關(guān)鍵詞 葡萄； 根際細(xì)菌； 細(xì)菌群落； 淹水脅迫； 高通量測(cè)序

葡萄（Vitis L.）是世界上最重要的果樹之一，栽培歷史悠久［1］。改革開放以來(lái)，我國(guó)葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，鮮食葡萄產(chǎn)量和栽培面積位于世界前列，滿足人們對(duì)美好生活向往的需求，助力鄉(xiāng)村振興和精準(zhǔn)扶貧［2］。巨峰葡萄（Vitis labrusca × Vitis vinifera‘Kyoho’）原產(chǎn)日本，親本是大?？蛋轄柡蜕锬幔俏覈?guó)栽培面積最廣的葡萄品種［3］。巨峰葡萄具有適應(yīng)性強(qiáng)、抗病耐寒、易管理等特點(diǎn)，其果實(shí)色澤艷麗、口感豐富、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，深受果農(nóng)和消費(fèi)者的喜愛(ài)。

我國(guó)地處亞洲東部，夏季高溫多雨，近幾年暴雨肆虐東亞，洪澇災(zāi)害已經(jīng)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上不可小視的災(zāi)害之一。2021年我國(guó)多地遭遇罕見暴雨暴風(fēng)，加上部分葡萄園區(qū)的排灌系統(tǒng)不良，造成了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失［4］。研究發(fā)現(xiàn)，在淹水脅迫下植物會(huì)通過(guò)自身的生長(zhǎng)和生理特性來(lái)適應(yīng)逆境，如新梢生長(zhǎng)量降低、光合能力降低、有機(jī)物合成受阻等［5］。植物也會(huì)采用多種防御機(jī)制來(lái)降低淹水脅迫對(duì)自身造成的損傷，如誘發(fā)不定根、形成通氣組織、加強(qiáng)莖葉伸長(zhǎng)生長(zhǎng)以保障氣體交換、啟動(dòng)抗氧化響應(yīng)系統(tǒng)、誘導(dǎo)積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、改變呼吸代謝途徑等，以適應(yīng)水淹逆境［6］。

微生物根據(jù)形態(tài)和結(jié)構(gòu)可分為細(xì)菌、放線菌、真菌、藻類和原生動(dòng)物5 種。淹水脅迫導(dǎo)致土壤處于缺氧或無(wú)氧的環(huán)境中，影響了土壤中的微生物群落，使得細(xì)菌成為主要的優(yōu)勢(shì)種群［7］。除通過(guò)自身響應(yīng)淹水脅迫外，植物根系能通過(guò)調(diào)節(jié)土壤細(xì)菌的組成來(lái)提高自身的抗逆性。比如在野燕麥發(fā)育過(guò)程中，土壤微生物對(duì)根系分泌物（如氨基酸）存在偏好性，某些代謝物有調(diào)節(jié)劑的功能，如水楊酸使植物產(chǎn)生抗性，從而抑制有害微生物［7］。植物與細(xì)菌相互作用的過(guò)程中，死亡或者脫落的植物組織能改善根際土壤的理化性質(zhì)；根系的分泌物可為細(xì)菌的生長(zhǎng)提供有利條件［8］。根際細(xì)菌的活動(dòng)也能對(duì)植物造成較大的影響。植物生長(zhǎng)促進(jìn)型根際細(xì)菌（plant growth pro?moting rhizobacteria，PGPR）通過(guò)多種作用機(jī)制參與植物的抗逆性調(diào)控［9］，如在鹽堿脅迫下，根際細(xì)菌可通過(guò)調(diào)節(jié)根系的離子穩(wěn)態(tài)等過(guò)程改善植物抗逆性［10］。

