摘要：本研究通過頂空吸附結(jié)合GC-MS技術(shù)分離鑒定了重陽木枝葉揮發(fā)性化合物，利用Y型嗅覺儀測定了雌性重陽木錦斑蛾Histia rhodope對(duì)揮發(fā)物的行為反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在本實(shí)驗(yàn)條件下，共分離鑒定出重陽木枝葉揮發(fā)性化合物共15種；發(fā)現(xiàn)順-3-己烯乙酸酯和β-羅勒烯兩種化合物對(duì)雌性重陽木錦斑蛾具有明顯的吸引作用。研究結(jié)果對(duì)研發(fā)重陽木錦斑蛾的產(chǎn)卵引誘劑奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：重陽木錦斑蛾；重陽木；揮發(fā)性化合物；行為反應(yīng)

中圖分類號(hào)：S763.7文獻(xiàn)識(shí)別碼：A文獻(xiàn)編號(hào)：1005-6114（2024）05-010-04

重陽木錦斑蛾Histia rhodope屬鱗翅目斑蛾科，是我國城市園林綠化和行道樹重陽木Bischofia polycarpa的重要食葉性害蟲［1］。該蟲此前在國內(nèi)主要分布于長江中下游和華南地區(qū)［2］，近年來北移擴(kuò)散較快，在我國許多地區(qū)連年持續(xù)暴發(fā)為害。其幼蟲可將整株樹葉取食殆盡，甚至干枯死亡；老熟幼蟲吐絲下垂習(xí)性常引起樹冠下蟲絲飄蕩，對(duì)行人和居民的生活產(chǎn)生干擾，嚴(yán)重影響城市景觀和生態(tài)效益［3］。

目前對(duì)重陽木錦斑蛾的防控主要依賴化學(xué)防治，但該害蟲主要發(fā)生在城市居民區(qū)和公園的重陽木上，化學(xué)殺蟲劑的頻繁使用容易導(dǎo)致害蟲抗藥性、農(nóng)藥殘留、害蟲再猖獗等問題，還會(huì)危及居民健康。因此，亟需開發(fā)新型綠色環(huán)保的防治措施［4］。昆蟲性信息素由于其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、生態(tài)安全及使用簡單等優(yōu)點(diǎn)，在害蟲生物防治中得到廣泛的應(yīng)用，尤其在蔬菜和林業(yè)害蟲防治中占據(jù)著重要的地位［5］。但該防治技術(shù)一個(gè)無法避免的缺陷是僅能誘殺雄蛾，而對(duì)負(fù)責(zé)產(chǎn)卵的雌蛾來說無引誘效果，若田間種群密度高或者外來已經(jīng)交配雌蛾新遷入到防治區(qū)域，該技術(shù)的防治效果會(huì)顯著下降，因此目前性誘劑主要被應(yīng)用于害蟲的預(yù)測預(yù)報(bào)上。

寄主植物揮發(fā)性成分在昆蟲尋找食物、交配和產(chǎn)卵場所發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［6］。重陽木錦斑蛾是專食性昆蟲，幼蟲取食重陽木葉片，成蟲也僅在重陽木葉片和嫩梢上產(chǎn)卵。從重陽木枝葉揮發(fā)物中尋找吸引重陽木錦斑蛾雌蛾的活性成分，有望誘捕到雌蛾，從而可在大尺度空間降低蟲口密度，維護(hù)生態(tài)平衡，達(dá)到科學(xué)治理之目的。劉路等采用水蒸氣蒸餾法提取重陽木樹皮和葉片的揮發(fā)油，并通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)從重陽木樹皮揮發(fā)油中鑒定出丁香酚等18種化合物，在重陽木新鮮葉片揮發(fā)油中鑒定出1-己醇等14種化合物，這些研究結(jié)果為研發(fā)重陽木錦斑蛾植物源引誘劑奠定了基礎(chǔ)［7］。但水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油組分與寄主植物正常釋放的揮發(fā)性化合物吻合度較低，可能會(huì)遺失某些重要組分。動(dòng)態(tài)頂空收集法可高保真采集寄主植物一定時(shí)間內(nèi)在頂空區(qū)域不斷釋放的揮發(fā)性化合物，是目前主流的寄主植物揮發(fā)性化合物收集方法。

本研究通過動(dòng)態(tài)頂空吸附法收集重陽木枝葉揮發(fā)性化合物，采用GC-MS技術(shù)分離鑒定重陽木枝葉揮發(fā)性化合物組分，利用Y型嗅覺儀測定雌性重陽木錦斑蛾對(duì)揮發(fā)性化合物的行為反應(yīng)，以期為該蟲的產(chǎn)卵引誘劑研發(fā)和綠色防控提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

