文章編號：1671-3559（2024）06-0721-09DOI：10.13349/j.cnki.jdxbn.20240524.004

摘要： 為了探究β1， 4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1（β4GalT1）在氣道平滑肌細胞中的功能，通過高通量基因表達數(shù)據(jù)庫（GEO）分析β4GalT1在氣道平滑肌細胞炎癥反應(yīng)存在功能，采用脂多糖刺激氣道平滑肌細胞后檢測白介素1β及β4GalT1的表達； 采用慢病毒包裝構(gòu)建過表達β4GalT1的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞，并利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞中炎癥相關(guān)細胞因子表達隨時間的變化，同時通過細胞增殖實驗、 細胞周期和劃痕實驗檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞的生物學(xué)行為變化，研究過表達β4GalT1的細胞分泌液在調(diào)節(jié)細胞因子表達過程中的作用。結(jié)果表明： 脂多糖能引起白介素1β及β4GalT1的表達量增加； 隨著培養(yǎng)時間的延長，過表達β4GalT1的細胞中促炎因子表達量減小，抑炎因子表達量增加，同時過表達β4GalT1可改變氣道平滑肌細胞的增殖、 遷移行為，進而起到炎癥修復(fù)功能； 過表達β4GalT1的細胞可通過分泌液調(diào)節(jié)細胞因子的表達，表明β4GalT1能快速響應(yīng)對氣道平滑肌細胞的炎癥刺激，并通過分泌物質(zhì)調(diào)節(jié)氣道平滑肌細胞的細胞行為及細胞因子變化。

關(guān)鍵詞： 糖生物學(xué)； 抑炎作用； β1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1； 氣道平滑肌細胞； 細胞行為

中圖分類號： Q555+.4

文獻標志碼： A

Effects of β1，4-Galactosyltransferase 1 on Inflammatory Response of Airway Smooth Muscle Cells

ZHANG Saishuaia，b， ZHANG Xuerua，b， SHI Ruib，c， GUO Jiab，c， DENG Linhongb，c

（a. School of PharmacySchool of Biological and Food Engineering， b. School of Medical and Health Engineering，

c. Institute of Biomedical Engineering and Health Sciences， Changzhou University， Changzhou 213164， Jiangsu， China）

Abstract： To explore the function of β1， 4-galactosyltransferase 1（β4GalT1） in airway smooth muscle cells， the function of β4GalT1 in the inflammatory response of airway smooth muscle cells was analyzed through Gene Expression Omnibus（GEO） database， and the expression of interleukin 1β and β4GalT1 after stimulating airway smooth muscle cells with lipopolysaccharide was detected. Lentivirus packaging was usedtoconstructstablecellsoverexpressingβ4GalT1，andreal-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction was used to detect the changes in the expression of inflammatory cytokines in stable cells over time， and cell proliferation assay， cell cycle assay and scratch assay were used to detect the biological behavior changes of stable cells， and the role of cell secretions overexpressing β4GalT1 in regulating cytokine expression was researched. The results show that lipopolysaccharide increases the expression of interleukin 1β and β4GalT1. With the increase of culture time， the expression of pro-inflammatoryfactordecreasesandtheexpressionofanti-inflammatoryfactorincreasesinthecells overexpressing β4GalT1.Meanwhile，theoverexpressionofβ4GalT1canchange the proliferation and migration behavior of airway smooth muscle cells， and play a role in inflammation repair. Cells of overexpress β4GalT1 can regulate cytokine expression through secretory fluid， which suggest that β4GalT1 can rapidly respond to inflammatory stimulation of airway smooth muscle cells， and regulate the cell behavior and cytokine changes of airway smooth muscle cells by secreting substances.

