關鍵詞 CRISPR/Cas9； 基因編輯； 甘藍型油菜； 種質(zhì)資源創(chuàng)新； 作物遺傳改良

油菜是世界上最重要的油料作物之一。甘藍型油菜（Brassica napus L.， AACC， 2n=38）是由二倍體親本白菜（B. rapa， AA， 2n=20）與甘藍（B. olera?cea， CC， 2n=18）在距今7 500 年前通過自然雜交產(chǎn)生的異源四倍體物種，擁有復雜的基因組，包含大量重復基因。甘藍型油菜中多拷貝基因序列相似性高，阻礙了油菜基因功能研究。對油菜來說，敲除基因的所有同源拷貝是獲得可靠表型的必要條件。近幾十年來，X 射線輻射誘變等物理方法、甲基磺酸乙酯（EMS）誘變等化學方法以及T-DNA 插入等生物方法已被廣泛應用于功能基因組學研究和作物育種。上述這些方法雖然能夠產(chǎn)生可遺傳的穩(wěn)定突變，但是它們誘發(fā)的突變都是隨機的。后續(xù)需要經(jīng)過耗時且費力的大規(guī)模篩選，才能獲得有效的目標突變體，這對于異源四倍體的油菜來說尤為不便。因此，需要尋找高效、省時、低成本、穩(wěn)定遺傳的新方法來促進作物遺傳改良，加快種質(zhì)資源創(chuàng)新。

近幾十年來，基因編輯技術從無到有，發(fā)展迅

速。這項技術是在DNA 水平上對基因靶點進行一系列定點修飾或改造，包括堿基的插入、缺失或替換。由于能實現(xiàn)對靶基因的精準調(diào)控，自誕生以來基因編輯技術便被廣泛地應用于不同物種的基因組DNA 修飾。基因編輯技術主要分為3 類：鋅指核酸酶系統(tǒng)（zinc-fingers nucleases， ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活效應器樣核酸酶系統(tǒng)（transcription activator-like effec?tor nucleases， TALENs）以及CRISPR/Cas 系統(tǒng)（clustered regularly interspaced short palindromic re?peats/CRISPR-associated proteins， CRISPR/Cas）。ZFN 系統(tǒng)和TALEN 系統(tǒng)由于結(jié)構(gòu)復雜、成本高、效率低等問題迅速被簡單快捷高效的CRISPR/Cas 系統(tǒng)取代。CRISPR/Cas 系統(tǒng)可以縮短作物改良領域中基因功能鑒定和新品種選育的時間。截至目前，CRISPR/Cas 系統(tǒng)已成功應用于包括油菜在內(nèi)的50多種植物上［1］。本文簡要介紹了基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)開發(fā)的幾種基因編輯工具，總結(jié)了迄今為止CRISPR/Cas9 基因編輯技術在甘藍型油菜基因功能探究和遺傳改良方面的研究現(xiàn)狀和未來發(fā)展方向，以期為相關研究者快速了解該領域發(fā)展現(xiàn)狀提供參考。

1 基于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的基因編輯技術

1.1 CRISPR/Cas9 編輯系統(tǒng)

經(jīng)典的CRISPR/Cas 系統(tǒng)根據(jù)效應模塊的架構(gòu)可分為2 類：Ⅰ型和Ⅱ型（圖1A）。通常Ⅰ型CRIS?PR/Cas 系統(tǒng)通過多個效應子的配合來發(fā)揮其DNA切割功能，基因編輯操作相對較為復雜。與之相反，Ⅱ型CRISPR/Cas 系統(tǒng)僅使用1 個大的效應蛋白來進行DNA 切割，操作更簡單。目前最常用的有CRISPR/Cas9 和CRISPR/Cpf1。

CRISPR/Cas9 屬于Ⅱ型CRISPR 系統(tǒng)，由兩部分組成：Cas9 蛋白和sgRNA。其工作原理是，sgRNA 通過堿基互補配對引導Cas9 蛋白靶向目標基因特定位點，該位點被稱為PAM 位點（protospac?ers adjacent motif， PAM），Cas9 蛋白隨后在PAM 位點附近切割雙鏈DNA，造成雙鏈斷裂（DSB， doublestrandbreak）。DSB 引發(fā)細胞自損修復機制，即同源重組修復（homology directed repair， HDR）和非同源末端連接（non-homologous end joining， NHEJ），在修復的過程中隨機引入堿基的插入或缺失，從而在目標基因靶點處產(chǎn)生隨機突變。得益于其巨大的優(yōu)勢，CRISPR/Cas9 已用于水稻、小麥、玉米、大豆和油菜等作物的遺傳改良。

