摘要： 為建立科學(xué)可靠的小豆種質(zhì)資源鑒定方法，本研究利用單核苷酸多態(tài)性（SNP）分子標(biāo)記，對102份小豆種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建指紋圖譜，同時(shí)結(jié)合質(zhì)量性狀對小豆種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在102份小豆種質(zhì)資源中26個(gè)SNP分子標(biāo)記表現(xiàn)出多態(tài)性，平均多態(tài)信息含量為0.28。61份小豆種質(zhì)資源的SNP指紋圖譜具有唯一性，可以被準(zhǔn)確鑒別，剩余41份小豆種質(zhì)資源的SNP指紋圖譜不唯一。進(jìn)一步對102份小豆種質(zhì)資源的6個(gè)質(zhì)量性狀進(jìn)行遺傳變異分析，平均遺傳多樣性指數(shù)為1.224 5，6個(gè)性狀均具有豐富的多態(tài)性。結(jié)合以上6個(gè)性狀，可對SNP指紋圖譜相同的種質(zhì)資源進(jìn)行進(jìn)一步區(qū)分。本研究開發(fā)的SNP分子標(biāo)記結(jié)合表型性狀的鑒別方法，可為小豆種質(zhì)資源遺傳鑒定和科學(xué)利用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 小豆；指紋圖譜；質(zhì)量性狀；種質(zhì)資源鑒定

中圖分類號(hào)： S521"" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A" "文章編號(hào)： 1000-4440（2024）06-0975-09

Identification of adzuki bean （Vigna angularis） germplasm resources based on SNP molecular markers and phenotypic traits

ZHANG Mingyuan， LENG Miao， SUN Weina， KE Xiwang， XU Xiaodan， ZUO Yuhu

（Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Crop-Pest Interaction Biology and Ecological Control/National Coarse Cereals Engineering Research Center/Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China）

Abstract： In order to establish a scientific and reliable method for identification of adzuki bean [Vigna angularis （Willd） Ohwi ＆ H. Ohashi] germplasm resources， 102 adzuki bean germplasm resources were clustered and fingerprinted by single nucleotide polymorphism （SNP） molecular markers， at the same time， the germplasm resources of adzuki bean were identified combined with qualitative traits. The results showed that 26 SNP molecular markers in 102 adzuki bean germplasm resources showed polymorphism， and the average polymorphism information content was 0.28. The SNP fingerprints of 61 adzuki bean germplasm resources were unique and could be accurately identified. The SNP fingerprints of the remaining 41 adzuki bean germplasm resources were not unique. The average genetic diversity index of six qualitative traits was 1.224 5 in 102 germplasm resources through further analysis of genetic variation， and all of the six traits were highly polymorphic. Combined with the above six traits， germplasm resources with the same SNP fingerprints can be further distinguished. The identification method of SNP molecular markers combined with phenotypic traits developed in this study can lay a foundation for genetic identification and scientific utilization of adzuki bean germplasm resources.

Key words： adzuki bean；fingerprint；qualitative traits；germplasm resource identification

小豆[Vigna angularis （Willd） Ohwi ＆ H. Ohashi]是菜豆族（Phaseoleae）豇豆屬（Vigna）的栽培種，由于種皮顏色多為紅色，也被稱為紅豆、紅小豆、赤豆等[1]。中國是最大的小豆生產(chǎn)國和出口國，年種植面積約3×105 hm2，年出口量達(dá)4×104～8×104 t[2]。由于小豆是小宗作物，相關(guān)研究較少，其種質(zhì)資源與大作物相比欠缺系統(tǒng)規(guī)范的研究，同名異種、同種異名現(xiàn)象較為普遍[3]。因此，準(zhǔn)確鑒別小豆種質(zhì)資源，對小豆種質(zhì)資源管理、品種鑒定、品種追溯、學(xué)術(shù)交流、知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)和科學(xué)利用等具有重要意義。

