關鍵詞：草果；多酚；黃酮；DPPH 自由基清除能力；種質(zhì)資源；評價

中圖分類號：S567.239 文獻標志碼：A

草果（Amomum tsao-ko Crevostet Lemarie）為姜科豆蔻屬的藥食同源植物。草果全株均含有辛香氣味，可作調(diào)味香料，也可入藥。草果具有溫中燥濕、除痰截瘧[1]、潤腸通便[2]、降脂、降血糖、抗氧化、抑制腫瘤等藥理功效[3]。草果原產(chǎn)于越南和老撾等地，在我國云南省和廣西西部等地區(qū)分布較為廣泛[4-5]，四川和貴州也有少量種植。云南省的草果種植主要分布在怒江、紅河、文山、德宏、保山、西雙版納、普洱和臨滄8 個州（市）[6-7]。目前，云南省的草果種植面積超過106 666.67 hm2，大約占全國種植面積的85%，成為當?shù)氐奶厣a(chǎn)業(yè)和農(nóng)民增收的主要來源。然而云南草果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展還存在許多問題，具體表現(xiàn)為資源評價滯后，導致栽培品種匱乏，病蟲害嚴重和精深加工等問題[8]，嚴重制約著云南草果產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。以關鍵成分為導向，開展草果種質(zhì)資源研究，在此基礎上進行草果優(yōu)良品種的篩選和新產(chǎn)品研發(fā)，是實現(xiàn)草果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的根本保障。

草果化學成分多樣，目前分離到包括揮發(fā)油類、酚類、黃酮類、二苯基庚烷類、雙環(huán)壬烷類等化學成分，其中以揮發(fā)油、酚類為主要活性成分。但是在草果成分方面的研究以揮發(fā)油居多，多酚、黃酮等非揮發(fā)性成分較少[9]。《中國藥典》將草果揮發(fā)油含量定義為草果質(zhì)量評價的主要化學成分。然而，僅對一類成分進行低限控制不足以確保含有復雜成分的草果的安全性和有效性。已有研究表明，多酚和黃酮類化合物在草果中含量較高[10-11]，草果熱水水提物中的黃酮含量可達到（295.40±0.47）mg/g，且草果多酚和黃酮類化合物具有抗氧化、抗菌、防腐、緩解糖尿病和抗卵巢癌等功效，尤其抗氧化性效果顯著[12-14]。

因此，本研究檢測了草果水提物中的主要成分，并對草果水提物的潤腸通便功效進行了驗證；采用分光光度法，對57 個草果種質(zhì)水提物的主要成分多酚類、黃酮類和DPPH 自由基清除能力進行檢測，為草果資源評價及優(yōu)質(zhì)種質(zhì)篩選提供依據(jù)；然后對草果主要成分與地理因子的相關性進行分析，由此推測影響草果多酚及黃酮變化積累的環(huán)境因素，為草果資源起源演化、新品種選育和產(chǎn)品開發(fā)利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

57份參試材料分別來源于國外（老撾、緬甸），我國四川、廣西及云南文山、紅河、怒江、滇西、滇南（表1）。

鮮果經(jīng)預處理，置于60 ℃烘箱烘干，粉碎后過40 目篩，密封保存，備用。

1.2 方法

1.2.1 草果水提物的制備 采用煎煮法，以水為溶劑對草果進行提取。稱取50 g 草果果粉置于500 mL 超純水（料液比1∶10）中進行煎煮，沸騰3 min，利用8 層尼龍布（200 目）過濾，殘渣再次加水500 mL 煮沸，以上重復3 次，棄殘渣，留液體以4000 r/min 進行離心10 min，取上清液即為草果水提物。于冷凍干燥機冷凍3 d，得到草果水提物凍干粉，置于?80 ℃冰箱保存，備用。

1.2.2 廣靶代謝組學檢測 采用廣靶代謝組學對草果水提物的成分進行檢測。樣本預處理后上機檢測，使用EXION LC System（SCIEX）超高效液相色譜儀，通過Waters UPLC 液相色譜柱對目標化合物進行色譜分離數(shù)據(jù)采集及目標化合物定量分析，通過SCIEX Analyst Work Station Software（Version 1.6.3）來完成。使用自撰寫的R 程序包結(jié)合自建數(shù)據(jù)庫完成提峰、注釋等工作，再根據(jù)數(shù)據(jù)庫對化合物進行分類，統(tǒng)計各類別化合物的豐度總和占所有化合物的比例。