1.2 堿基編輯技術

基于CRISPR/Cas9 介導的單堿基編輯能夠以可設計的方式實現(xiàn)直接、不可逆的堿基轉(zhuǎn)換，并且不需要創(chuàng)建DSB。目前的堿基編輯器是由人工改造的Cas9 核酸酶和單鏈DNA 特異性脫氨酶組成的融合蛋白。在sgRNA 的引導下，d/nCas9 將脫氨酶定位到靶點序列，形成1 個R-loop。R-loop 內(nèi)的核苷酸充當脫氨酶的底物，這些核苷酸的位置定義了堿基編輯的“活動窗口”。目前廣泛使用的單堿基編輯技術有2 類：胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor，CBE，圖1B）和腺嘌呤堿基編輯器（adenine base edi?tor， ABE，圖1C）。除此之外，還有在CBE 基礎上開發(fā)的糖基化酶堿基編輯器（glycosylase base editor，GBE，圖1D）以及將2 種不同的單堿基編輯器融合形成的雙堿基編輯器（dual base editor）。

1）胞嘧啶堿基編輯器。2016 年報道的胞嘧啶堿基編輯器（CBE）是第1 個建立的基于CRISPR 的單堿基編輯系統(tǒng)［2］。在CBE 中，nCas9（D10A）與胞苷脫氨酶和尿嘧啶DNA 糖基化酶（uracil DNA glyco?sylase， UNG）抑制劑（uracil DNA glycosylase inhibi?tor， UGI）形成融合蛋白。在sgRNA 的引導下，融合蛋白定位到靶點序列，在編輯窗口內(nèi)直接誘導C/G變成T/A。為了提高CBEs 的編輯效率，CBEs 已經(jīng)歷了從CBE1 到CBE4 共4 代的發(fā)展。最初CBE1 是由大鼠胞苷脫氨酶（rAPOBEC1）和dCas9 組成，體內(nèi)編輯效率較低，僅有7.7%；CBE2 的體內(nèi)編輯效率高達20%；CBE3 的編輯效率是CBE2 的2～6 倍；而優(yōu)化后形成的CBE4 的編輯效率又比CBE3 提高了1.5 倍，并且C 到G 或A 和indel 出現(xiàn)的頻率大大降低［2］。

2）腺嘌呤堿基編輯器。腺嘌呤堿基編輯器（ABE）于2017 年首次報道［3］。理論上ABE 可以通過用腺苷脫氨酶代替胞苷脫氨酶來產(chǎn)生。然而自然界中沒有已知的酶可以使DNA 中的腺苷脫氨基。因此，科學家將大腸桿菌tRNA 腺苷脫氨酶（ecTa?dA）改造為脫氧腺苷脫氨酶（TadA*），可以使ssDNA上的腺苷脫氨基。接下來nCas9（D10A）與腺苷脫氨酶TadA*融合形成ABE 系統(tǒng)。ABE 可以直接誘導A：T 到G：C 的轉(zhuǎn)換。在這些ABE 系統(tǒng)中，ABE7.10被推薦用于A/T 到G/C 的轉(zhuǎn)換，其效果已在多種細胞和生物中得到驗證［3］。

3）糖基化酶堿基編輯器。糖基化酶堿基編輯器（GBE）于2020 年首次報道，是一種可以將C 轉(zhuǎn)換為A 或者G 的堿基編輯技術。GBE 由nCas9、胞苷脫氨酶和尿嘧啶DNA 糖基化酶（UNG）組成，該系統(tǒng)在sgRNA 的引導下定位到靶點序列，UNG 將胞苷脫氨酶產(chǎn)生的U 切除，形成一個誘導DNA 修復機制的無嘌呤/無嘧啶（apurinic/apyrimidinic， AP）位點。該位點啟動DNA 損傷修復，從而誘導C 轉(zhuǎn)換為A 或者G［4］。為了進一步提高GBE 的性能，研究人員在GBE 的基礎上構(gòu)建了APOBEC（R33A）-nCas9-Rad51-Ung1 的融合蛋白，并命名為GBE2.0。該編輯器能夠?qū)崿F(xiàn)更高的編輯效率（平均30.88%），同時C 到G 的轉(zhuǎn)換純度更高。

