邵宏秋，魏巍，黃曉娜，李景新，魏國(guó)良，張蕓暢，修華謙，劉婷婷，王宇迪，孫博，盧井才，石亮

1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130018；2.長(zhǎng)春百克生物科技股份公司，吉林 長(zhǎng)春 130013；3.長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林 長(zhǎng)春 130062；4.吉林省藥品監(jiān)督管理局長(zhǎng)春檢查分局，吉林 長(zhǎng)春 130000；5.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130000

水痘-帶狀皰疹病毒（varicella-herpes zoster virus，VZV）是一種可引起水痘和帶狀皰疹的病原體，屬人類皰疹病毒α 亞科，具有嗜神經(jīng)性，在人群中可通過(guò)呼吸道及密切接觸進(jìn)行傳播，能夠引發(fā)水痘和帶狀皰疹兩種不同臨床癥狀的疾?。?-3］。初次感染VZV可引起水痘，宿主免疫力低下時(shí)，病毒可再次激活引起帶狀皰疹［4-5］。人類對(duì)該病毒易感，目前，接種水痘減毒活疫苗和帶狀皰疹減毒活疫苗是最有效的預(yù)防方式［6-11］。各國(guó)生產(chǎn)水痘疫苗均采用人二倍體細(xì)胞，根據(jù)WHO 關(guān)于疫苗生產(chǎn)中用于病毒檢定等的抗血清的要求，免疫用病毒的毒株和培養(yǎng)用細(xì)胞應(yīng)不同于疫苗生產(chǎn)所用毒株和細(xì)胞系［12-16］。

VZV 具有嗜神經(jīng)性，可潛伏在神經(jīng)系統(tǒng)，部分人群不能完全清除，當(dāng)再次激活時(shí)可隨神經(jīng)節(jié)傳導(dǎo)引發(fā)帶狀皰疹等表面皮膚病，常伴隨神經(jīng)疼痛的癥狀，可持續(xù)數(shù)月或數(shù)年，給患者生活帶來(lái)極大困擾。在VZV 包膜表面，有g(shù)E、gB、gH、gI、gK、gN、gC 和gL 等8種糖蛋白，這些糖蛋白在病毒成熟及包裝方面發(fā)揮重要作用。其中，gE蛋白因其完整的結(jié)構(gòu)，病毒表面表達(dá)最豐富，在病毒傳播中發(fā)揮重要作用［17-18］，同時(shí)也是誘導(dǎo)宿主體液免疫和細(xì)胞免疫的主要抗原之一。因此，gE 蛋白成為水痘疫苗和帶狀皰疹疫苗的核心蛋白［19］。

在水痘減毒活疫苗生產(chǎn)過(guò)程中，需對(duì)毒種進(jìn)行嚴(yán)格的外源病毒因子檢查，確保無(wú)外源病毒污染，并且需對(duì)毒種及成品進(jìn)行鑒別試驗(yàn)。在進(jìn)行外源病毒因子檢查及鑒別試驗(yàn)時(shí)，需對(duì)樣品中VZV進(jìn)行中和，但國(guó)內(nèi)至今尚無(wú)VZV 中和抗體標(biāo)準(zhǔn)品［19-20］。目前大多數(shù)廠家采用自制抗體，免疫原多為VZV，制備過(guò)程中使用動(dòng)物源性細(xì)胞且純度不高，因此，采用高度純化的抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫制備高效價(jià)中和抗體，是保證產(chǎn)品安全至關(guān)重要的因素［21］。

gE 糖蛋白是VZV 抗原性最強(qiáng)、含量最豐富的外膜蛋白，是目前制備帶狀皰疹亞單位疫苗重要的候選蛋白。VZV 的gE 糖蛋白具有高度保守性，目前已應(yīng)用于重組帶狀皰疹疫苗中［22-25］。本研究以純化的重組gE 蛋白為免疫原制備高效價(jià)中和抗體，并將其應(yīng)用于水痘減毒活疫苗質(zhì)量控制中。

1 材料與方法

1.1 疫苗、細(xì)胞及毒株 重組帶狀皰疹疫苗（CHO 細(xì)胞），0.5 mL／劑，批號(hào)：AM4NS，購(gòu)自葛蘭素史克（GSK）公司；VZV（Oka 株）工作種子批毒種（批號(hào)：91001）、Vero細(xì)胞、MRC-5細(xì)胞、WI-38細(xì)胞、水痘減毒活疫苗（參考品，批號(hào)：201903026-1）、牛副流感病毒由長(zhǎng)春百克生物科技股份公司制備并提供。