目前小豆種質(zhì)資源鑒別主要包括形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)2種方法。形態(tài)學(xué)方法主要借助植物的外部形態(tài)特征，該方法操作簡單、直接，因此被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒別和評(píng)價(jià)領(lǐng)域[4]。但形態(tài)特征尤其是數(shù)量性狀遺傳特征易受環(huán)境條件和其他修飾基因的影響，并且部分由多基因控制的數(shù)量性狀，表現(xiàn)出來的并不是簡單的性狀差異，而是一個(gè)變化范圍[4]，因此形態(tài)特征不穩(wěn)定，不適合作為種質(zhì)資源的鑒別指標(biāo)。白鵬等[5]連續(xù)2年對來自全國的262份小豆種質(zhì)資源進(jìn)行農(nóng)藝性狀鑒定后發(fā)現(xiàn)，用包括數(shù)量遺傳性狀的農(nóng)藝性狀進(jìn)行品種鑒定有一定局限性。何偉鋒等[6]認(rèn)為試驗(yàn)條件、土壤及氣候條件等的不同會(huì)導(dǎo)致數(shù)量性狀發(fā)生變化，而質(zhì)量性狀沒有變化。分子生物學(xué)的方法主要依靠分子標(biāo)記對種質(zhì)資源進(jìn)行鑒別，分子標(biāo)記指能反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，直接反映基因組DNA間的差異，可以更準(zhǔn)確、客觀、科學(xué)地評(píng)價(jià)小豆種質(zhì)的起源進(jìn)化與遺傳差異[7]。其中簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）分子標(biāo)記和單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）分子標(biāo)記是國際植物新品種權(quán)保護(hù)聯(lián)盟（UPOV，International union for the protection of new varieties of plants）BMT分子測試指南中構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫和中國《植物品種鑒定 DNA分子標(biāo)記法 總則》（NY/T 2594-2016）僅有的2種推薦標(biāo)記[8]。

目前在小豆種質(zhì)資源的鑒別中，SSR分子標(biāo)記的應(yīng)用較少。趙波等[9]利用7個(gè)SSR分子標(biāo)記對49份小豆種質(zhì)資源構(gòu)建指紋圖譜，其中8份小豆種質(zhì)資源沒有差異位點(diǎn)，無法區(qū)分。顏軍等[10]利用28個(gè)SSR分子標(biāo)記對182份小豆種質(zhì)資源構(gòu)建DNA指紋圖譜，其中有9份小豆種質(zhì)資源沒有被區(qū)分開，表明分子標(biāo)記技術(shù)在種質(zhì)資源鑒定方面存在一定局限性[11]。本實(shí)驗(yàn)室利用前期開發(fā)的6個(gè)SSR分子標(biāo)記對36份小豆種質(zhì)資源進(jìn)行鑒別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有16份種質(zhì)資源可以被完全區(qū)分[12]。SNP分子標(biāo)記因在生物基因組上具有分布廣、數(shù)量多、多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)[13]，在小豆基因定位方面的應(yīng)用逐漸增加[14-15]，然而在小豆品種鑒別上還未有應(yīng)用。近年來有多項(xiàng)研究結(jié)果表明，分子標(biāo)記和表型性狀可以在植物相似種的分類[16]和品種鑒別[17]中起到互補(bǔ)作用。本研究利用SNP分子標(biāo)記對收集、保存的102份小豆種質(zhì)資源進(jìn)行鑒別，并結(jié)合質(zhì)量性狀進(jìn)行分析，以期尋找合適的鑒定和區(qū)分小豆種質(zhì)資源的方法，為種質(zhì)資源管理、品種鑒定、品種保護(hù)、種質(zhì)資源交流和利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

102份小豆種質(zhì)資源，由國家雜糧工程技術(shù)研究中心種質(zhì)資源研究室提供，主要收集于黑龍江?。?1份）、吉林省（12份）、遼寧省（23份）、河北?。?1份）、重慶市（1份）、北京市（2份）和天津市（2份）（表1）。在同名品種后加（2）進(jìn)行區(qū)分，如小豐2號(hào)（2）。