4）雙堿基編輯器。上述幾種單堿基編輯技術只能實現(xiàn)單一的堿基轉(zhuǎn)換，具有局限性。為了實現(xiàn)同時產(chǎn)生不同類型的堿基轉(zhuǎn)換，研究者開發(fā)出了雙堿基編輯技術（圖2A）。該編輯器可以同時誘導C 到T和A 到G 的堿基轉(zhuǎn)換。例如，Zhang 等［5］成功開發(fā)了一種nCas9（D10A）-NG 介導的高效胞嘧啶和腺嘌呤雙堿基編輯融合系統(tǒng)STCBE-2，并利用該系統(tǒng)對水稻OsEPSPS 基因編碼區(qū)和預測的草甘膦結(jié)合區(qū)域進行近飽和突變，獲得了高抗草甘膦的水稻新型基因資源。

1.3 先導編輯技術

先導編輯器（prime editor， PE）首次報道于2019年，它可以實現(xiàn)所有12 種堿基替換，特別是堿基顛換、精確插入和刪除，而無需依賴DSB 和供體DNA。PE 由nCas9（H840A）和逆轉(zhuǎn)錄酶形成的融合蛋白以及pegRNA（prime editing guide RNA）組成（圖2B）。pegRNA 包含2 個功能部分，sgRNA 靶定位序列和逆轉(zhuǎn)錄模板（reverse transcription template， RTT）。RTT 包括引物結(jié)合位點和編碼突變信息的位點。當PE 系統(tǒng)融合蛋白錨定到靶位點時，nCas9 切割非互補鏈，逆轉(zhuǎn)錄酶通過RTT 逆轉(zhuǎn)錄出相應的含突變位點的ssDNA，然后通過DNA 修復將突變整合到受體基因組中。為了提高其效率和準確性，研究者在PE的基礎上開發(fā)了PE2、PE3、PE3b3、PE4、PE5 和PEmax 共6 種編輯器［6］。最近，Sun 等［7］建立了一種在染色體上精確插入大片段DNA 的先導編輯技術PrimeRoot，能夠?qū)⒏哌_11.1 kb 的大片段DNA 精確插入植物基因組中，效率達到6.3%。

2 基因編輯技術在甘藍型油菜中的應用

2.1 CRISPR/Cas9 在甘藍型油菜中的應用

甘藍型油菜是一種經(jīng)濟價值高、用途廣泛的油料作物。CRISPR/Cas9 基因編輯技術可在甘藍型油菜中實現(xiàn)1 個或多個基因的有效突變，產(chǎn)生穩(wěn)定遺傳的突變體。后續(xù)通過雜交分離出無T-DNA 的基因編輯植株。目前油菜中的基因編輯主要是利用CRISPR/Cas9 進行基因功能的鑒定與優(yōu)異種質(zhì)資源創(chuàng)新［ 8］，包括油菜產(chǎn)量、含油量和脂肪酸組成、宜機收、粒色花色、開花時間和花發(fā)育、育性、營養(yǎng)成分、生物和非生物脅迫耐受性等性狀。

1）產(chǎn)量相關性狀。產(chǎn)量相關性狀一直是作物育種中重點關注的性狀之一，種子大小、每角果粒數(shù)和單株角果數(shù)與油菜產(chǎn)量密切相關。Yang 等［9］敲除了CLV-WUS 通路中的BnCLV1（CLAVATA1）、Bn?CLV2 和BnCLV3，每個基因均獲得了雙拷貝純合突變體。其中BnCLV3 的雙拷貝突變體每角果粒數(shù)和千粒重增加，可能有助于增加種子產(chǎn)量。Khan 等［10］敲除了BnEOD3（ENHANCER3 OF DA1）的4 個同源拷貝，觀察到突變體種子變小，每角果粒數(shù)增加，4拷貝突變體的單株產(chǎn)量平均提高了13.9%。Wang等［11］敲除了2 種調(diào)控花粉管引導性的天冬氨酸蛋白酶基因BnAP36s（ASPARTATE PROTEASES 36）和BnAP39s，突變體的結(jié)實率分別降低了50% 和60%，由此導致產(chǎn)量的降低。