1.2 主要試劑 弗氏完全佐劑（10 mL／支，批號(hào)：SLCD6299）、弗氏不完全佐劑（10 mL／支，批號(hào)：SLCB8702）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；水痘病毒特異性免疫血清、gE糖蛋白、氫氧化鋁佐劑及MF59佐劑由長(zhǎng)春百克生物科技股份公司制備，考馬斯亮藍(lán)R250染色液、0.94%MEM 溶液、0.25%胰蛋白酶溶液由該公司質(zhì)量控制部提供；新生牛血清（批號(hào)：20171111）購(gòu)自蘭州榮曄生物科技有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)新西蘭兔，雄性，11周齡，體質(zhì)量2.0 ~ 2.5 kg，購(gòu)自青島康大生物科技有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（魯）20210003，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查號(hào)：BCHT-AEEI-2022-001。本實(shí)驗(yàn)均以科研為目的進(jìn)行新西蘭兔的養(yǎng)殖和使用，并按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行（GB／T 35892-2018）。

1.4 VZV特異性免疫血清的制備

1.4.1 動(dòng)物分組及免疫 為探討gE 蛋白制備高效價(jià)中和抗體的可行性，采用多種免疫組合方式進(jìn)行分組。免疫1 組：重組帶狀皰疹疫苗（CHO 細(xì)胞）。免疫2 組：gE 糖蛋白+弗氏佐劑。將gE 糖蛋白用PBS稀釋至2 mg／mL，與弗氏佐劑按1∶1 混合乳化，備用；初次免疫使用弗氏完全佐劑，第2 次及以后免疫使用弗氏不完全佐劑，免疫劑量為1.0 mL／只。免疫3 組：gE 糖蛋白+氫氧化鋁佐劑。將gE 糖蛋白稀釋至2 mg／mL，與氫氧化鋁佐劑（2.5 mg／mL）按1∶1混合，2~8 ℃振蕩混勻，每10 min混勻1次，時(shí)長(zhǎng)1 h，備用；免疫劑量為1.0 mL／只。免疫4組：gE糖蛋白+ MF59 佐劑。將gE 糖蛋白稀釋至2 mg／mL，與MF59佐劑按1∶1混合，備用；免疫劑量為1.0 mL／只。免疫1 和4 組兔經(jīng)后腿肌內(nèi)免疫，每只注射1 點(diǎn)，共2點(diǎn)／次；免疫2和3組經(jīng)背部皮下免疫，0.1~0.3mL／點(diǎn)，每只至少注射5 個(gè)點(diǎn)（應(yīng)在30 min 內(nèi)完成）。每組免疫2只兔。除免疫1組進(jìn)行2次免疫外，其余3組均進(jìn)行4 次免疫，免疫間隔14 d。試驗(yàn)設(shè)免疫5 組（VZV對(duì)照組）：皮下免疫VZV，1.0 mL／只。

1.4.2 采血 免疫前每只兔經(jīng)耳靜脈采血1.0 mL，離心分離血清作為免疫前對(duì)照血清。免疫1 組于免疫后14 d，每只采血1.0 mL，離心分離血清；免疫后第28 天每只均最大量采血（心臟或頸動(dòng)脈），室溫靜止1 h 后，離心分離血清。免疫2、3、4 組于免疫后第14、28、42 天每只采血1.0 mL，室溫靜止1 h 后，離心分離血清；免疫后第56 天每只最大量采血（心臟或頸動(dòng)脈），室溫靜止1 h 后，離心分離血清。免疫5 組免疫后第56 天每只最大量采血（心臟或頸動(dòng)脈），室溫靜止1 h后，離心分離血清。

1.5 血清中和抗體效價(jià)檢測(cè) 將免疫1~5組免疫后（分別第28、56、56、56、56天）血清進(jìn)行2倍系列稀釋（1∶16~1∶1 024），與水痘病毒等量混合，（37±1）℃培養(yǎng)進(jìn)行中和反應(yīng)；中和結(jié)束后接種至長(zhǎng)滿單層MRC-5 株人二倍體細(xì)胞的6 孔板中，100 μL／孔，（37 ± 1）℃孵育7 d；PBS 緩沖液洗滌，每次3 mL，共1~3次，加入考馬斯亮藍(lán)R250染色液，1 mL／孔，室溫5 ~ 10 min；吸棄染色液，流水沖凈，晾干，計(jì)數(shù)蝕斑數(shù)（PFU）。