許多細(xì)菌都具備參與調(diào)控植物耐澇性的可能，本研究以巨峰葡萄為試材，通過(guò)盆栽試驗(yàn)法模擬淹水情況，運(yùn)用16S rRNA 高通量測(cè)序分析淹水脅迫下巨峰葡萄根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成的差異，探討巨峰葡萄根際細(xì)菌和耐澇性的關(guān)系，旨在為根際細(xì)菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用和推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以四川省樂(lè)山市夾江縣新生村葡小萄農(nóng)場(chǎng)的4年生巨峰葡萄為供試材料。試驗(yàn)地點(diǎn)位于四川省樂(lè)山市樂(lè)山師范學(xué)院（103°44′58″E，29°33′34″N）致遠(yuǎn)樓附近的大棚內(nèi)，海拔344.6 m。土壤類型為紫色沖積土，pH 6.0，有機(jī)質(zhì)含量15.12 g/kg，速效氮含量125.38 g/kg，有效磷含量36.65 g/kg，速效鉀含量160.82 g/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

于2020 年12 月，收集巨峰葡萄生長(zhǎng)健壯的1 年生枝條沙藏，2021 年3 月修剪成長(zhǎng)約為15 cm 的插穗，僅保留1 個(gè)頂芽。將土壤平均分裝到各個(gè)24cm×22 cm 的塑料培養(yǎng)盆，把巨峰葡萄枝條扦插移栽到盆中，根系處于距土表10～15 cm 處，進(jìn)行正常栽培管理。選擇12 盆正常生長(zhǎng)到8 片展開葉、長(zhǎng)勢(shì)良好、生長(zhǎng)旺盛的巨峰葡萄為試驗(yàn)材料，隨機(jī)選擇3盆做正常澆水的對(duì)照組，剩余9 盆分別放入3 個(gè)70 cm×49 cm×38 cm 的塑料水箱中進(jìn)行為期21 d的淹水脅迫，淹水期間保證水面位于盆沿之上3 cm，定期補(bǔ)水到線。分別在第0、14、21 天和恢復(fù)7 d 后的第28 天進(jìn)行根際土采樣，采樣方法參照云鵬［11］的抖根法但進(jìn)行了一定的改進(jìn)，用75% 乙醇給錫紙消毒，取出植物根系，把大土塊剝落，根系在錫紙上抖動(dòng)，抖落的土為根際土，用藥匙將根際土放入無(wú)菌離心管中，分別記為對(duì)照組K0R（Kyoho-flooded for 0day-rhizosphere soil）、淹水組，K14R（Kyoho-floodedfor 14 day-rhizosphere soil）和K21R（Kyoho-floodedfor 14 day-rhizosphere soil）、恢復(fù)組K28R（Kyohodrainageand recovered for 7 days after flooded for 21days-rhizosphere soil）；并在14 d 時(shí)取培養(yǎng)盆中部無(wú)根區(qū)域的土（根外土）記為淹水組K14B（Kyohofloodedfor 14 days-bulk soil），取出的土樣裝入離心管，并放入液氮中低溫冷凍。樣品委托北京擎科生物科技股份有限公司使用 16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)土壤細(xì)菌進(jìn)行測(cè)序與分析。另外，于第28 天準(zhǔn)備4 盆巨峰葡萄淹水處理21 d、恢復(fù)7 d，觀測(cè)其長(zhǎng)勢(shì)和存活率。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

采用Omega Bio-tek 公司（Norcross，GA，U.S.）的E.Z.N.A.? Soil DNA Kit 試劑盒提取巨峰葡萄根際細(xì)菌的總DNA。隨后，通過(guò)1% 的瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000 分光光度計(jì)對(duì)提取的DNA 進(jìn)行濃度和純度的測(cè)定［12］。以提取的DNA 作為模板，利用引物338F（ 序列為5′-ACTCCTACGGGAG?GCAGCAG-3′）和806R（序列為5′-GGACTACH?VGGGTWTCTAAT-3′）對(duì)土壤細(xì)菌的16S rRNA基因V3～V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。最終，利用Illumina公司的MiSeq PE300 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用QIIME 軟件處理原始序列數(shù)據(jù)［13］，進(jìn)行操作單元（operational taxonomic units，OTUs ）的聚類分析［14］，計(jì)算Alpha 多樣性指數(shù)并進(jìn)行分析，通過(guò)主坐標(biāo)分析進(jìn)行Beta 多樣性分析，使用PICRUSt2 軟件推測(cè)樣本中細(xì)菌的功能基因組成［15］。