株型，包括株高、分枝數(shù)和葉形等性狀，也是影響產(chǎn)量的相關性狀。Zheng 等［12］敲除BnMAX1（MORE AXILLARY GROWTH 1）獲得了分枝數(shù)增加的半矮化突變體。Stanic 等［13］敲除獨腳金內(nèi)酯受體基因BnD14 獲得了分枝數(shù)和花器官增加、植株矮化的突變體。Fan 等［14］敲除BnBP（BREVIPEDI?CELLUS）基因發(fā)現(xiàn)BnBP.A03 和BnBP.C03 突變后植株均變矮，株型變緊湊，它們的雙拷貝突變體極度矮化并且不育。Song 等［15］敲除BnBRI1（BRASSI?NOSTEROID INSENSITIVE 1）產(chǎn)生了半矮株系，但對產(chǎn)量無影響。甘藍型油菜存在廣泛的葉形多樣性，包括邊緣完整的不裂葉、邊緣鋸齒狀的淺裂葉以及裂葉。油菜的裂葉已被證實是高密度種植和雜交生產(chǎn)的理想性狀。Hu 等［16-17］通過敲除裂葉親本的BnA10.LMI1（LATE MERISTEM IDENTITY 1）和BnA10.RCO（REDUCED COMPLEXITY），產(chǎn)生了不裂葉和淺裂葉的突變體，驗證了BnA10.LMI1 和BnA10.RCO 正向調(diào)控甘藍型油菜葉形的發(fā)育。

2）含油量和脂肪酸組成。提高油菜種子含油量和改善脂肪酸組成一直是油菜育種的2 個關鍵目標。敲除BnSFAR4/5（SEED FATTY ACID REDUC?ER 4/5）、BnFAX1（FATTY ACID EXPORTER 1）和BnCIPK9 （CALCINEURIN B-LIKE INTER?ACTING PROTEIN KINASE 9）基因可以提高種子含油量［18-20］，而敲除BnLPAT2/5（LYSOPHOS?PHATIDIC ACID ACYLTRANSFERASE 2/5）和BnBASS2（BILE ACID SODIUM SYMPORTERFAMILY PROTEIN 2）種子含油量會降低［21-22］。脂肪酸組成是決定菜籽油品質(zhì)的關鍵因素，脂肪酸去飽和酶基因BnFAD2（FATTY ACID DESATU?RASE 2）是影響脂肪酸3 種主要成分油酸、亞油酸和亞麻酸組成和比例的關鍵基因。敲除BnFAD2 后種子中油酸的含量提高，亞油酸和亞麻酸的含量相應降低［23］。Yan 等［24］敲除BnLEC1（LEAFY COTY?LEDON 1）后，突變體種子含油量和油酸含量降低，亞油酸含量提高。磷酸烯醇丙酮酸/磷酸轉(zhuǎn)運蛋白（phosphoenolpyruvate/phosphate translocator， PPT）將磷酸烯醇丙酮酸從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到質(zhì)體中，用于脂肪酸（FA）和其他代謝物的生物合成。敲除BnPPT1后，植株生長緩慢，葉片變黃，種子含油量也下降了2.2%～9.1%［25］。

3）抗裂莢性狀。油菜角果成熟易開裂的特性是造成田間產(chǎn)量損失的主要原因。Braatz 等［26］敲除BnALC （ALCATRAZ）基因發(fā)現(xiàn)突變體角果抗裂。Zaman 等［27］敲除BnJAG （JAGGED）的5 個同源拷貝，發(fā)現(xiàn)其中BnJAG.A08 拷貝突變后角果抗裂性能提高了2 倍。Zhai 等［28］敲除BnIND （INDEHIS?CENT）的2 個同源拷貝，發(fā)現(xiàn)BnIND.A03 單拷貝突變體和BnIND.A03/C03 雙拷貝突變體的角果均顯著抗裂。Zaman 等［29］敲除BnSHP1/2 （SHATTER?PROOF1/2）的所有同源拷貝，其中BnSHP1.A09、BnSHP1. A04、BnSHP1. C04-A、BnSHP2. C04-B 和BnSHP2.A05 5 個拷貝突變體表現(xiàn)出明顯的角果抗裂性。

4）粒色、花色、葉色等色澤相關性狀。油菜的黃籽性狀是一種優(yōu)良表型，與黑籽相比，具有種皮薄、原花青素含量低、油脂和蛋白質(zhì)含量高的優(yōu)點。目前已知通過敲除類黃酮途徑的關鍵基因獲得黃籽突變體的基因有BnTT2 （TRANSPARENT TESTA2）、BnTT4、BnTT8 以及BnPAP2 （PRODUCTIONOF ANTHOCYANIN PIGMENT 2），上述突變體均可提高種子含油量并改善脂肪酸組成［30-33］。

油菜花具有重要的觀賞價值，花色是油菜遺傳育種中備受關注的問題。與黃籽性狀不同，甘藍型油菜的花色是由類胡蘿卜素含量決定的，敲除參與類胡蘿卜素生物合成的玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因BnZEP （ZEAXANTHIN EPOXIDASE），得到的Bna09.zep/Bnc09.zep 雙突變體呈現(xiàn)出橘色花瓣［34］。而敲除類胡蘿卜素異構(gòu)酶基因BnCRTISO（CA?ROTENOID ISOMERASE），得到花瓣乳白色、葉片淡黃色的突變體［35］。