Keywords： glycobiology; anti-inflammatory effect; β1，4-galactosyltransferase1;airwaysmoothmusclecell;cellbehavior

β1， 4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1（β4GalT1）是一種廣泛分布于生物體中的糖基轉(zhuǎn)移酶， 主要負責(zé)將高爾基體中的UDP-半乳糖（UDP-Gal）以β1， 4鍵催化連接到N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）上，形成含Gal β1→4 GlcNAc糖鏈結(jié)構(gòu)的糖蛋白、 糖脂等糖復(fù)合物，參與多種生理病理活動［1］。一方面，有研究［2-4］發(fā)現(xiàn)，在大鼠的中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)過程中，以及在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［5］、 結(jié)腸炎［6］等炎性疾病中，β4GalT1的表達與炎癥的發(fā)生具有顯著的相關(guān)性。通過對大鼠腹腔注射脂多糖誘發(fā)炎癥，在包括肺、 心、 脾、 腎、 淋巴結(jié)等重要器官中均檢測出β4GalT1的高表達［7］。由此可見，β4GalT1的高表達在大鼠的各種類型的炎癥反應(yīng)中具有普遍意義。另一方面，通過在人體內(nèi)表達工程化的β4GalT1和α2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶1（ST6Gal1），可顯著降低系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎造成的自身炎癥反應(yīng)［8］。在小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥研究中也發(fā)現(xiàn)，過表達β4GalT1可通過影響過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）的糖基化，從而抑制小神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的炎癥激活［9］，但其在炎癥反應(yīng)發(fā)生過程中的功能尚不明確。

哮喘是以氣道炎癥反應(yīng)為主要特征的慢性呼吸系統(tǒng)疾病， 但其發(fā)病機制復(fù)雜， 導(dǎo)致該病至今仍無法完全治愈。 目前常用于哮喘控制的藥物有糖皮質(zhì)激素、 β2-受體激動劑等， 這些藥物主要通過抗炎作用使哮喘維持臨床控制［10］。氣道平滑肌細胞（ASMC）是哮喘發(fā)生的主要效應(yīng)細胞，不僅能在炎癥因子或神經(jīng)遞質(zhì)作用下發(fā)生舒張和收縮，還能通過釋放各種炎癥因子和細胞因子促使炎癥反應(yīng)的持續(xù)，最終導(dǎo)致氣道重塑［11-12］。β4GalT1是否也影響了ASMC的炎癥反應(yīng)，從而在哮喘病理過程中發(fā)揮功能，目前尚未有研究報道。

本文中首先通過挖掘基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（GEO）探索β4GalT1表達水平與氣道炎癥發(fā)生的關(guān)聯(lián)，同時通過脂多糖（LPS）刺激ASMC后檢測炎癥因子及β4GalT1的表達變化，建立β4GalT1表達與ASMC發(fā)生炎癥反應(yīng)的相關(guān)性；然后通過在ASMC中過表達β4GalT1構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株（簡稱穩(wěn)轉(zhuǎn)株），檢測過表達β4GalT1細胞的炎癥因子表達水平變化以及細胞增殖、周期和遷移的行為變化；最后探究過表達β4GalT1穩(wěn)轉(zhuǎn)株的細胞分泌液在調(diào)節(jié)細胞因子表達過程中的作用，為進一步探討β4GalT1在氣道炎癥反應(yīng)中的功能提供新的線索。

1材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1試劑與設(shè)備

細胞培養(yǎng)試劑包括低葡萄糖Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）、 高葡萄糖DMEM、 胎牛血清（FBS）、 青霉素-鏈霉菌雙抗、 減血清培養(yǎng)基（Opti-MEM）培養(yǎng)基和胰酶［不含乙二胺四乙酸（EDTA）］，購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