1.2.3 通便功效試驗 采用小腸推進實驗驗證草果水提物的通便功效。將60 只小鼠分為5 個實驗組：空白組（等體積的滅菌生理鹽水）、模型組（洛哌丁胺8 mg/kg）、陽性組（麻仁丸900 mg/kg）、草果低劑量組（草果水提物300 mg/kg）、草果高劑量組（草果水提物600 mg/kg），連續(xù)7 d 灌胃后進行小腸推進實驗，期間小鼠自由攝食飲水，25 ℃，12 h 光照，12 h 黑暗。記錄每只小鼠小腸長度及墨汁推進距離。計算公式為：墨汁推進率=墨汁推進距離/小腸長度×100%。

1.2.4 多酚含量測定 參照李巨秀等[15]的方法測定多酚含量。精密吸取0.1 mL 沒食子酸對照品溶液（0.02、0.06、0.10、0.14、0.18 μg/μL）和草果水提物溶液（2 mg/mL），加入0.5 mL 10%福林酚溶液，搖勻，靜置5 min，加入0.4 mL 的7.5%碳酸鈉試劑，搖勻，避光靜置1 h 后分別取200 μL待測液于96 孔板中，于765 nm 處檢測吸光值，繪制標準曲線， 得到線性回歸方程為： y=171.47x?8.3005（R2=0.999），根據(jù)標準曲線計算多酚含量。

1.2.5 黃酮含量測定 精密吸取0.1 mL 蘆丁對照品溶液（0.025、0.100、0.200、0.300、0.400 μg/μL）和草果水提物溶液（2 mg/mL），加入100 μL 5%亞硝酸鈉溶液，靜置6 min，加入100 μL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min，加入1 mL 4%氫氧化鈉溶液，搖勻，放置15 min。于504 nm 處檢測吸光值，繪制標準曲線，得到線性回歸方程為：ｙ =2008.3x+1.3401（R2=0.9992）。根據(jù)標準曲線計算黃酮含量。

1.2.6 DPPH 自由基清除能力測定 根據(jù)DPPH自由基清除能力試劑盒說明書，分別配置對照管、測定管、空白管和標準品管，混勻，室溫25 ℃避光靜置30 min， 4000 r/min 離心5 min， 波長517 nm，吸取800 μL 至比色皿中，無水乙醇調(diào)零，測定各管吸光度值（A）。DPPH 自由基清除率=[1-（A 測定?A 對照）/A 空白）]×100%。以標準曲線算得的抗氧化劑Trolox 當量表示樣本的DPPH 自由基清除能力。最后代入公式計算，樣品的DPPH 自由基清除能力（μg/mL）=標準曲線的Trolox 濃度×提取液總體積（mL）×樣品重量（g）×稀釋倍數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad prism 5.0 軟件制圖，采用SPSS21 軟件對相關數(shù)據(jù)進行相關性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 草果水提物成分分析及通便功效分析

2.1.1 草果水提物成分分析 采用廣靶代謝組學的方法對草果水提物進行成分檢測，共檢測到927種成分。通過成分分類處理結(jié)果表明，黃酮類成分高達46.34%，酚類占15.98%，生物堿占12.59%，氨基酸類占6.19%，維生素、有機酸類占4.57%，核苷酸類占3.16%，脂類和芳香類占1.62%，其他類別的豐度總和占9.55%。其中，黃酮與多酚占總成分的62.32%，接近2/3。

2.1.2 草果水提物的通便功效驗證 小鼠的小腸墨汁推進率是判斷通便功效的重要指標。墨汁推進率結(jié)果見圖1，與空白組（67.10%）相比，模型組（ 41.15% ） 的墨汁推進率極顯著下降（Plt;0.01）；而與模型組相比，陽性組（56.40%）、草果水提物低劑量組（ 55.48% ） 和高劑量組（59.23%）的墨汁推進率顯著提高（Plt;0.05），且草果水提物高劑量組的推進效果稍優(yōu)于低劑量組和陽性藥物組。結(jié)果表明，草果水提物可以顯著改善小鼠便秘，且高劑量組效果更佳，優(yōu)于陽性藥物麻仁丸。因此證明草果水提物具有通便功效。

2.2 草果水提物的成分差異

草果水提物具有通便功效，多酚和黃酮是草果水提物的主要成分。通過檢測57 個草果種質(zhì)的水提物中的多酚和黃酮含量，來探究不同地區(qū)和不同表型（3 種果形）草果種質(zhì)的功能性成分含量的差異。

