3 羧甲基纖維素酶活力測定 參考孫淑靜等[16]所述方法測定粗酶液中羧基甲基纖維素酶的酶活。羧甲基纖維素酶活力單位(U)定義:在溫度50 ℃反應(yīng)條件下,1 min催化生成1 mg葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.8.4 木聚糖酶活力測定 參考孫淑靜等[16]所述方法測定粗酶液中的木聚糖酶活力。木聚糖酶活力單位(U)定義:在50 ℃反應(yīng)條件下,1 min時(shí)間催化生成1 mg木糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。

1.8.5 蛋白酶活力測定 參考李治平等[17]所述方法測定粗酶液中的蛋白酶活力。蛋白酶活力單位(U)定義:在37 ℃反應(yīng)條件下,10 min催化生成1 mg酪氨酸所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。方差分析采用最小顯著性差異法,p<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同配方對培養(yǎng)料碳、氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)及碳氮比值的影響

對各配方培養(yǎng)料的碳、氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行了測定,計(jì)算出碳氮比值,結(jié)果見表2和表3。在研究設(shè)定的培養(yǎng)基配方范圍內(nèi),隨著尿素和麥麩添加量的增加,各處理培養(yǎng)料碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒有顯著差異,而氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸升高,碳氮比值逐漸降低。當(dāng)尿素添加量為0～13 g·kg-1,此時(shí)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.32%～1.74%,碳氮比值為21.7∶1～28.9∶1;當(dāng)麥麩添加量為0～400 g·kg-1,此時(shí)培養(yǎng)料的氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.31%～2.01%,碳氮比值為19.4∶1～28.9∶1。

表2 尿素添加量對培養(yǎng)料的碳、氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)及碳氮比值的影響Table 2 Effects of urea contents on the carbon and nitrogen mass concentration and C/N ratio in culture substrates

表3 麥麩添加量對培養(yǎng)料的碳、氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)及碳氮比值的影響Table 3 Effects of wheat bran contents on the carbonand nitrogen mass concentration and C/N ratio in culture substrates

2.2 尿素和麥麩添加量對糙皮側(cè)耳菌絲生長和子實(shí)體生物學(xué)效率的影響

在設(shè)定培養(yǎng)基配方范圍內(nèi),隨著尿素和麥麩添加量增加,糙皮側(cè)耳菌絲長勢更加旺盛,菌絲潔白、濃密、粗壯,但是菌絲生長速率逐漸降低,滿袋時(shí)間逐漸延長。與對照組相比,添加13 g·kg-1尿素或400 g·kg-1麥麩試驗(yàn)組的菌絲生長速率分別降低42.3%和27.1%(圖1)。糙皮側(cè)耳一、二、三潮子實(shí)體生物學(xué)效率均隨培養(yǎng)料中尿素和麥麩添加量的增加呈先升高后降低的趨勢。其中,第一潮子實(shí)體生物學(xué)效率為48.0%～61.8%。當(dāng)添加5 g·kg-1尿素或300 g·kg-1麥麩時(shí),糙皮側(cè)耳子實(shí)體總生物學(xué)效率最高,分別為118.1%和122.9%,較對照組分別提高26.2%和31.3%(圖2),此時(shí)培養(yǎng)料的氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.52%和1.86%,碳氮比值分別為25.0%和20.8%(表2和表3)。當(dāng)尿素添加量高于9 g·kg-1時(shí),各試驗(yàn)組第三潮均未出菇,子實(shí)體總生物學(xué)效率較對照組顯著降低。其中,尿素添加量為13 g·kg-1處理組的子實(shí)體總生物學(xué)效率僅為對照的44.9%,而在設(shè)定培養(yǎng)基配方范圍內(nèi)添加麥麩均能夠提高子實(shí)體總生物學(xué)效率。后續(xù)對子實(shí)體總生物學(xué)效率最高的處理組即尿素添加量5g·kg-1和麩皮添加量300 g·kg-1進(jìn)行重點(diǎn)對比研究。

A:尿素;B:麥麩。++++:菌絲長勢最強(qiáng);+++:菌絲長勢較強(qiáng);++:菌絲長勢一般;+:菌絲長勢較弱。不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。A: Urea; B: Wheat bran. ++++: Luxuriant; +++: Strong; ++: Fair; +: Weak. Different lowercase letters indicate significant difference at p<0.05. The same as below.