其他相關(guān)試劑包括： 核糖核酸（RNA）提取試劑RNAiso plus，購自日本Takara公司； 轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 3000、 P3000TM、 反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid RT Kit和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）試劑盒PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix，購自美國Thermo Fisher Scientific公司； 蛋白免疫印跡一抗試劑β4GalT1，購自英國Abcam公司； 蛋白免疫印跡二抗試劑Goat Anti-rabbit IgG Antibody，購自默克Sigma公司； 細胞增殖檢測試劑Cell Counting Kit-8（CCK-8），購自生工生物工程（上海）股份有限公司； LPS、 蛋白免疫印跡一抗試劑GAPDH Rabbit Monoclonal Antibody、 蛋白免疫印跡一抗二抗稀釋液、 細胞周期檢測試劑碘化丙啶（PI）和核糖核酸酶A（RNaseA），購自上海碧云天生物技術(shù)公司。

實驗設(shè)備包括： 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱，日本三洋公司； NanoDrop型微量分光光度計、 StepOnePlusTM型實時熒光定量PCR系統(tǒng)，美國Thermo Fisher Scientific公司； BD Accuri C6型流式細胞儀，美國BD Biosciences公司； Amersham 800 UV型蛋白印跡成像系統(tǒng)，美國Cytiva公司； Power Pac型電泳儀，上海伯樂醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司； VE 180型電泳槽，上海天能科技有限公司。

1.1.2細胞株和質(zhì)粒

實驗所用的細胞株為原代ASMC，原代人胚腎細胞（293T）由實驗室保存。采用胎牛血清的體積分數(shù)為10%和青霉素-鏈霉素雙抗的體積分數(shù)為1%分別配制低糖、 高糖DMEM培養(yǎng)基，分別用于培養(yǎng)ASMCs、 293T細胞。細胞培養(yǎng)溫度為37 ℃，二氧化碳的體積分數(shù)為5%。

包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G由美國Addgene公司生產(chǎn)；過表達β4GalT1重組質(zhì)粒pLVX-β4GalT1-His［13］由西北大學(xué)李想教授贈送。

1.2實驗方法

1.2.1GEO數(shù)據(jù)庫分析

從美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）獲取高通量測序數(shù)據(jù)集GSE34313，該數(shù)據(jù)集檢測平臺識別編碼號（ID）為GPL6480，芯片類型為Agilent-014850人類全基因組芯片。數(shù)據(jù)分析了ASMCs在用地塞米松處理0、 4、 24 h后基因的表達情況，提取其中β4GalT1基因表達值數(shù)據(jù)，采用Graphad Prism7軟件進行差異分析。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染

在離心管中混合Opti-MEM培養(yǎng)基和LipofectamineTM 3000，在另一個離心管中混合Opti-MEM培養(yǎng)基、質(zhì)粒和P3000TM試劑，充分混勻后，將2個離心管溶液按體積比1∶1混合，在室溫靜置5 min，將脫氧核糖核酸（DNA）-脂質(zhì)體復(fù)合物滴入細胞中置于37 ℃培養(yǎng)，待篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

1.2.3實時熒光定量PCR

1）細胞總RNA提取。在細胞中加入冰預(yù)冷的RNAiso plus試劑，室溫靜置5 min，上下混勻吹吸，轉(zhuǎn)移至離心管中；加200 μL氯仿，充分混勻裂解，上下混合15 s，室溫靜置2～3 min，然后在溫度為4 ℃、 轉(zhuǎn)速為12 000 r/min時離心分離15 min，分成無色水相層、 蛋白層和有機溶劑層，取上層無色水相； 加入等體積的異丙醇，室溫孵育10 min，然后再在溫度為4 ℃、 轉(zhuǎn)速為12 000 r/min時離心分離10 min， 去掉上清液，加1 mL乙醇的體積分數(shù)為75%的溶液，在溫度為4 ℃、 轉(zhuǎn)速為7 500 r/min時離心分離5 min，去掉上清液，無菌環(huán)境風(fēng)干RNA沉淀。用焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解RNA沉淀，并用微量分光光度計定量測試； 取純度為試樣在波長260 nm與波長280 nm處的吸光度比值為1.8～2.0的樣品用于下一步實驗。