2.2.1 草果水提物的多酚成分 57 份草果種質(zhì)按照果形分為3 類：紡錘形（26 個）、橢圓形（22個）和圓形（9 個）。紡錘形草果水提物多酚含量如圖2A 所示， 中國云南怒江貢山縣GS-10（119.44 mg/g）、緬甸MDL-1（109.27 mg/g）、老撾MGK-2（95.45 mg/g）含量較高，在組間差異水平上，國外組（102.36 mg/g）和中國云南怒江組（65.21 mg/g）的平均含量明顯高于其他組，而中國云南紅河組則最低（35.02 mg/g）。

橢圓形的22 個種質(zhì)中，僅有中國云南怒江貢山縣GS-3（102.04 mg/g）的多酚含量顯著較高，其他種質(zhì)均差異不顯著，大多在30～50 mg/g 之間，少數(shù)種質(zhì)含量極低，而YY-4 含量（73.96 mg/g）稍高，各組的平均值差異也不大，均保持在25～50 mg/g 范圍內(nèi)，整體偏低（圖2B）。

圖2C 為9 個圓形草果種質(zhì)的多酚含量，含量最高的是中國云南怒江福貢縣FG-8（97.38 mg/g），老撾莫裹坎MGK-1（72.57 mg/g）含量也較高。中國云南怒江組多酚含量平均值為48.92 mg/g，高于國內(nèi)其他3 組。

整體來講，紡錘形草果的多酚含量顯著高于其他2 種果形。在3 種果形中，國外組和中國云南怒江組的多酚含量均高于其他組，多酚含量較為突出的是國外的MDL-1（紡錘形果）和MGK-2（紡錘形果），中國云南怒江貢山縣的GS-3（橢圓形果）和GS-10（紡錘形果），中國云南怒江福貢縣的FG-8（圓形果）。鑒于中國云南怒江種質(zhì)較多，因此對中國云南怒江22 個種質(zhì)進行分析，比較中國云南怒江不同果形種質(zhì)的多酚含量差異，結(jié)果表明，中國云南怒江種質(zhì)中，紡錘形草果多酚含量最高，圓形草果次之，橢圓草果含量最低（圖2D）。

2.2.2 草果水提物的黃酮成分 草果水提物的黃酮含量見圖3。圖3A～圖3C 分別為3 種果形草果的黃酮含量。紡錘形草果的26 個種質(zhì)中，黃酮含量超過400 mg/g 的有中國云南怒江貢山縣GS-10（500.35 mg/g）和緬甸曼德勒MDL-1（455.74 mg/g），有7個種質(zhì)的黃酮含量在200～400 mg/g 之間（圖3A）；在橢圓形草果種質(zhì)中（圖3B），僅有1 個種質(zhì)含量超過200 mg/g，為中國云南怒江貢山縣GS-3（343.66 mg/g）；在圓形草果種質(zhì)中（圖3C），僅有2 個種質(zhì)的黃酮含量在200 mg/g 以上，是中國云南怒江福貢縣FG-8（343.12 mg/g）和老撾莫裹坎MGK-1（225.60 mg/g）。綜上，3 種果形草果的黃酮含量差異較大，紡錘形草果種質(zhì)的黃酮含量明顯高于其他2 個果形。對各組間的黃酮含量進行比較發(fā)現(xiàn)，橢圓形草果的黃酮含量在各組間差異不大，而紡錘形與圓形草果中，國外組和中國云南怒江組的黃酮含量遠高于其他組。在中國云南怒江州3 種果形草果中，紡錘形草果的黃酮含量為203.21 mg/g，而橢圓形草果僅為117.72 mg/g，圓形草果居中，為146.89 mg/g（圖3D）。

2.3 草果水提物的DPPH 自由基清除能力的差異

草果水提物對DPPH 自由基清除能力見圖4。不同果形草果水提物的DPPH 自由基清除能力分別為：紡錘形草果10.48～18.10 μg/mg（圖4A），橢圓形草果12.49～16.41 μg/mg（圖4B），圓形草果13.37～18.03 μg/mg（圖4C），3 種果形各有2個種質(zhì)的DPPH 自由基清除能力超過16 μg/mg，分別為GS-9（18.10 μg/mg）、GS-10（17.50 μg/mg）、GS-8（17.50 μg/mg）、FG-2（16.41 μg/mg）、FG-6（16.36 μg/mg）、MGK-1（16.96 μg/mg）、FG-8（18.03 μg/mg）?？傮w而言，圓形草果的DPPH自由基清除能力（ 15.41 μg/mg ） 高于紡錘形（14.67 μg/mg）和橢圓形草果（14.70 μg/mg）。而在各組分果形草果中，均為國外組和中國云南怒江組高于其他組。因此，對中國云南怒江組種質(zhì)進行比較，比較中國云南怒江組3 種果形草果的抗氧化能力，結(jié)果表明，中國云南怒江州圓形草果的抗氧化能力高于其他2 個果形（圖4D）。