圖2 培養(yǎng)料中尿素和麥麩添加量對糙皮側(cè)耳子實(shí)體生物學(xué)效率的影響Fig.2 Effects of urea and wheat bran content in culture substrates on fruiting body biological efficiency of Pleurotus ostreatus

2.3 尿素和麥麩添加量對糙皮側(cè)耳子實(shí)體營養(yǎng)成分的影響

在設(shè)定培養(yǎng)基配方范圍內(nèi),考察尿素和麥麩對糙皮側(cè)耳子實(shí)體營養(yǎng)成分的影響。隨著尿素和麥麩添加量的升高,糙皮側(cè)耳子實(shí)體的總氨基酸和粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈上升趨勢,總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降趨勢,脂肪和粗纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不顯著(表4和表5)。與對照組相比,添加5 g·kg-1尿素(即生物學(xué)效率最高組)的總氨基酸和粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別較對照提高17.7%和11.9%,總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不顯著。添加300 g·kg-1麥麩(即生物學(xué)效率最高組)的總氨基酸和粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別較對照提高39.8%和34.6%,而總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低23.2%。添加300 g·kg-1麥麩與添加5 g·kg-1尿素相比,子實(shí)體總氨基酸和粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別提高25.6%和29.4%,總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低20.0%。

表4 培養(yǎng)料中尿素添加量對糙皮側(cè)耳子實(shí)體營養(yǎng)成分的影響Table 4 Effect of urea content in culture substrates on nutrient composition (mass concentration) of Pleurotus ostreatus fruiting body %

表5 培養(yǎng)料中麥麩添加量對糙皮側(cè)耳子實(shí)體營養(yǎng)成分的影響Table 5 Effect of wheat bran content in culture substrates on nutrient composition (mass concentration) ofPleurotus ostreatus fruiting body %

2.4 尿素和麥麩添加量對培養(yǎng)料含量影響

表6 不同尿素添加量對糙皮側(cè)耳栽培過程中培養(yǎng)料含量的影響Table 6 Effect of different urea content on the content of culture substrates during growth and development of Pleurotus ostreatus mmol·kg-1

2.5 尿素和麥麩添加量對糙皮側(cè)耳基質(zhì)降解酶活力的影響

比較糙皮側(cè)耳栽培過程中對照組、5 g·kg-1尿素試驗(yàn)組和300 g·kg-1麥麩試驗(yàn)組的基質(zhì)降解酶活力變化,結(jié)果見圖3。添加5 g·kg-1尿素或300 g·kg-1麥麩試驗(yàn)組的漆酶(圖3-A)、木聚糖酶(圖3-B)和纖維素酶(圖3-C)活力整體上均顯著高于對照組;在一潮采收之前的各時(shí)期,尿素或麥麩添加組的蛋白酶活力均顯著低于對照組。另外,添加2種氮源對基質(zhì)降解酶活力的影響也存在差異,尿素添加組的漆酶活力在滿袋期和原基期均顯著低于麥麩添加組,而在一潮采收后的各時(shí)期均顯著高于麥麩添加組;尿素添加組蛋白酶活力在一潮采收后4 d之前均低于麥麩添加組,但在二潮采收期顯著高于麥麩添加組(圖3-D)。綜上可知,適當(dāng)?shù)哪蛩鼗螓滬熖砑涌商岣卟谄?cè)耳木質(zhì)纖維素降解酶活力,促進(jìn)培養(yǎng)料的分解轉(zhuǎn)化。

A:漆酶;B:木聚糖酶;C:纖維素酶;D:蛋白酶。1:半袋期;2:滿袋期;3:原基期;4:一潮采收期;5:一潮采收后4 d;6:二潮采收期;7:二潮采收后4 d。A: Laccase; B: Xylanase; C: Cellulase; D: Protease.1: Half-bag stage; 2: Full-bag stage; 3: Primordial formation stage; 4: First harvesting stage; 5: 4 days after first harvesting stage; 6: Second harvesting stage; 7: 4 days after second harvesting stage.