2）反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。 混合RNA質(zhì)量為1 ng， Oligo（dT）18和DEPC水至管中， 在65 ℃反應(yīng)5 min后置于冰上， 在上述反應(yīng)體系中再加入反應(yīng)緩沖液、 核糖核酸酶抑制劑（RNase Inhibitor）、 濃度為10 mol/L的脫氧核苷三磷酸（dNTP）和反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid RT， 在42 ℃反應(yīng)60 min，在70 ℃滅活5 min，獲得互補DNA（cDNA）。

3）實時熒光定量PCR。根據(jù)表1所示，實驗中所用引物列表，混合cDNA，上、 下游引物，PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix和DEPC水，在StepOnePlusTM 實時熒光定量PCR系統(tǒng)上完成定量PCR實驗，反應(yīng)條件為50 ℃保持2 min—95 ℃保持2 min，進入循環(huán)： 95 ℃保持15 s—60 ℃保持1 min，共40個循環(huán)。實驗結(jié)果根據(jù)PCR循環(huán)數(shù)的閾值Ct值計算，并用2-△△Ct法表示基因的相對表達量。

1.2.4蛋白免疫印跡實驗

接種細胞到六孔板中培養(yǎng)48 h，每個孔加入100 μL的放射免疫沉淀分析（RIPA）蛋白裂解液，用刮板將細胞刮至離心管中，冰上靜置30 min，在溫度為4 ℃、 轉(zhuǎn)速為12 000 r/min時離心分離15 min，取上清液至新的離心管中，加入體積1/3的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液，混勻，在水中煮沸10 min。

通過二辛可酸法（BCA）蛋白測定試劑盒測得蛋白含量， 計算樣品需要上樣的對照組和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組（簡稱穩(wěn)轉(zhuǎn)組）蛋白液體積， 加入等質(zhì)量的對照組和穩(wěn)轉(zhuǎn)組的上樣蛋白， 開始電泳， 先在電壓80 V時電泳， 待電泳至分離膠時， 將電壓調(diào)至120 V， 保持60～90 min， 電泳結(jié)束。 開始轉(zhuǎn)膜， 轉(zhuǎn)膜程序為電流300 mA， 保持90 min。

1）封閉。用牛血清白蛋白（BSA）的質(zhì)量分數(shù)為5%的溶液封閉1 h。

2）孵育一抗。將一抗試劑和蛋白免疫印跡一抗稀釋液以體積比1∶1 000配制，與聚偏二氟乙烯（PVDF）膜4 ℃孵育過夜。用洗滌緩沖鹽溶液（TBST）清洗PVDF膜，每次5 min，共5次。

3）孵育二抗。將二抗試劑和蛋白免疫印跡二抗稀釋液以體積比1∶10 000配制，與PVDF膜室溫避光搖晃孵育1 h。用TBST溶液清洗PVDF膜，每次5 min，共5次。

4）顯色。用Image Studio軟件處理實驗數(shù)據(jù)，在成像系統(tǒng)中顯色，保存圖片。

1.2.5細胞增殖檢測

細胞增殖實驗采用CCK-8試劑盒。 將2 000個細胞接種于九十六孔板中培養(yǎng)0、 24、 48、 72 h后，每孔中加入10 μL CCK-8反應(yīng)液， 孵育1 h， 在波長450 nm測定吸光度并進行分析。

1.2.6細胞周期檢測

將細胞接種于六孔板中培養(yǎng)48 h， 用胰酶消化， 在轉(zhuǎn)速為1 000 r/min時離心分離5 min， 用磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸細胞， 再次離心分離， 去掉上清液， 加入預(yù)冷的乙醇的體積分數(shù)為70%的溶液輕混， 在溫度為4 ℃時固定細胞12～24 h， 離心分離， 去掉上清液， 用冰浴預(yù)冷的PBS重懸細胞， 再次離心分離， 去掉上清， 加入由碘化丙啶（PI）、 染色緩沖液和RNaseA配制的碘化丙啶染色液， 重懸細胞沉淀， 于37 ℃避光孵育30 min， 用流式細胞儀檢測細胞周期， 采用Flowjo軟件分析細胞狀態(tài)。

