關(guān)鍵詞：煙草花葉病毒；CP基因；RT-LAMP；特異性；靈敏度

煙草花葉病毒（Tobacco mosaLc VLrUS，TMV）是目前云南煙草生產(chǎn)中發(fā)生最普遍、分布最廣的病毒，屬帚狀病毒科（ Vigaviridae）煙草花葉病毒屬（Tobamovirus），可以通過機(jī)械接種、嫁接、植物之間的接觸和種子傳播，但不能通過任何已知的媒介傳播。目前，已報(bào)道TMV可侵染莧科、藜科、菊科、十字花科、茄科等38科300余種植物。TMV侵染作物后，會破壞葉綠素，使光合作用減弱，造成植物生長困難、發(fā)育不良，葉片厚薄不均、葉緣向下卷曲、明脈、矮化、花葉、斑駁、黃化畸形甚至整株死亡。TMV很難防控，對煙草、番茄、黃瓜和蘭花等多種經(jīng)濟(jì)作物及花卉等觀賞植物造成嚴(yán)重?fù)p失，目前的主要防治措施為培育抗病品種和選種無毒健苗。

TMV感染初期癥狀不明顯，且常與黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaLc VLrUS，CMV）、馬鈴薯Y病毒（Potato virus y，PVY）等病毒混合侵染，田間發(fā)病癥狀相似，病原診斷困難。傳統(tǒng)的煙草病毒病診斷方法包括培養(yǎng)、電鏡觀察、免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)等，但這些方法通常具檢測效率低、需要專業(yè)設(shè)備、樣品制備耗時長、對實(shí)驗(yàn)操作要求嚴(yán)格等缺點(diǎn)，大大限制了其在實(shí)際生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediatedisothermal amplification，LAMP）于2000年由日本學(xué)者Notomi等發(fā)明，針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計(jì)6條特異引物，結(jié)合DNA鏈置換聚合酶（BstDNA polymerase）使模板兩端引物結(jié)合部位循環(huán)出現(xiàn)環(huán)狀單鏈結(jié)構(gòu)，由此使得引物在恒溫條件下可以與靶基因結(jié)合發(fā)生鏈置換完成擴(kuò)增反應(yīng)。在LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物中加入熒光染料可直接觀察結(jié)果，節(jié)省了常規(guī)PCR反復(fù)升降溫度的時間，具有檢測速度快、靈敏度高、不需要專業(yè)設(shè)備的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）、香蕉苞片花葉病毒（Banana bract mo-saLc VLrUS，BBrMV）等的檢測。

TMV基因組為正義單鏈ssRNA，長6395bp，至少編碼4個蛋白，其中外殼蛋白（coat protein，CP）參與癥狀誘導(dǎo)，對病毒的遠(yuǎn)距離運(yùn)動至關(guān)重要。CP基因序列保守性較高，常被應(yīng)用于TMV檢測技術(shù)的開發(fā)。Zhao等研究表明．RT-LAMP體系因擴(kuò)增的特異性位點(diǎn)不同可對株系進(jìn)行區(qū)分。因此，已報(bào)道的基于其他地區(qū)TMV建立的RT-LAMP體系不一定能較好地?cái)U(kuò)增云南煙草TMV。目前，已報(bào)道的有基于陜西煙草、山東煙草、青島煙草TMV的RT-LAMP檢測方法，但是檢測時間都較長且不確定是否適用于云南煙草TMV的檢測。

本研究評估了已報(bào)道的3種RT-LAMP檢測體系對于云南煙草TMV的檢測效率，然后基于云南煙草TMV分離物的CP基因保守序列設(shè)計(jì)5組引物進(jìn)行篩選，對反應(yīng)體系各組分進(jìn)行逐一優(yōu)化，并通過特異性、靈敏度檢測等對其效果進(jìn)行評估，以期建立適用于云南煙草TMV的RT-LAMP檢測體系，為TMV早期快速診斷及防治提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1病毒樣品

本研究中使用的煙草花葉病毒、馬鈴薯Y病毒、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）、番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒（Tomato zonate spot vi-rus，TZSV）、南美紅辣椒脈斑駁病毒（Chilli veinalmottle virus，ChiVMV）、番茄褐色皺紋果病毒（To-mato brown rugose fruit virus．ToBRFV）、黃瓜花葉病毒、煙草脈帶花葉病毒（Tobacco veLn bandingmosaLc VLrUS，TVBMV）、朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspotvirus，HCRV）等，均由云南省高校作物種質(zhì)創(chuàng)新與可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室純化保存后接種于本氏煙，樣本經(jīng)RT-PCR檢測確認(rèn)含有單一病毒后，-80℃保存?zhèn)溆?。以室溫生長的健康脫毒煙草為陰性對照。