供試?yán)ハx：重陽木錦斑蛾幼蟲采自河南科技大學(xué)重陽木葉片上，將采集到的幼蟲帶回養(yǎng)蟲室用重陽木葉片飼喂，定期更換新鮮的重陽木葉片至化蛹。化蛹后雌雄分開，羽化后的雌蛾和雄蛾各取15頭放入交配籠（長寬高均為75 cm）中交配，交配籠內(nèi)放入重陽木葉枝供成蟲攀爬，以10%蔗糖水補(bǔ)充營養(yǎng)。養(yǎng)蟲室溫度和相對(duì)濕度分別為（27±1）℃和（60±5）%，光周期16L∶8D。

供試植物：重陽木苗購于河南省鄢陵縣綠之林苗木基地，將樹苗栽種于花盆（高40 cm，口徑38 cm）中，常規(guī)施肥澆水管理。在進(jìn)行揮發(fā)性化合物收集時(shí)，重陽木的生長高度為1.8～2.2 m。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1重陽木枝葉揮發(fā)性化合物頂空收集

參考Sun等［8］的方法對(duì)重陽木枝葉揮發(fā)性化合物進(jìn)行動(dòng)態(tài)頂空收集。將重陽木主枝頂部枝葉裝到長55 cm、寬43 cm的聚四氟乙烯烤箱袋中，把裝有活性炭的玻璃棒一端用特氟龍管連接大氣采樣儀的出氣口，一端連接烤箱袋，使過濾的氣體連續(xù)泵入袋子中，流速設(shè)置為500 mL/min。吸附柱用棉繩固定在烤箱袋頂端，另一端連接大氣采樣儀的進(jìn)氣口，組成一個(gè)循環(huán)的閉路系統(tǒng)，收集時(shí)間為800～1800。設(shè)3次重復(fù)，以相同條件下收集未放植物的氣體為空白對(duì)照。吸附重陽木揮發(fā)性化合物的吸附柱用1 mL的色譜純正己烷洗脫至1.5 mL 的樣品瓶中，每次200 μL洗脫5次，-20℃保存?；钚蕴坎ＡО粼诤嫦渲?80℃烘3 h，在活性碳棒未冷卻時(shí)連接高純氮?dú)獯? min，排出雜質(zhì)。

1.2.2植物揮發(fā)性化合物分離鑒定

通過GC-MS（7890A-5975C，Agilent Technologies，美國）對(duì)收集到的重陽木枝葉揮發(fā)性化合物進(jìn)行分離鑒定，色譜柱是DB-WAX 毛細(xì)管色譜柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm，Agilent Technologies，美國）。氦氣作為載氣，流速設(shè)置為 1 mL/min。進(jìn)樣口溫度為230℃，色譜柱箱的升溫程序?yàn)?0℃保持1 min，然后以每分鐘5 ℃的升溫速度升至230 ℃，保持5 min。傳輸線的溫度設(shè)定為250 ℃，使用電子碰撞（EI：70 eV，250 ℃）獲得質(zhì)譜，四級(jí)桿的溫度為150 ℃。利用NIST MS（NIST mass spectral search program，version 2.2，Agilent Technologies）庫比對(duì)并分析樣品中揮發(fā)性化合物的成分。通過比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化合物與樣品中化合物的質(zhì)譜圖和保留時(shí)間，對(duì)樣品中揮發(fā)性化合物進(jìn)行鑒定。

1.2.3雌性重陽木錦斑蛾的行為反應(yīng)測定

利用Y型嗅覺儀，測定雌性重陽木錦斑蛾對(duì)揮發(fā)性化合物的行為反應(yīng)。Y型嗅覺儀由一個(gè)總管（長60 cm，直徑6 cm）和兩個(gè)分管組成（長50 cm，直徑5 cm）。將不同的氣味化合物原液溶解在石蠟油中至濃度為 10 μg/μL，之后將10μL試驗(yàn)樣品或石蠟油加在橡膠誘芯里，放入與分管相連的錐形瓶中。以交配后第2～3 d的重陽木錦斑雌蛾為供試?yán)ハx。在試驗(yàn)過程中，每次釋放1頭于總管管口，觀察5 min。在此時(shí)間段內(nèi)，沒有選擇任何一個(gè)分管視為沒有做出選擇。反之，進(jìn)入分管超過一半長度并停留超過5 s或者直接進(jìn)入分管底部，視為做出選擇。測試5頭雌蛾之后，轉(zhuǎn)動(dòng)嗅覺儀并切換錐形瓶以避免位置效應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)束后用水、乙醇和丙酮清洗嗅覺儀和錐形瓶。每頭雌蛾只使用一次。試驗(yàn)期間，室溫保持在（26±1）℃，相對(duì)濕度為（75±5）％。將LED燈（80W）懸掛于Y型嗅覺儀正上方以避免光線對(duì)行為反應(yīng)的干擾，光強(qiáng)約2 000 lx。每組試驗(yàn)重復(fù)雌蛾數(shù)不少于40頭。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

利用GraphPad Prism 6軟件的卡方檢驗(yàn)法（chi-squared analyses）分析行為試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