1.2.7細胞遷移檢測

將細胞接種于十二孔板中， 培養(yǎng)至細胞密度的90%， 在每個孔板中央用移液器槍頭均勻劃線， 更換培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基， 分別在培養(yǎng)0、 12 h時對細胞劃痕拍照， 用Image-Pro Plus 6.0軟件處理圖片， 計算細胞遷移率。

1.2.8統(tǒng)計學(xué)分析

采用統(tǒng)計分析軟件Graphad Prism7對3次實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析， 組間分析采用t檢驗， 在原假設(shè)為真時獲得檢驗統(tǒng)計量的觀測值及更不支持原假設(shè)的其他值的概率p＜0.05， 認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2實驗結(jié)果

2.1利用GEO數(shù)據(jù)庫分析β4GalT1在ASMC中的表達

在數(shù)據(jù)集GSE34313中搜索β4GalT1的基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（GEO Profiles）（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles/？ term=GSE34313%5BAcce

ssion%5D+B4GALT1），獲得地塞米松（Dex）處理0、 4、 24 h后β4GalT1在ASMC中表達量的數(shù)據(jù)，利用Graphad Prism7軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖1所示。由圖可以看出，β4GalT1的表達量在Dex處理后呈減小趨勢，表明β4GalT1的表達能響應(yīng)藥物的抗炎作用，提示β4GalT1可能與氣道炎癥反應(yīng)相關(guān)。

2.2LPS刺激ASMC前后白介素1β和β4GalT1表達量的變化

LPS是一種促炎細胞因子，參與體內(nèi)的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，白介素1β（IL-1β）是一種促炎因子，參與調(diào)節(jié)宿主的先天免疫反應(yīng)。采用質(zhì)量濃度為100、 1 000 μg/L的LPS刺激ASMC，24 h后提取細胞RNA檢測IL-1β和β4GalT1的表達，結(jié)果如圖2所示。由圖可見，隨著LPS濃度的增加，IL-1β和β4GalT1的表達量均呈濃度依賴性增加，表明β4GalT1的表達受炎癥刺激的影響。

2.3過表達β4GalT1穩(wěn)轉(zhuǎn)株的獲得

為了考察β4GalT1在ASMC炎癥反應(yīng)過程中的功能， 構(gòu)建過表達β4GalT1的穩(wěn)轉(zhuǎn)株。 首先， 分別測試ASMC對嘌呤霉素的耐受性，嘌呤霉素的質(zhì)量濃度分別為1、 2、 3、 4、 5 mg/L， 結(jié)果如圖3（a）所示。 由圖可知， 加入嘌呤霉素48 h后， 嘌呤霉素的質(zhì)量濃度為2 mg/L時的細胞致死率達到98%以上， 所以后期轉(zhuǎn)染篩選和維持用嘌呤霉素的質(zhì)量濃度為2 mg/L。 將質(zhì)粒pLVX-β4GalT1-His、 包裝質(zhì)粒psPAX2、 pMD2.G混合均勻進行共轉(zhuǎn)， 均勻滴至293T細胞中。 收取病毒上清液感染ASMC， 在37 ℃培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基， 48 h后加入嘌呤霉素的質(zhì)量濃度為2 mg/L的培養(yǎng)基進行轉(zhuǎn)染株的篩選，每48 h更換含嘌呤霉素的培養(yǎng)基，待對照組細胞致死率達到98%以上， 穩(wěn)轉(zhuǎn)組細胞生長狀態(tài)良好， 將穩(wěn)轉(zhuǎn)組細胞進行消化傳代到新的六孔板中維持培養(yǎng)。 待細胞融合度達80%， 提取細胞總RNA， 采用β4GalT1的特異性引物P1和P2對轉(zhuǎn)染細胞株中β4GalT1的mRNA表達量進行PCR檢測， 結(jié)果如圖3（b）所示。 由圖可見， 在轉(zhuǎn)染pLVX-β4GalT1-His質(zhì)粒的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株中， β4GalT1的mRNA表達量顯著大于ASMC及轉(zhuǎn)染空載體的ASMC的。