2 結(jié)果與分析

2.1 淹水脅迫下巨峰葡萄的形態(tài)變化

如圖 1 所示，淹水期間，對(duì)照組生長(zhǎng)旺盛，葡萄未出現(xiàn)葉片黃化以及脫落的現(xiàn)象；淹水組葡萄葉片大量脫落，生長(zhǎng)受到抑制，沒(méi)有死亡，但在排水恢復(fù)期間，淹水組葡萄大量死亡，存活率僅為25%。經(jīng)過(guò)21 d 淹水脅迫和7 d 排水恢復(fù)，淹水組形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，葉片受害程度嚴(yán)重，幾乎完全黃化，甚至出現(xiàn)了枯萎脫落的現(xiàn)象。

2.2 巨峰葡萄根際與根外細(xì)菌群落OTUs 分析

4 個(gè)處理中，K21R 的OTU 數(shù)最多（圖2A）。K0R、K14R、K21R、K28R 根際細(xì)菌的OTU 數(shù)分別為2 152、2 199、2 200、2 199 ，4 個(gè)處理中只有淹水組（K14R）有2 個(gè)特異OTUs。與K0R 相比，K14R、K21R、K28R 分別發(fā)現(xiàn)特有的OTUs 數(shù)57、63 、57；K21R 和K28R 特有OTUs 分別為13 和14 個(gè)。植物恢復(fù)7 d 后，同樣有根際細(xì)菌種類消失或出現(xiàn)的情況。K14R 與K14B 這2 個(gè)處理土壤細(xì)菌的OTUs 分別為2 199、2 108，共有的OTUs 為2 105，根際淹水組（K14R）和根外淹水組（K14B）特有的OTUs 分別為94、3（圖2B）。結(jié)果表明，在淹水脅迫期間會(huì)出現(xiàn)一些特異根際細(xì)菌，也有部分土壤細(xì)菌消失，隨著淹水脅迫的進(jìn)行，消失的根際細(xì)菌種類會(huì)增加。

2.3 淹水脅迫對(duì)巨峰葡萄根際細(xì)菌群落的Alpha多樣性的影響

由表1 可見，淹水脅迫對(duì)巨峰葡萄根系細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響，K14R 處理下細(xì)菌的多樣性指數(shù)（Simpson、Shannon）比K0R 顯著增高（Plt;0.05），但豐度指數(shù)（Chao1、ACE）無(wú)顯著變化。K21R 的豐度指數(shù)（Chao1、ACE）比K0R 極顯著增高（Plt;0.01）。淹水脅迫極顯著提高（Plt;0.01）細(xì)菌的豐度指數(shù)（Chao1、ACE），尤其在淹水脅迫第21 天（K21R）時(shí)，細(xì)菌的豐度指數(shù)（Chao1、ACE）極顯著增加（Plt;0.01）；細(xì)菌多樣性指數(shù)（Simpson、Shannon）先增加后降低，說(shuō)明是巨峰葡萄根系使細(xì)菌群落分布不均勻最終導(dǎo)致多樣性降低。

恢復(fù)處理對(duì)巨峰葡萄根系細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也有顯著的影響（表1），K28R 的豐度指數(shù)（Chao1、ACE）比K21R 極顯著增加（Plt;0.01）。K28R 與K0R 比豐度指數(shù)（Chao1、ACE）極顯著增加（Plt;0.01），K28R 細(xì)菌的多樣性指數(shù)（Simpson、Shannon）與K0R 比顯著降低（Plt;0.05）。說(shuō)明淹水脅迫對(duì)巨峰葡萄根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有較大的影響，恢復(fù)7 d，根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)無(wú)較大變化，但無(wú)法恢復(fù)到K0R 水平。

2.4 淹水脅迫對(duì)巨峰葡萄土壤細(xì)菌群落β 多樣性的影響

圖3 顯示，4 組處理中，K0R 與其他3 組細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。除K0R 外，其余3 個(gè)處理分別在不同的象限，說(shuō)明淹水脅迫顯著改變了根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，淹水脅迫后進(jìn)行恢復(fù)處理也無(wú)法使根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)恢復(fù)到K0R 的水平。K0R 與K21R 距離最遠(yuǎn)，說(shuō)明淹水時(shí)間越長(zhǎng)，根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異越大。從圖3B 可以看出，K14R 和K14B 相隔較遠(yuǎn)，說(shuō)明2 組的群落組成有較大的差異。說(shuō)明根系對(duì)淹水土壤中細(xì)菌的群落組成有較大影響。