葉色主要與葉綠體的發(fā)育相關，Liu 等［36］敲除參與葉綠體發(fā)育的基因BnYCO （YELLOWCOTYLEDON）后，其突變體子葉黃化、真葉失綠。Xu 等［37］敲除與光合系統(tǒng)PSⅡ周期修復循環(huán)有關的基因BnFtsH1，突變體子葉黃化、生物量積累降低。

5）開花時間和花發(fā)育。油菜開花時間不僅影響油菜產(chǎn)量，還會影響下茬作物的播期，因此適宜的花期也是油菜育種的重要目標。TERMINAL FLOW?ER 1（TFL1）是磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（phosphati?dylethanolamine-binding protein， PEBP）家族成員，在高等植物的花分生組織決定和開花時間調(diào)控中起重要作用。Sriboon 等［38］敲除BnTFL1 的5 個拷貝，發(fā)現(xiàn)只有BnC03.TFL1 的突變體具有早花表型。Ji?ang 等［39］敲除組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因BnS?DG8（ SET DOMAIN GROUP 8），發(fā)現(xiàn)BnSDG8.A/C 功能缺失突變體植株開花時間提前。Ahmar 等［40］敲除BnSVP（SHORT VEGETATIVE PHASE）的所有拷貝得到不同拷貝組合的突變體，開花時間平均縮短了40.6%～50.7%。COL9 （CONSTANSlike9） 作為鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，控制著許多不同植物的生長發(fā)育。Guo 等［41］敲除油菜BnCOL9的4 個拷貝，得到的突變體具有早花表型。Li 等［42］敲除BnSPL3 （SQUAMOSA PROMOTER BIND?ING PROTEIN-LIKE 3）后，突變體發(fā)育遲緩，開花延遲。

許多蕓薹屬作物的產(chǎn)量經(jīng)常受到花器官發(fā)育異常的阻礙。然而，這些異常花器官的分子機制尚不清楚。APETALA2 （AP2）作為植物ABCE 模型中的A 類基因，調(diào)控著花器官的發(fā)育。Zhang 等［43］敲除BnAP2，發(fā)現(xiàn)4 拷貝突變體出現(xiàn)萼片-心皮修飾表型。

6）育性。自交不親和（self incompatibility， SI）是雌雄同體被子植物通過排斥自交花粉來阻止近親交配的遺傳機制，自交不親和株系有利于雜種優(yōu)勢的利用。通過敲除BnMLPK （M-LOCUS PROTEINKINASE） 和BnARC1 （ARM-REPEAT-CON?TAINING PROTEIN 1），油菜自交不親和性被完全抑制，自花授粉后種子比野生型顯著增加［44］。與此相反的是，敲除BnA5.ZML1 和BnS6-SMI2 （SCRmethylation-inducing region 2），油菜自交不親和性增強［45-46］。

雄性不育是提高作物產(chǎn)量最有效的雜種優(yōu)勢技術之一。Xin 等［47］敲除BnMS5a （MALE STERILI?TY 5）或BnMS5c，均會導致雄性不育，證明恢復等基因MS5a 和維持等位基因MS5c 都是甘藍型油菜雄性育性所必需的。Farooq 等［48］敲除BnRFL11（RESTORATION OF FERTILITY-LIKE 11），bn?rfl11 表現(xiàn)出營養(yǎng)缺陷，包括分枝減少和葉片變小，同時也表現(xiàn)出雄性不育。細胞色素P450（ CYP450）單加氧酶超家族在植物生長發(fā)育中起著重要作用。Wang 等［49］敲除BnCYP704B1，編輯后的單株在成熟花藥中表現(xiàn)出無花粉、不育的表型。

7）營養(yǎng)成分。硫代葡萄糖苷（glucosinolates，GSLs）是一種抗營養(yǎng)因子，消除或降低油菜籽中硫苷的含量是提高飼料和食品價值的必要條件。敲除硫代葡萄糖苷轉(zhuǎn)運蛋白基因BnGTR2（ GLUCOSINO?LATE TRANSPORTER 2），種子硫苷含量顯著降低［50- 51］。植酸 （phytic acid， PA），同樣是一種抗營養(yǎng)因子。 Sashidhar 等［52］通過敲除PA 生物合成的關鍵基因BnITPK （INOSITOL TETRAKISPHOS?PHATE KINASE）的3 個拷貝，得到低植酸的突變體。生育酚，即維生素E，是人體健康必不可少的營養(yǎng)素。Zhang等［53］通過敲除BnVTE4（ VITAMIN EDEFICIENT 4），突變體的α-生育酚含量降低。

