［摘要］ 目的

探討子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMT）患者的異位內(nèi)膜組織中神經(jīng)損傷誘導(dǎo)蛋白1（Ninj1）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）及蛋白基因產(chǎn)物9.5（PGP-9.5）的表達(dá)及與痛經(jīng)的關(guān)系。

方法 以2020年4月—2021年4月在我院行婦科術(shù)后病理檢查確診為卵巢EMT患者的異位內(nèi)膜組織40例為A組，并獲取其中20例患者的在位子宮內(nèi)膜組織為B組，收集同期20例子宮肌瘤患者的正常子宮內(nèi)膜組織作為C組。根據(jù)有無痛經(jīng)將A組分為痛經(jīng)亞組與非痛經(jīng)亞組，每組20例。采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)A、B、C組內(nèi)膜組織中Ninj1、IL-1β及PGP-9.5的表達(dá)，并分析其相關(guān)性；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)A組與C組患者外周血中IL-1β的表達(dá)水平。

結(jié)果

A組患者外周血中IL-1β的表達(dá)水平顯著高于C組（t=-4.184，Plt;0.05）；與C組相比，A、B組內(nèi)膜組織中3種蛋白陽(yáng)性表達(dá)構(gòu)成比均明顯升高（χ2=4.286～19.394，Plt;0.05），與B組相比，A組內(nèi)膜組織中3種蛋白陽(yáng)性表達(dá)構(gòu)成比明顯升高（χ2=4.149～5.272，Plt;0.05）。痛經(jīng)亞組內(nèi)膜組織中Ninj1與PGP-9.5蛋白陽(yáng)性表達(dá)構(gòu)成比明顯高于非痛經(jīng)亞組（χ2=8.533、11.905，Plt;0.05）。A組內(nèi)膜組織中Njnj1與PGP-9.5、IL-1β的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.733、0.628，Plt;0.05）。

結(jié)論 Ninj1、IL-1β及PGP-9.5在異位內(nèi)膜組織中陽(yáng)性表達(dá)比例較高，可能參與EMT的發(fā)生與發(fā)展；痛經(jīng)亞組內(nèi)膜組織中Ninj1與PGP-9.5蛋白的陽(yáng)性表達(dá)構(gòu)成比高于非痛經(jīng)亞組，可能與EMT疼痛發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 子宮內(nèi)膜異位癥；細(xì)胞黏附分子，神經(jīng)元；白細(xì)胞介素1β；神經(jīng)組織蛋白質(zhì)類；痛經(jīng)

［中圖分類號(hào)］ RR711.71

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

Expression and significance of Ninj1， IL-1β and PGP-9.5 in ectopic endometrial tissues of patients with endometriosis

ZHAO Li， LI Yuying， WANG Lei， JIAO Jinwen， SUN qi，" HUANG Meisha， YUAN Fang

（Department of Gynecology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

; ［ABSTRACT］＼ Objective To investigate the expression levels of nerve injury-induced protein 1 （Ninjl）， interleukin-1β（IL-1β）， and protein gene product 9.5 （PGP-9.5） in the ectopic endometrial tissues of patients with endometriosis （EMT） and their relationship with dysmenorrhea.

Methods Ectopic endometrial tissues from 40 patients with ovarian EMT diagnosed by post-ope-

rative gynecological pathological examination in our hospital from April 2020 to April 2021 were selected as group A. In situ endo-metrial tissues from 20 of these patients were obtained as group B. Normal endometrial tissues from 20 patients with uterine fi-broids in the same period were collected as group C. Group A was divided into a dysmenorrhoea subgroup and a non-dysmenorrhoea subgroup according to the presence or absence of dysmenorrhoea， with 20 patients per subgroup. The expression levels of Ninj1， IL-1β， and PGP-9.5 in the endometrial tissues of groups A， B， and C were measured by immunohistochemistry， and their correlation was analyzed. The expression level of IL-1β in the peripheral blood of patiens in groups A and C was measured by enzyme-linked immunosorbent assay.

Results The expression level of IL-1β in the peripheral blood of patients in group A was signifi-cantly higher than that in group C （t=-4.184，Plt;0.05）. The positive expression rates of three proteins in the endometrial tissues were significantly increased in groups A and B compared with group C （χ2=4.286-19.394， Plt;0.05）and in group A compared with group B （χ2=4.149-5.272，Plt;0.05）. The positive expression rates of Ninjl and PGP-9.5 proteins in the endometrial tissues were significantly higher in the dysmenorrhoea subgroupthan in the non-dysmenorrhoea subgroup （χ2=8.533，11.905，Plt;0.05）. The expression of Ninj1 was positively correlated with the expression of PGP-9.5 and IL-1β in the endometrial tissues of group A （r=0.733， 0.628，Plt;0.05）.