2.4草果多酚、黃酮含量與抗氧化能力的相關性

57個草果種質(zhì)的多酚、總黃酮含量及DPPH自由基清除能力之間的相關性見圖5。由圖5 可知，隨草果DPPH 自由基清除能力的增強，其多酚和黃酮含量顯著增加，結(jié)果表明，草果的多酚、總黃酮含量與DPPH 自由基清除能力之間呈顯著正相關（Plt;0.05），表明草果的多酚和黃酮類物質(zhì)在清除DPPH 自由基能力方面起著重要作用。

2.5 草果多酚、黃酮含量與地理分布的相關性

供試草果種質(zhì)來自不同產(chǎn)地，有顯著的地理分布差異。其中，最低海拔為1007 m，最高海拔為2463 m。草果多酚、黃酮含量與海拔的相關性見圖6。由圖6 可知，隨著海拔的升高，草果多酚和黃酮含量均顯著增加，其中，草果多酚含量與海拔高度呈極顯著正相關（Plt;0.01， r=0.2718），草果黃酮含量與海拔高度呈顯著正相關（Plt;0.05， r=0.2791）。

不同產(chǎn)地草果種質(zhì)的經(jīng)緯度具有明顯差異。經(jīng)度最低為96.54°E，最高為106.82°E；緯度最低為18.01°N，最高為32.73°N。草果多酚、黃酮含量與經(jīng)緯度的相關性見圖7。由圖7A 和圖7B 可知，隨經(jīng)度的增大，草果多酚和黃酮含量的豐度顯著減小，表明草果多酚和黃酮含量與經(jīng)度呈顯著負相關（Plt;0.05）。而隨著緯度的增大，草果多酚和黃酮的豐度減小，草果多酚和黃酮含量與緯度呈負相關，但無顯著性（圖7C，圖7D）。

2.6 草果種質(zhì)的評級分析

根據(jù)草果多酚和黃酮含量的測定結(jié)果，建立草果種質(zhì)評價指標（表2）。一級草果種質(zhì)：黃酮含量≥300 mg/g，且多酚含量≥90 mg/g，共7 個草果種質(zhì)；二級草果種質(zhì)：110 mg/g≤黃酮含量lt;300 mg/g，且45 mg/g≤多酚含量lt;90 mg/g，共17個草果種質(zhì)；三級草果種質(zhì)：黃酮含量lt;110 mg/g，或多酚含量lt;45 mg/g，共33 個草果種質(zhì)[16]。

3 討論

研究結(jié)果表明，不同草果種質(zhì)的黃酮、多酚含量具有明顯差異，可利用這2 個指標作為草果優(yōu)良種質(zhì)的綜合評價指標。根據(jù)該指標，可將57份草果種質(zhì)分為3 個等級，篩選得到一等草果種質(zhì)7 個，其中，中國云南怒江GS-3、GS-10 和國外MDL-1、MGK-2 四個種質(zhì)明顯優(yōu)于其他草果種質(zhì)；同時，研究證明了不同來源和不同果形的草果種質(zhì)多酚、黃酮含量具有明顯的地理差異，總體而言，國外和中國云南怒江的草果種質(zhì)多酚、黃酮含量高于其他地區(qū)（省外、滇西、滇南、文山、紅河組別），紡錘形草果種質(zhì)的多酚、黃酮含量高于橢圓形果和圓形果；且隨著黃酮、多酚含量的提高，DPPH 自由基清除能力隨之增強。因此，研究結(jié)果不但為草果種質(zhì)資源鑒定評價提供了的綜合指標，也為草果種質(zhì)的考察收集及起源演化研究奠定了基礎，更為優(yōu)良種質(zhì)的發(fā)掘利用提供了科學依據(jù)。