1.2 研究方法

1.2.1 小豆田間種植 供試小豆種植于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)安達(dá)市農(nóng)業(yè)科技園區(qū)試驗(yàn)基地（N46°24′9.42″，E125°20′57.46″）。每份小豆種質(zhì)資源播種15行，行長6 m，行距0.6 m，株距0.2 m。于2022年6月19日播種，9月18日收獲，按照當(dāng)?shù)卮筇锬Ｊ焦芾怼?/p>

1.2.2 小豆種質(zhì)資源的基因組DNA提取 于人工氣候室盆栽種植供試小豆，于幼苗期每個(gè)品種取5株，每株取真葉葉片1張。采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[18]提取102份供試小豆的基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，使用Nanodrop檢測DNA濃度。

1.2.3 小豆SNP分子標(biāo)記的基因分型 以102份小豆種質(zhì)資源的基因組DNA為模板，利用26個(gè)本研究團(tuán)隊(duì)自主設(shè)計(jì)的SNP分子標(biāo)記引物進(jìn)行分型檢測，所用儀器為BIO-RAD CFX96熒光定量PCR儀。PCR擴(kuò)增體系為DNA模板1 μl（30 ng/μl），SNP Primer Mix 1.4 μl（10 μmol/l），HiGeno 2×Probe Mix B（北京嘉程生物科技有限公司產(chǎn)品）5 μl，dd H2O補(bǔ)足至10 μl。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性20 s，61～55 ℃復(fù)性和延伸40 s，10個(gè)循環(huán)（每循環(huán)1次降低 0.6 ℃）；95 ℃變性20 s，55 ℃擴(kuò)增40 s，30～34個(gè)循環(huán)，最后于25 ℃讀取熒光信號(hào)數(shù)據(jù)。擴(kuò)增結(jié)果利用Bio-Rad CFX Manager 3.0軟件Allelic Discrimination選項(xiàng)的熒光分型結(jié)果，對小豆種質(zhì)資源的SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，根據(jù)分型結(jié)果結(jié)合引物序列末端堿基統(tǒng)計(jì)每個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型，計(jì)算缺失率和多態(tài)信息含量[19]。將位點(diǎn)信息轉(zhuǎn)化為二元編碼數(shù)據(jù)，利用MEGA X64中鄰接（NJ）法進(jìn)行聚類分析，利用iTOL（https：//itol.embl.de/itol.cgi）繪制聚類分析圖[20]。根據(jù)聚類結(jié)果結(jié)合小豆種質(zhì)資源的基因型繪制SNP指紋圖譜。

多態(tài)信息含量PIC計(jì)算公式如下：

PIC=1-1i=1P2i-l-1i=1lj=i+12P2iP2j

式中，Pi和Pj分別為第i個(gè)和第j個(gè)等位基因的頻率。

1.2.4 小豆質(zhì)量性狀調(diào)查及聚類分析 小豆質(zhì)量性狀調(diào)查參照《小豆種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[21]，隨機(jī)選取成熟期小豆種質(zhì)資源15株，調(diào)查生長習(xí)性、結(jié)莢習(xí)性、莢形、粒形、單葉葉色、單葉葉形，部分小豆質(zhì)量性狀表型見圖1，共計(jì)6個(gè)質(zhì)量性狀，對其進(jìn)行非數(shù)值型性狀賦值，記錄標(biāo)準(zhǔn)和賦值數(shù)據(jù)見表2。計(jì)算頻率分布和多樣性指數(shù)（H′，香農(nóng)-維納指數(shù)，Shannon-Wiener diversity index）[5]，利用Excel繪制SNP分子標(biāo)記結(jié)合表型性狀圖譜。

多樣性指數(shù)（H′）的計(jì)算公式如下：

H′=-Pi×lnPi

式中，Pi為某一性狀第i個(gè)級(jí)別出現(xiàn)的頻次。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于SNP分子標(biāo)記的小豆種質(zhì)資源鑒別