Conclusion Ninjl， IL-1β， and PGP-9.5 are highly expressed in the ectopic endometrial tissues，which may be involved in the occurrence and development of EMT. The positive expression rates of both Ninjl and PGP-9.5 in the endometrial tissues of the dysmenorrhoea subgroup were higher than those in the non-dysmenorrhoea subgroup， which may be closely related to the mechanism of EMT pain.

［KEY WORDS］ Endometriosis; Cell adhesion molecules， neuronal; Interleukin-1beta; Nerve tissue proteins; Dysmenorrhea

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMT）是一種常見的婦科疾病，其特征是子宮內(nèi)膜組織在子宮腔范圍以外的其他部位生長(zhǎng)，其中可能包括卵巢、輸卵管、盆腔組織等處。EMT發(fā)病率占育齡期女性的10%～15%，且這一比例仍在逐年上升［1］?；颊叩湫偷奶弁窗Y狀（痛經(jīng)、慢性盆腔疼痛和性交痛）在青春期和成年女性患者中高達(dá)70%～80%，上述癥狀對(duì)患者的身心健康和社交生活造成不良影響。該病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未明確。神經(jīng)損傷誘導(dǎo)蛋白1（Ninj1）在胚胎組織中廣泛存在，尤其是在具有上皮起源的組織中［2］，其可調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)，促進(jìn)軸突生長(zhǎng)及血管生成，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［3］，但目前對(duì)Ninj1的研究較為局限，鮮有在女性生殖系統(tǒng)中的研究。蛋白基因產(chǎn)物9.5（PGP-9.5）是來源于神經(jīng)外胚層細(xì)胞的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)特定組織標(biāo)志物，可以用來標(biāo)記神經(jīng)纖維。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)纖維的密度和EMT相關(guān)疼痛相關(guān)［4］，本研究通過比較Ninj1、IL-1β及PGP-9.5在EMT異位組織中及在EMT痛經(jīng)與非痛經(jīng)患者內(nèi)膜組織中的表達(dá)差異，探討Ninj1、IL-1β及PGP-9.5在EMT發(fā)生發(fā)展及疼痛發(fā)生機(jī)制中的作用，為尋找新的子宮內(nèi)膜異位癥治療靶點(diǎn)及有效緩解患者疼痛提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

選擇2020年4月—2021年4月間于我院接受EMT手術(shù)的患者40例，收集其異位內(nèi)膜組織，設(shè)為A組。上述患者術(shù)后病理檢查結(jié)果均證實(shí)為卵巢EMT。在A組進(jìn)一步選擇20例患者的在位內(nèi)膜組織設(shè)為B組。作為對(duì)照，選取同期20例子宮肌瘤患者并獲取其正常子宮內(nèi)膜組織設(shè)為C組。A組患者平均年齡（41.89±3.74）歲，B組患者平均年齡（41.83±4.39）歲，C組患者平均年齡（43.78±3.08）歲。針對(duì)A組，進(jìn)一步根據(jù)患者是否有痛經(jīng)將其分為痛經(jīng)亞組和非痛經(jīng)亞組，每亞組各20例患者。A組與C組患者年齡具有可比性。所有患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①手術(shù)前未曾患自身免疫性疾病或傳染性疾?。虎谠谑中g(shù)前3個(gè)月內(nèi)未接受過如免疫抑制劑、激素等抗炎藥物治療。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)方法（SP法）檢測(cè)3組患者子宮內(nèi)膜組織中Ninj1、IL-1β及PGP-9.5蛋白的表達(dá)情況 術(shù)中留取的3組患者的相應(yīng)內(nèi)膜組織，均置于-80 ℃冰箱凍存，根據(jù)術(shù)后病理，確定入組患者，制作石蠟包埋切片。對(duì)研究中樣本進(jìn)行兩種不同的染色方法，分別是HE染色和SP法染色，以PBS液替代一抗作為陰性對(duì)照。綜合分析每張切片中細(xì)胞的染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞百分比，對(duì)染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分，若染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比的得分乘積超過2分，便認(rèn)定其為陽(yáng)性表達(dá)［5］。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)A組與C組患者外周血中IL-1β的表達(dá)情況 手術(shù)前1 d采集患者外周靜脈血3～5 mL，將血液樣本在4 ℃下于離心機(jī)中離心15 min，將血清分離并存儲(chǔ)在溫度為-80 ℃的冰箱中，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。根據(jù)人IL-1β ELISA試劑盒（伊萊瑞特E-EL-H0149c）操作手冊(cè)，執(zhí)行相應(yīng)的步驟以測(cè)定患者血清中IL-1β表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以x-±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；對(duì)于定性資料，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析