提取細胞總蛋白，采用蛋白免疫印跡方法檢測各細胞株中β4GalT1蛋白的表達，結(jié)果如圖3（c）所示。從圖中可以看出，在轉(zhuǎn)染pLVX-β4GalT1-His質(zhì)粒的穩(wěn)轉(zhuǎn)株中， β4GalT1蛋白表達量顯著大于ASMC的， 與實時熒光定量PCR結(jié)果一致， 表明過表達β4GalT1的穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建成功。

2.4過表達β4GalT1的細胞株中相關(guān)炎癥因子的表達量隨時間的變化

將過表達β4GalT1的細胞分別培養(yǎng)24、 48、 72 h后， 提取細胞RNA檢測β4GalT1和炎癥因子的表達， 結(jié)果如圖4（a）所示。 由圖可見， 隨著培養(yǎng)時間的延長， β4GalT1的表達量呈增大的趨勢。 促炎因子轉(zhuǎn)化生長因子β3（TGF-β3）、 IL-1β和抑炎因子白介素10（IL-10）的表達量檢測結(jié)果如圖4（b）、 （c）、 （d）所示。 由圖可看出： 隨著培養(yǎng)時間的延長， 穩(wěn)轉(zhuǎn)株的TGF-β3和IL-1β表達量呈減小的趨勢。 與對照株相比， 培養(yǎng)72 h的穩(wěn)轉(zhuǎn)株的TGF-β3和IL-1β表達量顯著減小， 培養(yǎng)48 h的穩(wěn)轉(zhuǎn)株的IL-10表達量顯著增大。該結(jié)果表明，過表達β4GalT1細胞株中促炎因子表達量減小， 而抑炎因子表達量增大。

2.5過表達β4GalT1對ASMC行為的影響

由于炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致細胞行為如細胞增殖、細胞周期和細胞遷移的變化，因此本文中檢測了過表達β4GalT1后細胞行為的變化，結(jié)果如圖5所示。采用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖情況，從圖5（a）可以看出，相較于ASMC和轉(zhuǎn)染空載體的ASMC，過表達β4GalT1在細胞生長前24 h對細胞增殖并無顯著影響，但在細胞生長48、 72 h后，過表達β4GalT1能顯著抑制細胞增殖。

細胞的增殖往往取決于細胞周期的變化，從PI試劑對細胞DNA染色后經(jīng)流式細胞儀檢測結(jié)果［圖5（b）、 （c）］發(fā)現(xiàn)，過表達β4GalT1可將ASMC的周期阻滯在DNA合成的S期。

細胞遷移能力是細胞基本功能之一。為了探究β4GalT1是否在ASMC的遷移過程中發(fā)揮功能，本文中采用劃痕實驗的方法，觀察ASMC、 轉(zhuǎn)染空載體的ASMC以及過表達β4GalT1細胞培養(yǎng)12 h后遷移距離的變化，以ASMC為對照，計算細胞相對遷移率。從圖5（d）、 （e）可知，過表達β4GalT1可以在一定程度上增強ASMC的遷移能力，這些行為改變可能與β4GalT1的抑炎作用有關(guān)。

2.6過表達β4GalT1細胞分泌液對細胞因子的調(diào)節(jié)