2.5 淹水脅迫對(duì)巨峰根際細(xì)菌群落組成的影響

由圖4 可見，最優(yōu)勢(shì)菌門始終是變形菌門（Pro?teobacteria），相對(duì)豐度為33.83%～49.12%，其他各菌門的相對(duì)豐度大小依次為：酸桿菌門（Acidobacte?ria，12.72%）、綠彎菌門（Chloroflexi，11.80%）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，8.23%）、放線菌門（Ac?tinobacteria，6.72%）、厚壁菌門（Firmicutes，6.27%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，3.76%）、Latescibacteria（2.21%）、浮霉菌門（Planctomycetes，1.78%）、棒狀桿菌門（Rokubacteria，1.64%）。K0R 和淹水組（K14R、K21R）變形菌門分別減少1.47%、4.56%，說(shuō)明淹水脅迫對(duì)變形菌門的生長(zhǎng)有抑制作用。K14R和K21R 的厚壁菌門、擬桿菌門、Latescibacteria、浮霉菌門相對(duì)豐度高于K0R，淹水脅迫對(duì)這些菌門相對(duì)豐度有促進(jìn)作用。占比最高的變形菌門在K21R 與K28R 中極顯著增加了15.29%（Plt;0.01），說(shuō)明淹水脅迫后的恢復(fù)處理對(duì)變形菌門細(xì)菌有促進(jìn)作用。

2.6 巨峰根際細(xì)菌群落的LEfse 分析

LEfse 分析（LDAgt;4.0）結(jié)果顯示，從門到屬水平，共有10 個(gè)物種間存在顯著差異，共有2 綱、2 目、2科、2 屬、2 種（圖5A）。其中K28R 存在組間顯著差異的個(gè)數(shù)最多，有8 個(gè)；K21R 最少，有2 個(gè)。屬水平（圖5B），硫桿菌屬（Thiobacillus）在K21R 的相對(duì)豐度顯著低于K28R（Plt;0.05）。

2.7 巨峰葡萄根際細(xì)菌功能基因預(yù)測(cè)分析

K0R 和K14R 根際細(xì)菌的糖代謝功能基因差異顯著（Plt;0.05），K14R 根際細(xì)菌的糖代謝水平顯著上升（圖6A）。K0R 和K28R 根際細(xì)菌的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、免疫系統(tǒng)、細(xì)菌傳染病、信號(hào)傳導(dǎo)、內(nèi)分泌和代謝疾病的功能基因差異顯著（Plt;0.05）（圖6B）。K28R 根際細(xì)菌的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、免疫系統(tǒng)、細(xì)菌傳染病、信號(hào)傳導(dǎo)、內(nèi)分泌和代謝疾病功能基因顯著上升。K14R 和K28R 根際細(xì)菌的萜類和聚酮類化合物的代謝、循環(huán)系統(tǒng)、細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡、神經(jīng)退行性疾病、環(huán)境適應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)代謝、細(xì)胞移動(dòng)性、糖代謝、物質(zhì)依賴功能基因差異顯著（Plt;0.05）（圖6C）。其中K28R根際細(xì)菌的內(nèi)分泌代謝疾病、病毒傳染病、循環(huán)系統(tǒng)、細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡、神經(jīng)退行性疾病、環(huán)境適應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞移動(dòng)性功能基因顯著增加；萜類和聚酮類化合物的代謝、脂質(zhì)代謝、糖代謝和物質(zhì)依賴性功能基因顯著降低。