1.2主要試劑

TRNzol Universal總RNA提取試劑購自天根科技（北京）有限公司；MgS04（100mmol/L）、WarmStart通用LAMP/RT-LAMP 2x預(yù)混液、Bst2.0DNA聚合酶購自美國New England Biolabs公司；Uracil-DNA Glycosylase購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promege公司；甜菜堿、熒光指示劑SYBR Green I購自北京索萊寶科技有限公司；dNTPs（10 mmol/L）購自上海CWBIO公司；HiScriptⅡlst strand cDNA Syn-thesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑購自江蘇Vazyme公司。

1.3引物設(shè)計(jì)

在GenBank數(shù)據(jù)庫中挑選來自云南煙草的TMV分離物CP基因（登錄號：KC572633），將其保守區(qū)域作為引物設(shè)計(jì)的參考序列，通過在線軟件Primer Explorer V5（http：//primerexplorer. jp/e/）設(shè)計(jì)5組RT-LAMP引物和1組RT-PCR引物（表1）。其中，F(xiàn)3和B3為外引物，F(xiàn)IP和BIP為內(nèi)引物；LF/LB為環(huán)引物。RT-PCR引物目的片段大小為570bp。所有引物均用PAGE法純化，委托生工生物工程（成都）有限公司合成。

1.4RNA提取

參照TRNzol Universal總RNA提取試劑說明書提取新鮮煙草葉片總RNA，1.2%瓊脂糖凝膠電泳測定RNA的質(zhì)量，-80℃保存?zhèn)溆谩?.5RT-PCR檢測及已報(bào)道的RT-LAMP體系驗(yàn)證

以總RNA為模板，采用PrimeScriptrrMⅡlststrand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cD-NA。以等體積cDNA為模板，利用TMV - F/R引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物質(zhì)量。使用Zhao等、Liu等、張俊建立的TMV RT-LAMP體系檢測上述RT-PCR產(chǎn)物，評估其對云南煙草TMV的適用性。

1.6RT-LAMP引物篩選

參照Bst 2.0 Warm StartDNA Polymerase說明書，用1.3中的5組RT-LAMP引物對TMV進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下。每組分別以健康脫毒煙草的RNA為陰性對照，62℃恒溫?cái)U(kuò)增60min。擴(kuò)增產(chǎn)物加1000xSYBRGreen 1uL進(jìn)行染色，熒光綠為陽性，橙黃色為陰性。取擴(kuò)增產(chǎn)物4uL進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，梯狀條帶為陽性，無條帶為陰性。篩選出一組擴(kuò)增效率高且不出現(xiàn)假陽性的引物進(jìn)行反應(yīng)體系優(yōu)化。

1.7RT-LAMP體系優(yōu)化

為確定最佳擴(kuò)增條件，采用單一變量法，每個條件設(shè)3次重復(fù)，對RT-LAMP體系各條件進(jìn)行逐一優(yōu)化。每個變量分別設(shè)置梯度試驗(yàn)：反應(yīng)溫度58、60、62、64、66、68℃；反應(yīng)時間20、30、40、50、60、70min;甜菜堿濃度0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mmol/L; dNTPs濃度0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L；Mg2+濃度0、2、4、6、8、10mmol/L;內(nèi)、外引物濃度比1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1。每個梯度分別以健康脫毒煙草的RNA為陰性對照，反應(yīng)結(jié)束后取擴(kuò)增產(chǎn)物4uL進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8RT-LAMP與RT-PCR靈敏度比較

在最佳反應(yīng)條件下，將云南煙草TMV的總RNA 10倍梯度稀釋（100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），以稀釋后的RNA作為RT -LAMP和RT-PCR的模板，進(jìn)行靈敏度比較測試。SYBR Green I染色和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.9RT-LAMP特異性檢驗(yàn)

在最佳反應(yīng)條件下，以9種煙草常見病毒：TMV、PVY、TSWV、TZSV、ChiMV、ToBRFV、CMV、TVBMV、HCRV的RNA為模板，分析檢測交叉反應(yīng)性，以評估所建立RT-LAMP體系的特異性，SYBR Green I染色和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

2結(jié)果與分析

2.1RT-PCR檢測及已報(bào)道的RT-LAMP體系驗(yàn)證

使用TMV-F/R引物檢測云南煙草TMV（圖IA），結(jié)果顯示，TMV樣品擴(kuò)增出相關(guān)DNA片段，電泳檢測結(jié)果與目的片段大小（570bp）-致且無雜帶；而陽性對照未擴(kuò)增到目標(biāo)條帶。表明樣品被TMV侵染，而陰性對照未被TMV侵染，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