本研究根據(jù)草果多酚、黃酮含量評價草果種質(zhì)資源，前人的研究尚無相關報道。但已有對單個草果種質(zhì)進行多酚、黃酮含量進行檢測。杜麗霞等[10]采用LC-MS/MS 技術(shù)測得草果多酚類化合物（70%乙醇提取液）的得率為11.13%，且具有一定的DPPH 自由基清除能力。萬紅焱[17]利用福林酚法測得滇產(chǎn)草果60%乙醇提取物中多酚提取量可達9.69%。本研究從57 個草果種質(zhì)水溶性成分中測得多酚含量為18.25～119.44 mg/g。袁園等[18]采用NaNO₂-Al（NO₃）₃-NaOH 法測得草果粗黃酮（60%乙醇提取液）含量為24.20 mg/g，且具有較強的DPPH 自由基清除能力。羅金龍等[19]通過研究得出，草果黃酮（50%乙醇提取液）含量為41.47 mg/g，且草果黃酮含量達到135.60 g/mL時，DPPH 自由基清除率達到81.07%。草果配方顆粒的總黃酮（60%乙醇）含量為12.38%[20]。JEONG 等[11]分析了11 種中藥材的熱水水提物多酚含量、黃酮含量和DPPH 自由基清除活性，其中在14 種傳統(tǒng)藥物中草果熱水水提物的黃酮含量最高[（295.40±0.47）mg/g]，且抗氧化能力最強。而本研究測得57 個草果種質(zhì)中的黃酮含量為31.37～500.35 mg/g。

藥用植物的品質(zhì)優(yōu)劣與產(chǎn)地間的特定生境緊密相關，對其關系進行研究可為優(yōu)質(zhì)資源開發(fā)利用提供依據(jù)。已有研究表明，老山芹的黃酮含量與海拔高度呈顯著負相關[21]，冷蒿與海拔呈顯著正相關，與經(jīng)度和緯度呈顯著負相關[22]。銀杏花粉黃酮與經(jīng)度呈負相關，與緯度呈正相關[23]。有關草果揮發(fā)油成分與地理因子的相關性也有報道，草果揮發(fā)油成分與緯度呈顯著負相關[24]；另外，緯度越高，樣本間差異越小，草果樣本紅外光譜之間越相似[25]。草果果實中的β-蒎烯、桉葉油醇、蒎烯受海拔高度的影響最大[26]。在本研究中，草果黃酮、多酚含量與地理因子的相關性分析表明，海拔越高，經(jīng)度越低時，草果黃酮和多酚含量越高。

眾所周知，海拔與溫度呈負相關，與光照和紫外輻射呈正相關；有利于黃酮積累的因素是低溫條件，及強光照、紫外輻射時間的延長。如在低溫處理后，銀杏葉總黃酮含量高于高溫處理[27]。遮光和去除太陽紫外線處理均能顯著減少葡萄中黃酮醇類化合物的濃度[28]。而經(jīng)度與土壤水分有一定關系，適度干旱可以提高植物體內(nèi)黃酮類成分的含量[29]。大豆異黃酮含量與經(jīng)度、降水呈負相關[30]，這與本研究結(jié)果一致。關于草果多酚的積累尚無報道，但多酚與黃酮結(jié)構(gòu)相似，因此推測，本研究中，海拔可能是通過溫度、光照和紫外線的綜合作用而促進草果多酚和黃酮的積累，經(jīng)度可能是通過土壤水分的變化間接影響黃酮的積累。本研究為草果多酚及黃酮成分積累的相關生態(tài)因子的探究提供了數(shù)據(jù)支撐，并為今后草果資源的利用和產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定基礎。

種質(zhì)資源是農(nóng)作物品種改良的基礎，功能性資源研究評價是育種利用和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的核心。不但可以指導草果資源的考察和收集，而且可為草果育種研究和新產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。本研究探明了草果水提物的組分及其構(gòu)成，且黃酮與多酚占總成分的62.32%；多酚和黃酮具有潤腸通便的功效，初步探明了其物質(zhì)基礎和作用機制（另文發(fā)表）；多酚、黃酮含量和自由基清除能力可作為草果資源的鑒定評價指標，為草果優(yōu)良種質(zhì)評價體系的建立奠定基礎；同時，本研究結(jié)果還初步揭示了不同地理環(huán)境、不同果形草果資源與多酚、黃酮成分變化的相關性。由于本研究中國外和國內(nèi)其他省份的草果資源材料較少，可能對本研究結(jié)果有一定影響。關于草果資源的起源演化與草果表型、成分含量的相關性及其變化規(guī)律，還需增加不同產(chǎn)地的草果資源和數(shù)量進行進一步的探究。