油菜在生長過程中會從土壤中吸收多種營養(yǎng)元素，營養(yǎng)元素在植物的生命代謝中各自有不同的生理功能，相互間是不可代替的。硼（B）在細胞壁形成、花粉管生長、膜完整性、固氮、糖轉(zhuǎn)運和植物代謝中起著關鍵作用。Feng 等［54］ 敲除BnA09.WRKY47，突變體對低硼脅迫更敏感，而BnA09.WRKY47 的過表達系對低磷脅迫耐受。甘藍型油菜是一種鎘（Cd）超富集植物，對食品和飼料安全構(gòu)成嚴重威脅。Yao 等［55］敲除BnCUP1 （Cd UPTAKERELATED1），突變體降低了油菜植株體內(nèi)鎘的積累。磷（P）缺乏是影響油菜根系生長發(fā)育的主要環(huán)境因素。Xu 等［56］敲除BnGPR1 （GLYCINE-RICHPROTEIN 1），突變體植株對低磷脅迫更敏感，但是過表達系表現(xiàn)出對低磷脅迫的耐受性。

8）生物和非生物脅迫耐受性。油菜在生長發(fā)育過程中會受到生物和非生物脅迫的考驗。油菜菌核病是油菜的一種重要病害，通常會導致5%～100%的田間產(chǎn)量損失。Sun 等［57］發(fā)現(xiàn)敲除BnWRKY70的3 個同源拷貝，突變體對菌核病的抗性增強。Cao等［58］ 敲除BnF5H （FERULATE-5-HYDROXY?LASE）后，突變體的莖桿強度增加，莖葉對菌核病的抗性增強。Zhang 等［59］編輯BnQCR8 的1 個或多個拷貝，獲得的突變體均對菌核病和灰霉病具有較強的抗性，并且主要的農(nóng)藝性狀與野生型沒有顯著差異。Geng 等［60］敲除BnIDA （INFLORESCENCEDEFICIENT IN ABSCISSION），突變體表現(xiàn)出角果抗裂、花器官不脫落、抗菌核病等優(yōu)良特性。Zhang等［61］ 敲除BnMPK3 （MITOGEN-ACTIVATEDPROTEIN KINASE 3）后，突變體菌核病抗性降低，但其過表達系對菌核病的抗性增強。Probsting 等［62］敲除BnCRT1a（ CALRETICULIN1a）后突變體降低了對黃萎病的敏感性。

油菜生長過程中大部分時期對缺水十分敏感，因此，培育抗旱油菜品種至關重要。Wu 等［63］敲除BnRGA （REGULATORS OF GA）的4 個拷貝，發(fā)現(xiàn)BnA06.RGA 的突變體BnA6.rga-D 抗旱性增強。Linghu 等［64］敲除U-box E3 泛素連接酶基因Bn?PUB18/19（ Plant U-box 18/19），突變體耐旱性顯著提高。而Liu 等［65］敲除BnSGI （STRESS ANDGROWTH INTERCONNECTOR）后，突變體對干旱脅迫變得更敏感。Song 等［66］敲除BnHOS1（HIGH EXPRESSION OF OSMOTICALLY RE?SPONSIVE GENES 1）增強了油菜耐寒性。

9）其他。擬南芥同源域轉(zhuǎn)錄因子STM（SHOOT MERISTEMLESS ）對于莖尖分生組織功能至關重要，它與CLV3 （ CLAVATA3）/WUS（WUSCHEL ）反饋調(diào)節(jié)通路配合維持莖尖分生組織中干細胞的穩(wěn)態(tài)。Yu 等［67］敲除BnSTM，突變體出現(xiàn)莖頂端發(fā)育異常、子葉柄融合的表型。通過敲除質(zhì)體核苷酸轉(zhuǎn)運蛋白基因BnNTT1 （NUCLEO?TIDE TRIPHOSPHATE TRANSPORTER 1）和BnNTT2，突變體均生長遲緩、類囊體發(fā)育異常以及光合效率低下［68- 69］。Wang 等［70］敲除淀粉分支酶基因BnSBE （STARCH BRANCHING ENZYMES） 6拷貝突變體中淀粉結(jié)構(gòu)改變。