使用Spearman方法。以Plt;0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)" 果

2.1 不同內(nèi)膜組織中Ninj1、PGP-9.5及IL-1β蛋白表達(dá)情況比較

A、B組內(nèi)膜組織中Ninj1、PGP-9.5及IL-1β蛋白陽(yáng)性表達(dá)構(gòu)成比與C組相比均明顯升高（χ2=4.286～19.394，Plt;0.05）；與B組相比，A組內(nèi)膜組織中3種蛋白陽(yáng)性表達(dá)構(gòu)成比均明顯升高（χ2=4.149～5.272，Plt;0.05）。痛經(jīng)亞組內(nèi)膜組織中Ninj1與PGP-9.5蛋白表達(dá)構(gòu)成比高于非痛經(jīng)亞組（χ2=8.533、11.905，Plt;0.05），IL-1β蛋白表達(dá)情況無顯著差異（P＞0.05）。見表1、圖1～3。

2.2 A組與C組患者血清中IL-1β表達(dá)水平比較

A、C組患者血清中IL-1β表達(dá)水平分別為（9.47±0.62）、（8.55±0.72）ng/L，兩組比較差異有顯著性（t=-4.184，Plt;0.05）。

2.3 A組內(nèi)膜組織中Ninj1、PGP-9.5及IL-1β表達(dá)的相關(guān)性

A組內(nèi)膜組織中Njnj1與PGP-9.5、IL-1β的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.733、0.628，Plt;0.05）。

3 討" 論

目前我們尚未完全了解EMT的發(fā)病機(jī)制，其涉及多方面復(fù)雜因素，包括炎癥、免疫、內(nèi)分泌以及遺傳等［6］。痛經(jīng)、慢性盆腔痛和性交痛是EMT患者典型的癥狀，目前為止，對(duì)于疼痛癥狀的處理包括藥物治療和手術(shù)治療兩種，無論何種方式均會(huì)產(chǎn)生某些有害影響，但目前對(duì)EMT患者疼痛發(fā)生機(jī)制的研究亦無明確的定論。

異位內(nèi)膜的存在引發(fā)EMT激活了自身免疫系統(tǒng)，并使得巨噬細(xì)胞數(shù)量得到提升，這也增加了包括IL-1β以及腫瘤壞死因子在內(nèi)的諸多炎癥因子的分泌量。存在炎性環(huán)境的情況下，不僅炎癥因子的表達(dá)被促進(jìn)，且這些炎癥因子還會(huì)反過來參與和促進(jìn)EMT的發(fā)生發(fā)展［7］。巨噬細(xì)胞產(chǎn)出的IL-1β是關(guān)鍵的炎癥細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)分子，它不僅能激發(fā)炎癥反應(yīng)，也能促進(jìn)異位內(nèi)膜在腹腔內(nèi)的植入、子宮異位內(nèi)膜血管的形成以及提升其他細(xì)胞因子的濃度，最終加快異位病灶的進(jìn)攻、粘連進(jìn)程以及血管的再生，對(duì)EMT的發(fā)生和進(jìn)展起到關(guān)鍵影響［8-9］。有研究結(jié)果顯示，新生成的血管周邊總是附帶神經(jīng)的分布［10］。Ninj1是一種新發(fā)現(xiàn)的炎癥調(diào)控標(biāo)志物，具有促進(jìn)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)的特性。根據(jù)本研究結(jié)果，A組血清中IL-1β水平及異位內(nèi)膜組織中三種蛋白的陽(yáng)性表達(dá)構(gòu)成比均顯著高于C組，這提示IL-1β以及Ninj1均可能參與了EMT的發(fā)生和發(fā)展過程。MIYASHITA等［11］研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β和Ninj1在卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫和腹壁子宮內(nèi)膜異位病灶中均表現(xiàn)為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，與本研究結(jié)果一致。此外，向子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中添加IL-1β后，經(jīng)過3～6 h孵育，Ninj1 mRNA表達(dá)增加，提示Ninj1可能通過炎癥遞質(zhì)在微環(huán)境中的誘導(dǎo)參與了EMT的發(fā)病過程。本研究進(jìn)一步證實(shí)了A組組織當(dāng)中Ninj1與IL-1β表達(dá)呈正相關(guān)，支持了上述結(jié)論。