為了探究過表達β4GalT1的細胞株影響相關(guān)炎癥因子的原因， 將過表達β4GalT1的細胞株培養(yǎng)48 h后， 換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后， 收取過表達β4GalT1細胞株的上清液，即為過表達β4GalT1細胞分泌液。 采用質(zhì)量濃度為1 000 μg/L的LPS刺激ASMC 24 h后， 再將經(jīng)LPS刺激發(fā)生炎癥的細胞培養(yǎng)基換成收取的過表達β4GalT1細胞分泌液處理，48 h后提取細胞RNA檢測TGF-β3、 IL-1β和IL-10的表達量， 結(jié)果如圖6所示。 由圖可見， 通過過表達β4GalT1的細胞株分泌液處理， 經(jīng)LPS刺激后的細胞的TGF-β3和IL-1β的表達量顯著減小，同時IL-10的表達量顯著增加，表明過表達β4GalT1的細胞株可通過分泌液調(diào)節(jié)細胞因子的表達。

3討論

β4GalT1的高表達在多種炎癥疾病中普遍存在，而在以氣道炎癥反應(yīng)為主要特征的哮喘疾病中，β4GalT1的功能卻鮮有報道。ASMC是哮喘發(fā)病機制中的關(guān)鍵效應(yīng)細胞，糖皮質(zhì)激素藥物可通過改變ASMC的結(jié)構(gòu)和功能達到臨床控制哮喘的目的［14］。一方面，地塞米松是常用于哮喘治療的糖皮質(zhì)激素藥物［15］，對地塞米松處理0、 4、 24 h的ASMC轉(zhuǎn)錄組芯片數(shù)據(jù)（GSE34313）進一步采用GEO Profiles分析發(fā)現(xiàn)，隨著地塞米松處理時間的增加，ASMC中β4GalT1的表達值呈下降趨勢； 另一方面，LPS處理ASMCs后IL-1β和β4GalT1的表達量均呈LPS濃度依賴性增加。以上結(jié)果均表明，ASMC中β4GalT1的表達水平與氣道炎癥反應(yīng)的程度具有相關(guān)性，但其具體功能尚不清晰。

為了進一步明確β4GalT1在ASMC中的功能，本文中在ASMC中對β4GalT1過表達，獲得過表達β4GalT1細胞株。通過檢測對照株和穩(wěn)轉(zhuǎn)株不同時間的β4GalT1、 TGF-β3、 IL-1β和IL-10的表達，提取細胞RNA檢測炎癥因子的表達，結(jié)果表明：隨著培養(yǎng)時間的延長，穩(wěn)轉(zhuǎn)株的β4GalT1表達量呈增加的趨勢，并且穩(wěn)轉(zhuǎn)株的TGF-β3和IL-1β表達量呈減小的趨勢。與對照株相比，在培養(yǎng)72 h穩(wěn)轉(zhuǎn)株中TGF-β3和IL-1β表達量顯著減小，但在48 h穩(wěn)轉(zhuǎn)株中IL-10的表達量顯著增大。miR-140-3p能通過影響TGF-β3的表達促進神經(jīng)炎癥［16］，同時靶向IL-1β和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（NOD）樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）炎癥小體誘導(dǎo)的白細胞供應(yīng)和斑塊白細胞募集，可減少動脈粥樣硬化中的血管炎癥［17］，表明IL-1β是一種促炎因子。IL-10是一種抗炎細胞因子，具有很強的抑炎能力，心肌梗死后體內(nèi)輸注IL-10可改善左室微環(huán)境，減少炎癥，促進愈合［18］。通過促淋巴管極化巨噬細胞間接調(diào)節(jié)角膜淋巴管生成和炎癥反應(yīng)的消退，IL-10可用于治療性終止病理性角膜炎癥［19］。上述結(jié)果表明，過表達β4GalT1的細胞株中促炎因子的表達量減小，而抑炎因子的表達量增加。