2.2 CRISPR/Cas9 介導的其他編輯技術在甘藍型油菜中的應用

傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9 已成熟地用于甘藍型油菜基因功能研究和種質(zhì)資源創(chuàng)新，同時堿基編輯技術（CBE、ABE）以及病毒介導的定點插入等基于CRISPR/Cas9 的基因編輯技術也在甘藍型油菜中有成功應用。

Cheng 等［71］在甘藍型油菜中建立并開發(fā)了由人A3A 胞苷脫氨酶與Cas9 切口酶和尿嘧啶糖基化酶抑制劑融合組成的A3A-PBE 系統(tǒng)。設計了3 種sgRNA 分別靶向ALS （ACETOLACTATE SYN?THASE）、RGA和IAA7（ INDOLE-3-ACETIC AC?ID 7）基因。所有3 個目標基因的堿基編輯效率均超過20%。Hu 等［72］對4 個CBE 系統(tǒng)進行了改造，實現(xiàn)油菜中5 個靶基因的胞苷堿基編輯。結(jié)果表明，3 個CBE 系統(tǒng)都能實現(xiàn)基因組編輯，其中BnA3A1-PBE與之前報道的油菜CBE 系統(tǒng)相比，具有最高的堿基編輯效率（最高達50.5%）。BnA06.RGA 和BnALS靶位點發(fā)生的胞苷取代可穩(wěn)定遺傳，分別為矮化表型和用于雜草控制的除草劑抗性。Wu 等［73］利用CBE 編輯BnALS1 和BnALS3，但在T1 代僅得到BnALS1 的編輯單株，賦予了油菜苯磺隆抗性。

最近開發(fā)的腺嘌呤堿基編輯器（ABE）能夠在高等植物真核細胞中實現(xiàn)高效、精確的A 到G 的堿基轉(zhuǎn)換。Kang 等［74］證明ABE 系統(tǒng)可以通過瞬時轉(zhuǎn)染成功應用于擬南芥和甘藍型油菜的原生質(zhì)體，并通過農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化成功應用于植物。在FLOW?ERING LOCUS T（ FT）蛋白中進行A到G替換，產(chǎn)生單個氨基酸變化或PHYTOENE DESATU?RASE 3（ PDS3）的RNA轉(zhuǎn)錄本的錯誤剪接，從而獲得分別具有晚花和白化表型的轉(zhuǎn)基因植物。Hu等［75］改造了4 個ABE 骨架，分別針對BnPDS、BnALS 等9 個基因設計了18 個sgRNA 進行不同ABE 系統(tǒng)的效率測試，在甘藍型油菜中創(chuàng)建了有效的ABE 單堿基編輯系統(tǒng)。

油菜在種植過程中經(jīng)常受到雜草的影響，培育抗除草劑品種是應對雜草威脅的有效途徑。草甘膦對大面積的雜草防治非常有效，對環(huán)境的危害很小。但由于其對油菜的毒性，很少直接用于油菜田。研究表明，在不同植物中，烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）的草甘膦結(jié)合位點突變賦予了對草甘膦的抗性。Wang 等［76］為了在甘藍型油菜中實現(xiàn)有效的基因替換，采用了表達由來自銅綠假單胞菌的CRIS?PR 相關RNA 內(nèi)切核糖核酸酶Csy4 切割的單鏈引導RNA（sgRNA）的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，在內(nèi)源性甘藍型油菜EPSPS 基因BnC04.EPSPS 中實現(xiàn)了精確的基因替換，氨基酸替換頻率高達20%。含有這些基因替換的油菜苗具有較強的草甘膦耐受性。

綜上所述，目前已有大量研究利用CRISPR/Cas9 技術及其介導的ABE 和CBE 技術進行油菜基因功能鑒定與優(yōu)異種質(zhì)資源創(chuàng)新，從多個方面改良了油菜種質(zhì)資源，我們從產(chǎn)量等9 個方面進行分類和匯總（表1）。

3 展望

CRISPR/Cas9 基因編輯技術顯示出強大的、特異的、多重基因組編輯的能力，已廣泛用于油菜重要性狀的基礎研究和遺傳改良。但CRISPR/Cas9 基因編輯技術的潛力遠遠不止這些，未來該技術在油菜中應該會有更廣闊的應用前景。

3.1 采用更加精確且多功能的基因編輯工具

CRISPR/Cas9 基因編輯技術雖然在油菜中已經(jīng)建立了成熟的體系，但是大部分在油菜中的應用都是產(chǎn)生功能缺失突變體。然而許多有價值的性狀是由單核苷酸多態(tài)性或者是精確設計的indel 賦予的。因此，利用遺傳多樣性和精確修改基因組對于作物育種非常重要。到目前為止，除了CBE 和ABE 在油菜上有初步應用外，其他精確的基因編輯例如GBE、雙堿基編輯以及先導編輯PE 均未在油菜中成功實現(xiàn)。如果能將這些精確且多功能的技術應用于油菜中，將會極大地提高基因編輯對油菜遺傳改良的有效性。