2.1.1 SNP分子標(biāo)記的多態(tài)性分析 本研究團(tuán)隊(duì)基于小豆種質(zhì)資源的重測序數(shù)據(jù)，開發(fā)了32個(gè)小豆SNP分子標(biāo)記，利用這些分子標(biāo)記對供試的102份小豆種質(zhì)資源進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)其中的26個(gè)SNP分子標(biāo)記表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性，占供試標(biāo)記數(shù)的81%。依據(jù)26個(gè)SNP分子標(biāo)記對基因進(jìn)行分型，結(jié)果顯示26個(gè)SNP分子標(biāo)記的檢測缺失率為0～15.69%，平均缺失率為4.18%，其中分子標(biāo)記SNP-4和SNP-30的缺失率較高，分別為15.69%和11.76%（表3）。26個(gè)SNP分子標(biāo)記的多態(tài)信息含量為0.06～0.36，平均為0.28，其中SNP-15、SNP-34、SNP-35標(biāo)記的多態(tài)信息含量最低，SNP-19、SNP-22、SNP-30標(biāo)記的多態(tài)信息含量最高。

2.1.2 小豆種質(zhì)資源SNP指紋圖譜構(gòu)建 利用26個(gè)SNP分子標(biāo)記，結(jié)合SNP分子標(biāo)記聚類結(jié)果，構(gòu)建小豆種質(zhì)資源的SNP分子標(biāo)記指紋圖譜（圖2）。供試的26個(gè)SNP分子標(biāo)記可以準(zhǔn)確區(qū)分61份小豆種質(zhì)資源。其中遼紅1號(hào)和遼紅3號(hào)的SNP指紋圖譜相同，遼V2白紅1號(hào)、吉綠5號(hào)和寶清紅系選的SNP指紋圖譜相同，012-27和天津紅（2）的SNP指紋圖譜相同，LZX051、大紅袍、小豐2號(hào)（2）和012-8的SNP指紋圖譜相同，白紅9號(hào)和冀紅0007-5的SNP指紋圖譜相同，紅豆XD04-07、北4 NL8、北23、北25 F174、保M908-15、遼紅08712和京農(nóng)6號(hào)的SNP指紋圖譜相同，建265、品紅23129-1、小豐2號(hào)和遼紅7號(hào)的SNP指紋圖譜相同，QH2、GN05和遼紅7號(hào)的SNP指紋圖譜相同，TL01、遼V5和TL06的SNP指紋圖譜相同，GN02、系選大紅袍-1和吉林362的SNP指紋圖譜相同，保876-16（2）、品紅2011-18和JHPX01的SNP指紋圖譜相同，TL04、極旱紅小豆、北6 JN003、龍墾早紅和北13 F015的SNP指紋圖譜相同。

2.2 基于質(zhì)量性狀的小豆種質(zhì)資源鑒別

2.2.1 小豆種質(zhì)資源質(zhì)量性狀遺傳變異分析 對易于區(qū)分小豆不同類型的6個(gè)質(zhì)量性狀（生長習(xí)性、結(jié)莢習(xí)性、莢形、粒形、單葉葉色、單葉葉形）進(jìn)行多態(tài)性分析。由分布頻率（表4）可以看出，102份小豆種質(zhì)資源的生長習(xí)性以蔓生為主，占比44.12%；結(jié)莢習(xí)性以無限結(jié)莢為主，占比76.47%；莢形以鐮刀形為主，占比60.78%；粒形以長圓柱形為主，占比43.14%；單葉葉色以綠色為主，占比57.84%；單葉葉形以圓形為主，占比68.63%。6個(gè)質(zhì)量性狀的遺傳多樣性指數(shù)為0.787 1～1.548 7，平均值為1.224 5。其中，生長習(xí)性的遺傳多樣性指數(shù)最高，結(jié)莢習(xí)性的遺傳多樣性指數(shù)最低。