1.6 血清中和病毒能力檢測(cè) 將VZV 減毒活疫苗原液稀釋至40 000、80 000、160 000、240 000 PFU／mL，分別與免疫血清等量混合孵育，進(jìn)行中和反應(yīng)；中和結(jié)束后接種至長(zhǎng)滿單層MRC-5 株人二倍體細(xì)胞的6 孔板中，100 μL／孔，同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照組（病毒稀釋至800 ~ 1 000 PFU／mL，取0.1 mL 加入稀釋液0.1 mL）、細(xì)胞對(duì)照組（稀釋液0.2 mL）和血清對(duì)照組（免疫血清0.1 mL + 稀釋液0.1 mL），（37 ± 1）℃孵育7 d；PBS 緩沖液洗滌，每次3 mL，共1~3 次，加入考馬斯亮藍(lán)R250染色液，1 mL／孔，室溫5~10 min；吸棄染色液，流水沖凈，晾干，計(jì)數(shù)蝕斑數(shù)（PFU）。試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.7 外源病毒因子檢查 將VZV 特異性免疫血清56 ℃滅活30 min，與稀釋液1∶1 混勻。將VZV（Oka株）工作種子批毒種稀釋至88 889 PFU／mL 作為供試品，與稀釋后VZV 特異性免疫血清按1∶1 進(jìn)行中和，置（37 ± 1）℃水浴60 min；取中和后供試品接種Vero、MRC-5和WI-38細(xì)胞，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照（不加病毒）及陽(yáng)性對(duì)照（接種牛副流感病毒），（36±1）℃吸附1 h；換液繼續(xù)培養(yǎng)14 d，觀察細(xì)胞病變。

1.8 鑒別試驗(yàn) 將VZV（Oka 株）工作種子批毒種稀釋至1 000 PFU／mL。稀釋后病毒液與稀釋液1∶1混合作為病毒對(duì)照組，稀釋后病毒液與免疫血清1∶1 混合作為實(shí)驗(yàn)組，免疫血清與稀釋液1∶1 混合作為血清對(duì)照組，單獨(dú)稀釋液作為細(xì)胞對(duì)照組。各組接種2 孔MRC-5 株人二倍體細(xì)胞，0.1 mL／孔，置（37 ± 1）℃，5% CO2培養(yǎng)箱吸附60 min，每隔20 min輕輕搖板1 次；補(bǔ)加維持液后繼續(xù)培養(yǎng)7 d；棄培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗滌，加入考馬斯亮藍(lán)溶液，室溫5 min；流水沖洗，晾干。計(jì)數(shù)每孔10 ~ 50 個(gè)以內(nèi)的蝕斑數(shù)，得出該稀釋度平均蝕斑數(shù)，并按下式計(jì)算病毒滴度。試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.9 數(shù)據(jù)采集及分析 使用Graphpad 8.0.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及分析。

2 結(jié)果

2.1 血清中和抗體效價(jià)免疫2組血清中和抗體效價(jià)最高，為1∶512，顯著高于對(duì)照組。見(jiàn)圖1。

2.2 血清中和病毒能力 細(xì)胞對(duì)照組無(wú)蝕斑，病毒對(duì)照組有蝕斑(43 PFU／孔)，證明試驗(yàn)成立。免疫2 組血清對(duì)病毒中和能力最強(qiáng)，可達(dá)240 000 PFU／mL，且高于免疫5組。見(jiàn)圖2。

圖2 各組中和抗體中和病毒能力Fig.2 Virus neutralizing ability of neutralizing antibody in various groups

2.3 外源病毒因子 3 種細(xì)胞的培養(yǎng)物均未見(jiàn)細(xì)胞病變，且陰性和陽(yáng)性對(duì)照也均未見(jiàn)細(xì)胞病變，試驗(yàn)成立，表明稀釋后的特異性免疫血清可完全中和稀釋后VZV。

2.4 鑒別試驗(yàn) 制備的VZV 特異性免疫血清可完全中和稀釋后VZV，血清及細(xì)胞對(duì)照均為陰性。見(jiàn)表1。

表1 鑒別試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Identification test results

3 討論

本研究結(jié)果表明，采用重組gE糖蛋白與不同佐劑組合免疫家兔后制備的免疫血清均具有中和活性，其中重組gE糖蛋白與弗氏佐劑組合制備的血清中和效價(jià)最高，為1∶512，中和病毒能力可達(dá)240 000 PFU／mL。因此，重組gE 糖蛋白與弗氏佐劑的組合方式為最優(yōu)組合方式。

目前在水痘減毒活疫苗及帶狀皰疹減毒活疫苗質(zhì)量控制中，進(jìn)行鑒別試驗(yàn)以及外源病毒因子檢查時(shí)均需要中和樣品中VZV，但目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)VZV 中和抗體標(biāo)準(zhǔn)品。國(guó)內(nèi)各廠家進(jìn)行鑒別試驗(yàn)或外源病毒因子檢查時(shí)，通常采用自制免疫血清，免疫原為VZV。由于免疫原為病毒，而病毒需通過(guò)細(xì)胞制備，有外源病毒因子污染的可能，且純度也不高，在外源病毒因子檢查中可能出現(xiàn)假陰性，而采用高純度蛋白進(jìn)行免疫可避免以上問(wèn)題。

綜上所述，本研究采用高純度gE 糖蛋白制備了高中和性免疫血清，該血清適用于水痘減毒活疫苗和帶狀皰疹減毒活疫苗日常生產(chǎn)中的質(zhì)量控制，為質(zhì)量控制提供了保障。