3 結(jié)論與討論

本研究以尿素和麥麩為氮源,對比了棉籽殼熟料栽培糙皮側(cè)耳過程中不同氮源種類、碳氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)和碳氮比值對糙皮側(cè)耳菌絲生長、子實(shí)體產(chǎn)量與營養(yǎng)成分的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),無論以尿素還是以麥麩為氮源,隨著氮源添加量增加,培養(yǎng)料氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高、碳氮比值降低,糙皮側(cè)耳菌絲長勢逐漸變好,但菌絲生長速率逐漸降低。該結(jié)果與灰樹花、金針菇和姬松茸等[7-9]食用菌的研究結(jié)果一致,且與植物根系在低氮脅迫下伸長的生理現(xiàn)象相符[18]。李邦等[18]研究了高粱根系在低氮脅迫下根伸長的生理機(jī)制,發(fā)現(xiàn)低氮脅迫處理使高粱根系內(nèi)源色氨酸含量顯著增加,依賴色氨酸途徑合成的生長素及協(xié)同提高的能量代謝促進(jìn)了低氮下高粱根系的伸長。糙皮側(cè)耳在低氮培養(yǎng)料中菌絲生長速率比高氮培養(yǎng)料中更快的生理機(jī)制與植物根系響應(yīng)低氮脅迫的機(jī)制是否相同還有待進(jìn)一步探究。

另外,本研究發(fā)現(xiàn)以麥麩作為氮源時(shí),糙皮側(cè)耳子實(shí)體生物學(xué)效率最高的培養(yǎng)料氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)和碳氮比值分別為1.86%和20.8∶1,與麥麩和玉米芯熟料栽培糙皮側(cè)耳子實(shí)體生物學(xué)效率最高時(shí)培養(yǎng)料的氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)和碳氮比值基本一致[10]。由此說明,同種氮源對不同主料栽培的糙皮側(cè)耳最適氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)和碳氮比值無顯著影響。以尿素為氮源時(shí),糙皮側(cè)耳生物學(xué)效率最高的培養(yǎng)料氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)和碳氮比值分別為1.52%和為25.0∶1,與以麥麩作為氮源時(shí)存在顯著差異,表明2種不同氮源對糙皮側(cè)耳栽培的影響不同,推測主要是2種氮源的利用方式不同。添加尿素或麥麩能夠提高糙皮側(cè)耳栽培料中漆酶、木聚糖酶和纖維素酶活力,且2種氮源在某些時(shí)期對上述酶活力的影響存在顯著差異。而添加尿素或麥麩可抑制糙皮側(cè)耳營養(yǎng)生長期的蛋白酶活力,推測是接種初期尿素或麥麩被快速分解釋放的氨態(tài)氮和氨基酸等優(yōu)先氮源抑制了蛋白酶基因的表達(dá)。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),不同尿素和麥麩添加量對糙皮側(cè)耳生物學(xué)效率的影響規(guī)律也存在顯著差異,在添加設(shè)定培養(yǎng)基配方范圍內(nèi)的麥麩均起到增產(chǎn)的作用,而尿素添加量過高則導(dǎo)致生物學(xué)效率顯著降低,推測是高含量尿素在糙皮側(cè)耳脲酶作用下分解釋放產(chǎn)生了大量的銨態(tài)氮[12],后者可引發(fā)胞內(nèi)活性氧積累、膜脂過氧化及酶失活[19-20],從而對糙皮側(cè)耳產(chǎn)生氨毒性[21]。

綜上所述,添加適量尿素或麥麩均能顯著提高糙皮側(cè)耳子實(shí)體產(chǎn)量及子實(shí)體總氨基酸和粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù),經(jīng)濟(jì)效益也得到顯著提高,但糙皮側(cè)耳利用尿素和麥麩為氮源時(shí)的最適氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)和碳氮比值不同。棉籽殼熟料栽培糙皮側(cè)耳培養(yǎng)料中以尿素為氮源時(shí),尿素的最適添加量為5 g·kg-1,培養(yǎng)料的氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.52%,碳氮比值為25.0∶1;以麥麩為氮源時(shí),麥麩的最適添加量為300 g·kg-1,培養(yǎng)料的氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.86%,碳氮比值為20.8∶1。不同形態(tài)氮源對糙皮側(cè)耳栽培產(chǎn)量和子實(shí)體營養(yǎng)成分影響存在顯著差異,綜合來看,糙皮側(cè)耳熟料栽培采用麥麩等有機(jī)氮源更為適宜。