分別使用Zhao等、Liu等、張俊建立的TMV RT-LAMP體系檢測云南煙草TMV分離物，結(jié)果（圖1B）顯示，Liu等的體系對樣品有少量擴(kuò)增，陰性對照未擴(kuò)增；Zhao等和張俊的體系陰性對照和樣品均未擴(kuò)增。表明這3種體系對云南煙草TMV樣品的檢測效率均不高，有必要建立適用于云南煙草的TMV RT-LAMP檢測體系。

2.2引物篩選

根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（圖2A），第1～4組引物均擴(kuò)增出梯狀條帶且未出現(xiàn)假陽性，第4組引物條帶最亮：第5組引物擴(kuò)增出較弱條帶且陰性對照未出現(xiàn)假陽性。熒光檢測與凝膠電泳檢測結(jié)果一致（圖2B）。選定第4組引物為最佳引物以進(jìn)行反應(yīng)條件優(yōu)化。

2.3反應(yīng)條件優(yōu)化

2.3.1反應(yīng)時間優(yōu)化用第4組引物擴(kuò)增時，反應(yīng)20～30min未擴(kuò)增出條帶．40min開始出現(xiàn)明亮的梯狀條帶（圖3A），熒光檢測與凝膠電泳檢測結(jié)果一致（圖3B），陰性對照均未出現(xiàn)假陽性。結(jié)合高效性考慮，選擇最佳反應(yīng)時間為40 min。2.3.2反應(yīng)溫度優(yōu)化反應(yīng)溫度優(yōu)化結(jié)果（圖4）表明，擴(kuò)增溫度為58～68℃時均有梯狀條帶產(chǎn)生，陰性對照均未出現(xiàn)假陽性。但溫度為58。C時梯狀條帶較淡，60～68℃時梯狀條帶較明亮，熒光檢測與凝膠電泳檢測結(jié)果一致。結(jié)合實(shí)用性考慮，選擇最佳反應(yīng)溫度為60℃。

2.3.3甜菜堿濃度優(yōu)化甜菜堿濃度優(yōu)化結(jié)果（圖5）表明，甜菜堿濃度為0時幾乎沒有梯狀條帶，0.6～1.6mmol/L均有梯狀條帶，1.6mmol/L時梯狀條帶最亮，陰性對照均未出現(xiàn)假陽性，熒光檢測與凝膠電泳檢測結(jié)果一致。結(jié)合降低檢測成本考慮，選擇最佳甜菜堿濃度為0.6mmol/L。

2.3.4dNTPs濃度優(yōu)化dNTPs濃度優(yōu)化結(jié)果（圖6）表明，dNTPs濃度為0時沒有梯狀條帶產(chǎn)生，從0.2～0.4mmol/L梯狀條帶較為明亮，0.6mmol/L開始梯狀條帶逐漸減弱，陰性對照均未出現(xiàn)假陽性，熒光檢測與凝膠電泳檢測結(jié)果一致。結(jié)合降低檢測成本考慮，選擇最佳dNTPs濃度為0.4mmol/L。

2.3.5Mg2+濃度優(yōu)化Mg2+濃度優(yōu)化結(jié)果（圖7）表明，Mg2+濃度為0時沒有梯狀條帶產(chǎn)生，2～8mmol/L梯狀條帶亮度逐漸增強(qiáng)，陰性對照均未出現(xiàn)假陽性，熒光檢測與凝膠電泳檢測結(jié)果一致。結(jié)合降低檢測成本及避免假陽性考慮，選擇最佳Mg2+濃度為2mmol/L。

2.3.6內(nèi)、外引物濃度比優(yōu)化內(nèi)、外引物濃度比優(yōu)化結(jié)果（圖8）表明，內(nèi)、外引物濃度比為1：1～4：1時梯狀條帶亮度逐漸增強(qiáng)，4：1～8：1梯狀條帶亮度趨于穩(wěn)定，陰性對照均未出現(xiàn)假陽性，熒光檢測與凝膠電泳檢測結(jié)果一致。結(jié)合降低檢測成本考慮，選擇最佳內(nèi)、外引物濃度比為4：1。

2.4靈敏度檢測

靈敏度檢測結(jié)果表明，稀釋倍數(shù)為10～10-6時，RT-LAMP可以擴(kuò)增出梯狀條帶，隨著稀釋倍數(shù)的增加，條帶變?nèi)酰?0-7時梯狀條帶消失．即RT-LAMP的檢測限為10-6（圖9A），熒光檢測與凝膠電泳檢測結(jié)果一致（圖9B）。而RT-PCR在10～10-5時，隨著稀釋倍數(shù)的增加，條帶變?nèi)酰?0-6時條帶消失，即RT-PCR的檢測限為10-5（圖9C）。因此，本研究建立的RT-LAMP檢測體系靈敏度為傳統(tǒng)的RT-PCR方法的10倍。