2.2.2 SNP分子標(biāo)記結(jié)合表型性狀鑒別小豆種質(zhì)資源 SNP指紋圖譜相同的種質(zhì)資源，可以進(jìn)一步結(jié)合表型性狀進(jìn)行劃分（圖3）。SNP指紋圖譜相同的小豆種質(zhì)資源在生長習(xí)性、結(jié)莢習(xí)性、莢形、粒形、單葉葉色和單葉葉形方面不完全相同。SNP指紋圖譜相同的遼紅1號(hào)和遼紅3號(hào)，生長習(xí)性、單葉葉色和單葉葉形不同。SNP指紋圖譜相同的遼V2白紅1號(hào)和吉綠5號(hào)生長習(xí)性、結(jié)莢習(xí)性、粒形、單葉葉色和單葉葉形不同。SNP指紋圖譜相同的天津紅（2）和012-27的粒形、單葉葉色和單葉葉形不同。SNP指紋圖譜相同的LZX051、大紅袍、小豐2號(hào)（2）和012-8的生長習(xí)性、結(jié)莢習(xí)性和莢形相同。SNP指紋圖譜相同的白紅9號(hào)和冀紅0007-5的生長習(xí)性、結(jié)莢習(xí)性和莢形不同。SNP指紋圖譜相同的保M908-15、遼紅08712和京農(nóng)6號(hào)結(jié)莢習(xí)性和莢形相同，紅豆 XD04-07、北4 NL8、北23和北25 F174莢形和單葉葉形相同。SNP指紋圖譜相同的遼紅7號(hào)、小豐2號(hào)和品紅23129-1莢形相同，建265與品紅23129-1結(jié)莢習(xí)性和莢形不同。SNP指紋圖譜相同的遼紅7、GN05和QH2粒形相同。SNP指紋圖譜相同的TL01、遼V5和TL06的單葉葉形相同。SNP指紋圖譜相同的GN02、系選大紅袍-1和吉林362結(jié)莢習(xí)性相同。SNP指紋圖譜相同的JHPX01和品紅2011-18生長習(xí)性、結(jié)莢習(xí)性、莢形、粒形、單葉葉色、單葉葉形均不相同。品紅2011-18和保876-16（2）生長習(xí)性和粒形不同。SNP指紋圖譜相同的北13 F015、龍墾早紅、北6 JN003和極旱紅小豆結(jié)莢習(xí)性、單葉葉色和單葉葉形相同，極旱紅小豆和TL04莢形相同。

3 討論

國際植物新品種權(quán)保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）BMT分子測試指南中，構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫的標(biāo)記包括SSR和SNP 2種[8]，與SSR相比，SNP在基因組中含量更豐富。張昆鵬[22]比較SSR分子標(biāo)記與SNP分子標(biāo)記構(gòu)建的指紋圖譜時(shí)發(fā)現(xiàn)，使用SNP分子標(biāo)記分析品種間遺傳相似系數(shù)，計(jì)算更精準(zhǔn)，結(jié)果更可靠。2021年6月20日全國農(nóng)技中心組織專家組在北京召開農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)審定會(huì)議，通過了《水稻品種真實(shí)性鑒定 SNP標(biāo)記法》（NY/T 2745-2021）和《小麥品種真實(shí)性鑒定 SNP標(biāo)記法》（NY/T 4021-2021），標(biāo)志著利用SNP技術(shù)進(jìn)行農(nóng)作物品種真實(shí)性鑒定將成為今后的主流方法。王澤涵等[23]利用24個(gè)SNP分子標(biāo)記鑒別出74份茶樹種質(zhì)資源。顏廷進(jìn)等[24]利用46個(gè)SNP分子標(biāo)記，鑒別出198份菜豆種質(zhì)資源。而本研究所開發(fā)的26個(gè)SNP分子標(biāo)記，可以鑒別出61份小豆種質(zhì)資源，這可能是由于選用的標(biāo)記中有些標(biāo)記為功能基因相關(guān)標(biāo)記，多態(tài)性相對較低。另外41份小豆種質(zhì)資源的分子標(biāo)記指紋圖譜有重復(fù)，無法區(qū)別，這可能是由于親緣關(guān)系較近或所選取的標(biāo)記數(shù)量較少。在前人的研究中也有類似情況，José等[25]利用48個(gè)SNP分子標(biāo)記對200個(gè)葡萄品種進(jìn)行了基因分型，有5份親緣關(guān)系極其相近的葡萄品種沒有被區(qū)分開。Jing等[26]利用40個(gè)SNP標(biāo)記對辣椒的栽培品種進(jìn)行分析，可以鑒別出97.5%的辣椒栽培品種以及全部的甜椒栽培品種。增加SNP分子標(biāo)記的數(shù)量或許可以進(jìn)一步區(qū)分小豆種質(zhì)資源，但是SNP分子標(biāo)記仍難以區(qū)分親緣關(guān)系較近的小豆種質(zhì)資源[27]，且成本較高[24]。