3.2 突破油菜遺傳轉(zhuǎn)化受體限制

目前為止，CRISPR/Cas9 在油菜中的應用主要依靠農(nóng)桿菌介導的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化來傳遞CRISPR 載體。然而，一些優(yōu)良的甘藍型油菜品種往往由于缺乏適合再生的性狀而不易轉(zhuǎn)化。目前報道的農(nóng)桿菌介導遺傳轉(zhuǎn)化的油菜品種有春性品種和半冬性品種，其中春性品種有Westar、862、Haydn 等，半冬性品種有J9707、J9712、ZS6 等。除此之外，對于那些難以轉(zhuǎn)化的商品油菜品種，可以通過利用形態(tài)發(fā)生基因打破遺傳轉(zhuǎn)化的受體限制，玉米中已經(jīng)成功利用形態(tài)發(fā)生基因WUS2 和BBM 實現(xiàn)了穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化。在過去的30 a 里，基礎研究為我們提供了關于控制形態(tài)發(fā)生基因的詳細資料。這些見解將繼續(xù)為測試形態(tài)發(fā)生基因提供靈感，并與控制表達的新方法一起，將導致不斷改進，擴大適合轉(zhuǎn)化的不同油菜品種的范圍。此外，組織培養(yǎng)過程通常在技術上要求很高，耗時且費力。因此，開發(fā)無需組織培養(yǎng)的遞送方法，如納米顆?；虿《具f送，將有助于進一步擴大CRIS?PR/Cas9 在油菜中的應用。

3.3 利用CRISPR/Cas9 在油菜中構(gòu)建全基因組突變體文庫

CRISPR/Cas9 技術的高效率非常適合在各種生物體和細胞類型中進行高通量基因編輯。由于CRISPR/Cas9 的靶向特異性是由1 個20 bp 的sgRNA 賦予的，因此可以很容易地大規(guī)模地基于陣列合成寡核苷酸文庫。這種強大的基因組級CRIS?PR/Cas9 誘變系統(tǒng)已經(jīng)成功地用于水稻和玉米的研究。例如，Lu 等［77］利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在水稻中進行基因組規(guī)模的誘變，并生成了靶向功能缺失突變體文庫，為水稻研究和育種提供了有用的資源。Liu 等［78］將基于CRISPR/Cas9 的多重高通量靶向誘變與遺傳定位和基因組學方法相結(jié)合，成功靶向了743 個與農(nóng)藝和營養(yǎng)性狀相關的候選基因。最近，He等［79］使用CRISPR 混合文庫在甘藍型油菜異源四倍體作物中實現(xiàn)基因組規(guī)模的靶向編輯，總共設計了18 414 個sgRNA 來靶向10 480 個感興趣的基因，隨后獲得了1 104 株含有1 088 個sgRNA 的再生轉(zhuǎn)基因植物，編輯結(jié)果顯示，178 個基因中有93 個被鑒定為突變，編輯效率為52.2%。由此可見，利用CRISPR/Cas9 實現(xiàn)高通量的靶向基因編輯，篩選大規(guī)模突變文庫，將是發(fā)現(xiàn)改善油菜品種目標性狀新基因的良好途徑。

3.4 基因編輯技術應用的前提條件和限制因子

雖然CRISPR/Cas9 基因編輯技術以其簡單、高效的獨特優(yōu)勢被廣泛應用于油菜的基因功能研究和遺傳改良，但是關于基因編輯技術的使用并非毫無限制。其使用的前提條件，一是需要對目標基因組有深入的了解，包括基因的功能和調(diào)控機制；二是需要嚴格的實驗條件和操作規(guī)范，以確保基因編輯的準確性和安全性。

基因編輯技術并不是萬能的，它同樣具備一些限制因子：（1）細胞類型和組織的可編輯性。不同類型的細胞和組織基因編輯的可行性不同，有些細胞和組織基因編輯的效率較低；（2）基因編輯的準確性和安全性?；蚓庉嬁赡苊媾R脫靶風險或其他不良影響，需要確保編輯的準確性和安全性；（3）道德和倫理問題?；蚓庉嬌婕暗缴瓦z傳信息的改變，需要考慮道德和倫理問題，以及相關的法律法規(guī)。