2.5特異性檢測

特異性檢測結(jié)果（圖10）表明，該RT-LAMP體系從云南煙草TMV中擴(kuò)增出梯狀條帶，而在其他病毒（PVY、TSWV、TZSV、ChiVMV、ToBRFV、CMV、TVBMV、HCRV）及陰性對照中均未擴(kuò)增出條帶，熒光檢測與凝膠電泳檢測結(jié)果一致。表明建立的RT-LAMP體系具有良好的特異性。

3討論與結(jié)論

煙草是云南經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)，然而由TMV引起的煙草花葉病在云南煙草種植區(qū)廣泛發(fā)生，嚴(yán)重影響煙草的產(chǎn)量及品質(zhì)。篩選無毒健苗是目前防治TMV的有效方法之一，然而TMV傳播速度極快，早期無明顯癥狀，且易與其他病毒發(fā)生復(fù)合侵染，田間癥狀十分復(fù)雜，給煙草病害的防治帶來諸多困難，嚴(yán)重制約了煙草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前已有的檢測方法不適用于實(shí)際生產(chǎn)中TMV的快速、準(zhǔn)確、簡便檢測，急需建立適用于云南煙草TMV的快速檢測技術(shù)以支持煙苗檢疫。LAMP檢測技術(shù)成本低、靈敏度高、操作簡單，反應(yīng)結(jié)果肉眼就可判斷，特別適合基層機(jī)構(gòu)應(yīng)用。本研究建立了針對云南煙草TMV的RT-LAMP檢測體系，僅需60℃恒溫反應(yīng)40min即可通過熒光顯色劑直接觀察結(jié)果，無需借助復(fù)雜儀器設(shè)備，不與其他煙草常見病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，靈敏度是常規(guī)RT-PCR的10倍，檢測成本低，檢測效率高，適合基層單位對大量樣品進(jìn)行煙草TMV檢測。

植物病毒株系具有多樣性，準(zhǔn)確檢測病毒株系是許多研究的必要條件。由于RT-LAMP反應(yīng)時，6個區(qū)域都被4個引物匹配才可以進(jìn)行擴(kuò)增，所以該方法特異性較高，具備區(qū)分株系的能力。Zhao等根據(jù)PVY-0的CP基因設(shè)計(jì)了特異引物，并使用PrimerExplorer V4軟件確定他們不能識別其他PVY-N、N-Wi和NTN株系，間接證明了RT-LAMP能夠?qū)崿F(xiàn)對TMV株系的鑒定。TMV分布范圍廣，不同地域間的株系有很大差異。煙草上的株系主要有TMV-OM、TMV-U1、TMV-Vulgare、TMVRS、TMVC、TMVN、TMVY，云南煙草TMV主要屬于TMV-U1株系．山東煙草TMV主要屬于TMVC、TMVN、TMVY、TMVSR株系，陜西煙草TMV的優(yōu)勢株系尚未見報(bào)道。Liu等、Zhao等、張俊分別建立了針對山東煙草、陜西煙草和青島煙草TMV的RT-LAMP檢測體系，有必要建立適用于云南煙草的RT -LAMP檢測體系。

Nagamine等的研究顯示，在4條引物的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)出環(huán)引物，使之與莖環(huán)和鏈置換DNA雜交，可將反應(yīng)時間從1.0～1.5h縮短至30min左右：呂沁風(fēng)等在建立惡性瘧原蟲的LAMP體系過程中發(fā)現(xiàn)，在普通加環(huán)引物檢測的基礎(chǔ)上，加入第2對環(huán)引物可將檢測時間縮短10min;謝學(xué)文等在茄匍柄霉的LAMP體系中加入環(huán)引物使反應(yīng)時間縮短至27min。Zhao等、Liu等、張俊建立的TMV RT-LAMP檢測體系檢測時間都是60min，且Liu等、Zhao等并未添加環(huán)引物。本研究建立的云南煙草TMV的RT-LAMP檢測體系添加了1對環(huán)引物，將反應(yīng)時間縮短至40min，在保證體系穩(wěn)定的基礎(chǔ)上提升了田間TMV病樣的檢測效率。

綜上所述，本研究針對云南煙草建立并優(yōu)化了TMV的RT-LAMP檢測體系，進(jìn)一步完善了檢測不同株系TMV的RT-LAMP檢測方法，檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確。該方法設(shè)備成本低、快速簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)，可用于試劑盒開發(fā)，為田間樣品及無毒煙苗的檢測和生產(chǎn)提供技術(shù)支持。