在本實(shí)驗(yàn)條件下，在重陽木枝葉中共鑒定出十二烷等15種揮發(fā)性化合物，其中綠葉氣味物質(zhì)種類最多，占總數(shù)的40%，其次為脂肪族化合物，占總數(shù)的26.7%（表1）。

利用Y型嗅覺儀，測定交配后的雌性重陽木錦斑蛾對(duì)15種化合物的行為反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，順-3-己烯乙酸酯和β-羅勒烯對(duì)交配后的雌蛾有明顯的吸引作用（SymbolcA@2值分別為9.22和3.99），在Y型嗅覺儀中雌性重陽木錦斑蛾選擇順-3-己烯乙酸酯或β-羅勒烯的比例分別為71%和64%（圖1）。

3討論

尋找并定位寄主植物產(chǎn)卵是蛾類昆蟲繁衍后代的關(guān)鍵。寄主植物的所在地一般由多種生物群落組成，雌蛾憑借高度敏感的嗅覺系統(tǒng)檢測到寄主植物的氣味信號(hào)進(jìn)一步縮小搜索范圍，最終找到其寄主植物并產(chǎn)卵［6，9］。因此，分離鑒定寄主植物揮發(fā)物中的活性組分是解析植物與昆蟲之間復(fù)雜聯(lián)系的重要前提。

植物的揮發(fā)性化合物分為兩類：一類是高度特異性氣味組分，如十字花科植物釋放的異硫氰酸烯丙酯對(duì)已交配甘藍(lán)夜蛾Mamestra brassicae雌蛾有特異性吸引作用［10］；另一類是各氣味揮發(fā)物組分在植物中普遍存在，通過多種寄主植物揮發(fā)性化合物的特定比例實(shí)現(xiàn)其特異性。在本研究中，我們鑒定到的重陽木枝葉氣味揮發(fā)物，沒有一種化合物組分是其所特有的，推測這些揮發(fā)性化合物之間的比例構(gòu)成了重陽木枝葉的化學(xué)指紋圖譜。

劉路等［7］通過水蒸氣蒸餾法從重陽木葉片中鑒定出14種化合物，與本研究結(jié)果相比，僅反-2-己烯醛為共同成分。說明收集寄主植物化合物方法不同，得出的結(jié)果也有很大差異。水蒸氣蒸餾提取法揮發(fā)性化合物的過程中，重陽木葉片經(jīng)過高溫處理可能會(huì)造成揮發(fā)油中的某些熱敏性化合物分解或聚合，從而影響測定結(jié)果；而動(dòng)態(tài)頂空收集法是在自然情況下收集的重陽木枝葉的揮發(fā)物，更具有高保真性。

通過GC-MS分析，我們發(fā)現(xiàn)重陽木枝葉揮發(fā)性化合物中，綠葉氣味揮發(fā)物（green leaf volatiles，GLVs）種類最多，共有6種。已有大量研究表明GLVs可引寄生蜂/寄生蠅的趨向行為［11-13］。重陽木枝葉釋放的多種GLVs是否對(duì)重陽木錦斑蛾寄生蜂/寄生蠅有吸引作用，還需要進(jìn)一步的電生理以及行為學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)證，此項(xiàng)研究將是我們未來的工作重點(diǎn)之一。

順-3-己烯乙酸酯和β-羅勒烯是多種植物的揮發(fā)物組分［11-13］?，F(xiàn)有的研究表明順-3-己烯乙酸酯對(duì)多種昆蟲有吸引作用。例如，室內(nèi)風(fēng)洞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)順-3-己烯乙酸酯對(duì)棉鈴蟲齒唇姬蜂Campoletis chlorideae雌性成蟲有吸引作用［14］。Saveer等證實(shí)棉花揮發(fā)物組分順-3-己烯乙酸酯可引起交配后的?；页嵋苟闟podoptera littoralis雌蛾的趨向行為［15］。Sun等發(fā)現(xiàn)β-羅勒烯在煙草揮發(fā)性化合物中含量較高，且對(duì)交配后的煙青蟲Helicoverpa assulta雌蛾有吸引作用［8］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)順-3-己烯乙酸酯和β-羅勒烯對(duì)交配后的雌性重陽木錦斑蛾具有明顯的吸引作用，這對(duì)今后研發(fā)重陽木錦斑蛾產(chǎn)卵引誘劑有重要的參考價(jià)值。

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基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（232102111032）。

作者簡介：孫雅輝（2001-），男，碩士研究生，從事化學(xué)生態(tài)學(xué)研究工作。E-mail：3255135925@qq.com

*通訊作者：齊英（1967-），女，本科，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)保技術(shù)的示范與推廣研究。E-mail：aynyz009@163.com

董鈞鋒（1973-），男，河南鄭州人，教授，博士學(xué)歷，主要從事昆蟲化學(xué)生態(tài)學(xué)研究。E-mail：junfengdong@haust.edu.cn