PGP-9.5又稱泛素C末端水解酶（UCHL-1），被視為一種敏感的神經(jīng)標(biāo)志物，能夠精確標(biāo)記神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)纖維［4］。某些研究發(fā)現(xiàn)，只有在存在疼痛癥狀的患者群體當(dāng)中，子宮內(nèi)膜功能層會(huì)出現(xiàn)PGP-9.5突出顯示的神經(jīng)纖維，也就是說，此類神經(jīng)纖維的分布密集程度和疼痛癥狀是正相關(guān)的。對(duì)腹壁EMT患者的異位病灶、灶旁正常組織當(dāng)中PGP-9.5陽(yáng)性的神經(jīng)纖維進(jìn)行染色分析發(fā)現(xiàn)，異位組織中神經(jīng)密度分布高于正常組織［12-13］。本研究結(jié)果表明，相較于C組，異位內(nèi)膜組織中PGP-9.5蛋白的表達(dá)顯著增強(qiáng)。進(jìn)一步分析痛經(jīng)亞組和非痛經(jīng)亞組發(fā)現(xiàn)，痛經(jīng)亞組的異位內(nèi)膜組織中蛋白陽(yáng)性表達(dá)構(gòu)成比高于非痛經(jīng)亞組。此外，痛經(jīng)亞組中Ninj1的表達(dá)與PGP-9.5呈正相關(guān)，即隨著PGP-9.5的增加，Ninj1的表達(dá)也增加。這提示Ninj1可能與疼痛癥狀的發(fā)生存在一定關(guān)系。MIYASHITA等［11］的研究也表明，在EMT組織中，Ninj1和PGP-9.5蛋白的表達(dá)均較正常子宮內(nèi)膜組織中顯著增高。通過蘇木精反染證實(shí)，PGP-9.5在組織中的陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域與Ninj1的陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域一致。這提示神經(jīng)生長(zhǎng)可能是疼痛產(chǎn)生的一個(gè)潛在原因。因此，EMT又被稱為血管神經(jīng)性疾?。?4］。

炎癥反應(yīng)能夠觸發(fā)神經(jīng)纖維的激活，促進(jìn)組胺、5-羥色胺、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）、Ninj1和前列腺素等神經(jīng)遞質(zhì)釋放［15］，建立神經(jīng)疼痛調(diào)控環(huán)路，導(dǎo)致疼痛感覺的產(chǎn)生。在EMT中，局部炎癥反應(yīng)可以通過刺激神經(jīng)末梢，介導(dǎo)疼痛感覺，并隨后調(diào)控促炎神經(jīng)調(diào)節(jié)劑的釋放，最終導(dǎo)致疼痛的發(fā)生［16］。多種因子能夠直接誘導(dǎo)周圍神經(jīng)的敏化，從而參與形成反饋回路，導(dǎo)致炎癥和疼痛之間的循環(huán)持續(xù)存在。此外，長(zhǎng)期處在慢性炎癥環(huán)境中，可能會(huì)使神經(jīng)纖維分布不同，甚至重新分布，其中為了維持局部炎癥微環(huán)境的平衡，同時(shí)增加疼痛信號(hào)［17］，可能導(dǎo)致局部感覺纖維的增加，而失去交感神經(jīng)纖維，這可能是EMT患者疼痛的機(jī)制之一。

郎景和院士提出的“在位內(nèi)膜決定論”明確了EMT發(fā)病中在位子宮內(nèi)膜的關(guān)鍵作用，并對(duì)經(jīng)血逆流種植學(xué)說進(jìn)行了修正和擴(kuò)充［18］。本研究結(jié)果顯示，EMT在位內(nèi)膜組織中Ninj1、PGP-9.5和IL-1β表達(dá)均顯著高于對(duì)照內(nèi)膜組織，與在位內(nèi)膜決定論的觀點(diǎn)相一致。

總而言之，本研究驗(yàn)證了EMT患者異位內(nèi)膜組織中Ninj1、PGP-9.5及IL-1β的高表達(dá)。Ninj1不僅在促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)中發(fā)揮了作用，參與了EMT的發(fā)生和發(fā)展，還可能與疼痛產(chǎn)生機(jī)制相關(guān)。然而，Ninj1在這些過程中的具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

倫理批準(zhǔn)和知情同意：本研究涉及的所有試驗(yàn)均已通過青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)（文件號(hào)QYFYWZLL27072）。受試對(duì)象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

作者聲明：袁芳、趙麗、李玉英、孫琦及黃美莎參與了研究設(shè)計(jì)；趙麗、袁芳、焦今文及王蕾參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 耿波）