形態(tài)性狀的鑒定和描述是種質(zhì)資源研究最基本的方法和途徑，是種以上或種內(nèi)分類的重要依據(jù)之一[28]。小豆具有豐富的遺傳多樣性，本研究所選取的質(zhì)量性狀的遺傳多樣性指數(shù)為0.787 1～1.548 7，其中生長習(xí)性、莢形、粒形、單葉葉色的多樣性指數(shù)＞1.000 0，可以看出這些質(zhì)量性狀變異幅度較大，這與龍玨臣等[29]的研究結(jié)果一致。金文林等[30]對小豆農(nóng)藝性狀的遺傳參數(shù)變化規(guī)律的研究結(jié)果表明，主莖節(jié)數(shù)、單莢粒數(shù)、單株產(chǎn)量、株高和單株莢數(shù)等均為數(shù)量遺傳性狀，受環(huán)境影響大，表現(xiàn)不穩(wěn)定。Aoyama等[31]對小豆矮化突變體的研究結(jié)果表明，矮小的表型是通過有絲分裂和減數(shù)分裂遺傳的，由遺傳不穩(wěn)定的基因座控制。鑒于表型數(shù)量遺傳性狀的遺傳不穩(wěn)定性，本研究進(jìn)行表型鑒別時(shí)僅選取質(zhì)量性狀，未選擇受環(huán)境條件影響較大的數(shù)量性狀，避免在種質(zhì)資源鑒定中出現(xiàn)誤差 [5-6]，保證鑒定結(jié)果的可靠性。

SNP指紋圖譜已被應(yīng)用于長節(jié)耳草[16]和漆樹[17]的分類中。SNP指紋圖譜相同的種質(zhì)資源具有不同的形態(tài)學(xué)特征，這是因?yàn)樗_發(fā)的分子標(biāo)記所在位點(diǎn)與表型性狀之間不具備足夠的關(guān)聯(lián)性[14]，這與劉洪等[11]、呂建珍等[32]對花生和谷子的研究結(jié)果一致。本研究采用的SNP分子標(biāo)記結(jié)合質(zhì)量性狀分析可對小豆種質(zhì)資源進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別，在供試的102份小豆種質(zhì)資源中未出現(xiàn)重復(fù)種質(zhì)資源，并準(zhǔn)確鑒別重名種質(zhì)資源，為小豆種質(zhì)資源遺傳鑒定、交流和科學(xué)利用提供了技術(shù)支撐。

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（責(zé)任編輯：成紓寒）

收稿日期：2023-07-05

基金項(xiàng)目：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)校啟動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目（2031011068）；大慶市科學(xué)技術(shù)局指導(dǎo)項(xiàng)目（zd-2020-45）

作者簡介：張明媛（1996-），女，河北邢臺(tái)人，碩士研究生，主要從事植物病理學(xué)研究。（E-mail）zhangmingyuan2333@gmail.com

通訊作者：徐曉丹，（E-mail）xxdalice@163.com；左豫虎，（E-mail）zuoyuhu@byau.edu.cn