過表達β4GalT1對細胞增殖能力的影響檢測結(jié)果顯示，β4GalT1的過表達可抑制細胞的增殖，但β4GalT1抑制細胞增殖的機制有多種，如在對神經(jīng)細胞中β4GalT1的功能研究中發(fā)現(xiàn)： β4GalT1可通過細胞周期調(diào)控因子抑制細胞的增殖［20］； 而在低濃度TNF-α誘導(dǎo)的細胞增殖過程中，過表達β4GalT1又可通過ERK1/2信號通路顯著抑制細胞增殖［21］。紫檀芪可減輕卵清蛋白（OVA）誘導(dǎo)的哮喘小鼠的氣道炎癥，能顯著減弱肺部炎性細胞浸潤和杯狀細胞增殖［22］，一氧化氮有利于調(diào)節(jié)氣道功能和維持肺穩(wěn)態(tài)，且誘導(dǎo)細胞周期阻滯［23］。本文中對細胞周期變化的檢測結(jié)果表明，過表達β4GalT1可將細胞周期阻滯在DNA合成的S期，從而延緩細胞分裂，導(dǎo)致細胞增殖減慢。細胞遷移是一種重要的生理過程，在胚胎發(fā)生、 器官發(fā)生、 傷口愈合、 再生或免疫反應(yīng)（包括炎癥）的許多階段都至關(guān)重要。神經(jīng)酰胺1-磷酸（C1P）被證明可以抑制促炎細胞因子的釋放緩解氣道炎癥，可以有效地刺激細胞遷移［24］。宿主來源的L-乳酸可促進腸上皮細胞線粒體三磷酸腺苷（ATP）的產(chǎn)生，從而驅(qū)動細胞遷移，減輕腸道炎癥［25］。本文中研究發(fā)現(xiàn)，過表達β4GalT1在抑制細胞增殖的同時，其介導(dǎo)的細胞遷移能力較對照組顯著增強。以上結(jié)果表明，過表達β4GalT1對ASMC產(chǎn)生的細胞行為改變可能與抑炎作用有關(guān)。

采用過表達β4GalT1的ASMC分泌液處理發(fā)生炎癥的細胞，通過檢測TGF-β3、 IL-1β和IL-10的表達發(fā)現(xiàn)，TGF-β3和IL-1β的表達量顯著減小，同時IL-10的表達量顯著增加，表明過表達β4GalT1的穩(wěn)轉(zhuǎn)株可通過分泌液調(diào)節(jié)細胞因子的表達。

4結(jié)論

為了探究半乳糖基轉(zhuǎn)移酶β4GalT1在ASMC中的功能，本文中通過LPS刺激ASMC前后的變化，構(gòu)建過表達β4GalT1穩(wěn)轉(zhuǎn)株，從而檢測過表達β4GalT1的細胞株中相關(guān)炎癥因子的表達水平，探究過表達β4GalT1對ASMC行為的影響和過表達β4GalT1細胞分泌液對ASMC炎癥的影響，得出以下結(jié)論：

1） ASMC炎癥反應(yīng)能刺激β4GalT1的表達，但隨著β4GalT1的持續(xù)高表達，促炎因子的表達逐漸受到抑制，而抑炎因子的表達量增加。

2）過表達β4GalT1能改變細胞的增殖、周期和遷移，可能與炎癥修復(fù)有關(guān)。

3）過表達β4GalT1的ASMC通過細胞分泌液產(chǎn)生抑炎效應(yīng)。

以上結(jié)論可為探討β4GalT1在氣道炎癥反應(yīng)中的功能提供新的線索，為研究β4GalT1在氣道炎癥中的作用機制提供實驗依據(jù)，為未來治療氣道炎癥提供新的方法。

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（責(zé)任編輯：于海琴）

收稿日期： 2023-11-01網(wǎng)絡(luò)首發(fā)時間：2024-05-27T13：49：59

基金項目： 國家自然科學(xué)基金項目（12272063）；常州大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（202310292332B）

第一作者簡介： 張賽帥（1998—），女，江蘇南通人。碩士研究生，研究方向為細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)。E-mail： 2585817978@qq.com。

通信作者簡介： 鄧林紅（1960—），男，四川夾江人。 長江學(xué)者特聘教授， 博士， 博士生導(dǎo)師， 研究方向為生物醫(yī)學(xué)工程和細胞生物學(xué)。

E-mail： dlh@cczu.edu.cn。

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