王一平，趙宗閣，吳星，2，梁爭論，2，毛群穎，2

1.中國食品藥品檢定研究院，北京 102629；2.國家衛(wèi)生健康委員會生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標準化重點實驗室，北京 102629

疫苗企業(yè)標準物質(zhì)涉及疫苗研發(fā)、生產(chǎn)和評價，是保證疫苗產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵，其類別包括生物標準物質(zhì)（標準品、參考品）、對照品和滴定標準液等。本文所述的企業(yè)標準物質(zhì)是指疫苗企業(yè)用于生物效價／活性、含量測定或其特性檢查的工作標準物質(zhì)，依據(jù)《中國藥典》三部（2020版）規(guī)定，如有國家標準品，則必須經(jīng)國家標準物質(zhì)標定后方可使用［1］。其中，標準品含量以質(zhì)量單位（g、mg、μg）表示，生物學活性或效價以國際單位（IU）、特定活性單位（AU）及活性單位（U）表示，參考品以特定活性單位（AU）及活性單位（U）表示，而對照品和滴定標準液用于理化項目檢測，前者為用于生物制品理化等方面測定的特定物質(zhì)，多按干燥品（或無水物）進行計算后使用。

在疫苗標準物質(zhì)相關(guān)法規(guī)和指南等文件中，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）指導原則和《中國藥典》主要關(guān)注WHO 國際標準物質(zhì)和國家標準物質(zhì)的研制和應用［2-6］；國家藥品監(jiān)督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）頒布的預防用疫苗臨床前研究技術(shù)指導原則、人用藥品技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)理事會（International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）發(fā)布的Q6B 指導原則均為對新藥研發(fā)企業(yè)標準物質(zhì)的概括性技術(shù)要求；NMPA 藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（Good Manufacturing Practice，GMP）、WHO GMP、歐盟（European Union，EU）GMP和美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）GMP 等均為對標準物質(zhì)在疫苗生產(chǎn)階段的管理要求。國內(nèi)和國外GMP關(guān)于標準物質(zhì)的使用要求均未對疫苗等生物制品標準物質(zhì)進行特別細化規(guī)定，但近年來WHO 制訂的標準物質(zhì)研制手冊對三級（企業(yè)）標準物質(zhì)提出了包括原材料、標定設(shè)計、統(tǒng)計學和穩(wěn)定性等明確技術(shù)要求［4，7］，2023年我國還提出了生物制品國家標準物質(zhì)應基于風險評估進行生命周期管理的理念［8］，這些文件均對我國企業(yè)疫苗標準物質(zhì)管理具有較強的指導意義。

COVID-19 疫情加速了我國疫苗行業(yè)的發(fā)展，涌現(xiàn)多個應用mRNA、新佐劑重組蛋白及腺病毒、流感病毒載體等新型技術(shù)平臺和新興疫苗企業(yè)，這對企業(yè)及國家疫苗標準物質(zhì)的研制和應用提出了挑戰(zhàn)，如針對以理化和儀器檢定為主，結(jié)合生物活性和效價檢測的mRNA 疫苗，如何建立基于風險控制全生命周期管理的企業(yè)疫苗標準物質(zhì)，有效質(zhì)控疫苗的純度、雜質(zhì)、活性以及評價疫苗免疫原性等問題［9-11］。本文在調(diào)研部分疫苗企業(yè)生物標準物質(zhì)的基礎(chǔ)上，結(jié)合WHO、ICH指導原則和生命周期等新理念，提出企業(yè)疫苗標準物質(zhì)應關(guān)注的要點，建議制定我國預防性人用疫苗企業(yè)標準物質(zhì)指導原則，為整體提升我國企業(yè)疫苗標準物質(zhì)水平提供思路。

1 企業(yè)疫苗標準物質(zhì)

目前WHO 公布的生物標準物質(zhì)中疫苗類標準物質(zhì)共111 個［12］，我國批準使用的疫苗類國家標準物質(zhì)共114 個［13］，《中國藥典》三部（2020 版）收錄的疫苗類標準物質(zhì)為42個［14］。在存在WHO及國家標準物質(zhì)情況下，疫苗企業(yè)應使用國家標準物質(zhì)或使用國際標準物質(zhì)標化企業(yè)標準物質(zhì)；在WHO 及國家標準物質(zhì)不可及時，企業(yè)應依據(jù)《中國藥典》三部（2020版）要求，自行建立工作標準物質(zhì)以控制和評價疫苗質(zhì)量，并按國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心（Center for Drug Evaluation，CDE）要求，在新藥申請（New Drug Application，NDA）時提供國家標準物質(zhì)候選原料。