3 討論

高彥婷等［16］研究發(fā)現(xiàn)，水分脅迫使葡萄根際細(xì)菌群落OTUs、豐度指數(shù)和多樣性提高，且水分脅迫對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響都具有一定的滯后性和延續(xù)性。研究發(fā)現(xiàn)，在淹水脅迫下植物根際細(xì)菌群落OTUs 增大，豐度增大，多樣性指數(shù)先增后降。這可能是由于某種菌群（如厚壁菌門）大量繁殖，導(dǎo)致其特定菌群豐度升高［17］。劉璐等［18］研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌豐度與多樣性變化不一致。本研究中根際土壤細(xì)菌的豐富度高于根外土壤，隨著淹水脅迫的持續(xù)，根際細(xì)菌群落的多樣性逐漸增加，生態(tài)功能不斷增強(qiáng)，這更有利于植物抵御不良環(huán)境［19］。研究表明，變形菌門始終為最優(yōu)勢(shì)菌門，與前人的研究一致［20］。

高敏敏等［17］研究發(fā)現(xiàn)灰化薹草和虉草淹水脅迫后期，植物代謝受到嚴(yán)重抑制，無(wú)法產(chǎn)生足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)滿足細(xì)菌的生長(zhǎng)需要，此時(shí)，有害細(xì)菌可以大量生長(zhǎng)繁殖、產(chǎn)生有毒物質(zhì)，加重對(duì)植物的傷害。本研究發(fā)現(xiàn)巨峰葡萄耐澇能力較差，在淹水21 d 未死亡，淹水后恢復(fù)期間，巨峰葡萄大量死亡，而硫桿菌屬在恢復(fù)組（K28R）顯著增加。有研究表明硫桿菌屬會(huì)產(chǎn)生有毒物質(zhì)（H2S），對(duì)植物根系產(chǎn)生毒害作用［21］。

植物主要通過(guò)地下碳沉積促進(jìn)根系相關(guān)的微生物繁衍并募集特定微生物類群，而這些被招募的微生物會(huì)通過(guò)共生或致病的方式影響植物生長(zhǎng)［22］。研究發(fā)現(xiàn)巨峰葡萄根系細(xì)菌糖類、脂質(zhì)、萜類和聚酮類等代謝在淹水脅迫或脅迫恢復(fù)期間發(fā)生顯著的變化。在淹水脅迫14 d 根際細(xì)菌群落的糖代謝物顯著增加，植物根系通過(guò)碳水化合物招募細(xì)菌抵御非生物脅迫，在淹水后恢復(fù)期間，根系活性不足，細(xì)菌糖代謝物顯著減少。本研究發(fā)現(xiàn)K28R 根際細(xì)菌比K14R 根際細(xì)菌中萜類和聚酮類化合物顯著減少，可能在增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的防護(hù)上有著重要作用［23］。此外脂質(zhì)作為植物的活性物質(zhì)、結(jié)構(gòu)物質(zhì)和信號(hào)分子在逆境脅迫下具有重要的調(diào)控和保護(hù)作用［7］。本研究淹水后恢復(fù)期間，脂質(zhì)代謝物顯著減少，可能由于長(zhǎng)期淹水脅迫造成結(jié)構(gòu)被破壞，這可能與響應(yīng)淹水脅迫有關(guān)。表明脂質(zhì)、萜類和聚酮類等代謝物在調(diào)控巨峰葡萄響應(yīng)淹水脅迫的過(guò)程中，行使了一定的生物學(xué)功能。解析淹水脅迫下根際微生物表達(dá)調(diào)控和抗淹水的機(jī)制，對(duì)了解植物在水淹環(huán)境下的適應(yīng)能力具有十分重要的科學(xué)價(jià)值。

本研究表明淹水脅迫影響了巨峰葡萄根際細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，短期淹水脅迫使根際細(xì)菌代謝物發(fā)生改變以應(yīng)對(duì)逆境脅迫；但長(zhǎng)時(shí)間淹水使植物代謝發(fā)生紊亂，導(dǎo)致潛在有害細(xì)菌類群的豐度增加，植物有益菌群減少。在淹水脅迫恢復(fù)后，硫桿菌屬細(xì)菌顯著增加，其分泌產(chǎn)物對(duì)植物響應(yīng)淹水脅迫有不利影響。淹水脅迫導(dǎo)致根際細(xì)菌糖代謝物顯著增加，脅迫后恢復(fù)根際細(xì)菌糖類、脂質(zhì)、萜類和聚酮類等化合物顯著減少。脂質(zhì)、萜類和聚酮類等化合物可能與植物抗氧化、抗?jié)B透等功能顯著相關(guān)。