企業(yè)疫苗標準物質(zhì)又可分為外購標準物質(zhì)及自建標準物質(zhì)兩類。外購標準物質(zhì)中，一類為活性／效價以及生物殘留檢測的標準物質(zhì)，購自中國食品藥品檢定研究院（National Institutes for Food and Drug Control，NIFDC），該類標準物質(zhì)的質(zhì)量監(jiān)測由NIFDC負責，企業(yè)需按說明書保存和使用；另一類為外購的商業(yè)化試劑盒中自帶的標準物質(zhì)，如牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）殘留量檢驗試劑盒中自帶BSA 標準品，宿主Vero 蛋白殘留量檢測試劑盒自帶Vero 蛋白殘留量標準品，該類標準物質(zhì)質(zhì)量監(jiān)測由商業(yè)化公司負責。疫苗企業(yè)自建標準物質(zhì)也可分為兩類，一類溯源至國家標準物質(zhì)，另一類為企業(yè)自行賦值或定值，后者多用于企業(yè)特有產(chǎn)品的質(zhì)量控制，如企業(yè)產(chǎn)品活性或效價以及特有成分、純度或雜質(zhì)檢測等。依據(jù)《中國藥典》三部（2020版）人用疫苗總論，疫苗企業(yè)自建標準物質(zhì)的制備、標定和保存應符合“生物制品國家標準物質(zhì)的制備和標定”的相關(guān)要求［6］。

2 企業(yè)疫苗標準物質(zhì)應遵守的相關(guān)法規(guī)和指導原則

疫苗標準物質(zhì)相關(guān)法規(guī)和指導原則包括WHO技術(shù)文件、現(xiàn)行版《中國藥典》三部、四部，NMPA 及其直屬單位的相關(guān)指導原則，以及ICHQ6B 及GMP等文件。

2.1 WHO 規(guī)程對企業(yè)標準物質(zhì)（三級標準物質(zhì)）的相關(guān)要求 WHO在2017和2022年分別發(fā)布了“核酸和抗原類診斷試劑標準物質(zhì)研制手冊”和“抗體二級標準物質(zhì)研制手冊”，均列表進行了一級（國際）、二級（國家）和三級（工作及其他）標準物質(zhì)各自的特性比較［4-5，7］，提出候選原材料應與待測分析物性質(zhì)盡可能一致，可使用與待測樣品相似的原材料制備；劑型可為液體、凍干或干燥樣品；標定為由有限數(shù)量實驗室使用單個檢測方法或有限數(shù)量的不同方法／平臺進行的小型研究，通過協(xié)作標定研究與國家標準品進行溯源，要求標定結(jié)果包括不確定度（measurement uncertainty，MU）等要求。

2.2 《中國藥典》標準物質(zhì)通則及疫苗總論《中國藥典》三部（2020版）通則“生物制品國家標準物質(zhì)的制備和標定”，對生物制品國家標準物質(zhì)提出了明確的技術(shù)要求，包括原材料、制備、檢測、標定以及穩(wěn)定性、保存分發(fā)和換批等?！吨袊幍洹啡浚?020 版）人用疫苗總論對企業(yè)疫苗標準物質(zhì)指出，標準物質(zhì)的制備、標定和保存應符合“生物制品國家標準物質(zhì)的制備和標定”的相關(guān)要求。

2.3 對上市階段疫苗標準物質(zhì)的管理要求

2.3.1 我國GMP 文件 GMP（2010 年修訂）規(guī)定，藥品企業(yè)應當建立工作標準品或?qū)φ掌返馁|(zhì)量標準以及制備、鑒別、檢驗、批準和貯存的操作規(guī)程，每批工作標準品或?qū)φ掌窇梅ǘ藴势坊驅(qū)φ掌愤M行標化，并確定有效期，應通過定期標化證明工作標準品或?qū)φ掌返男r或含量在有效期內(nèi)保持穩(wěn)定，未提出對疫苗類等生物制品標準物質(zhì)的特殊細化要求［15］。2020 年增加的生物制品附件中，未對生物制品標準物質(zhì)進行修訂［16］。2023 年發(fā)布的GMP 指南未明確對工作標準品的細化管理要求［17］。

2.3.2 國外GMP 文件 WHO GMP 技術(shù)指南附錄2（Technical Report Series 986）和EU GMP指南第4卷中，關(guān)于標準物質(zhì)的管理要求基本一致，規(guī)定當存在官方標準物質(zhì)時優(yōu)先考慮使用官方標準物質(zhì)，且依據(jù)其目的進行使用。當需要制備三級標準物質(zhì)時，需要采用合適的方法對三級（工作及其他）標準物進行充分驗證并保證可追溯性，同時進行定期監(jiān)測。標準物質(zhì)儲存時應對標準物質(zhì)的重要信息進行標注，以確保標準物質(zhì)有效［18-19］。美國FDA 要求保存關(guān)于標準物質(zhì)的制備及驗證完整記錄［20］。與我國GMP要求類似，國外GMP 關(guān)于標準物質(zhì)的使用要求也未針對疫苗等生物制品標準物質(zhì)制定細化要求。

2.4 對研發(fā)階段疫苗標準物質(zhì)的技術(shù)要求

2.4.1 我國預防用疫苗臨床前研究技術(shù)指導原則要求企業(yè)應在疫苗研發(fā)階段考慮研究、建立穩(wěn)定工藝后的疫苗抗原參考品，以及疫苗效力、免疫原性檢測用標準品或參考品［21］。疫苗抗原參考品與其后生產(chǎn)多批次疫苗的質(zhì)量控制指標的比對，可了解在上市后生產(chǎn)的疫苗抗原較研發(fā)階段的抗原在質(zhì)量上有無改變。疫苗效力、免疫原性檢測的標準品或參考品可用于疫苗效力指標的質(zhì)量控制。

2.4.2 CDE相關(guān)指導原則

2.4.2.1 SARS-CoV-2 預防用疫苗研發(fā)技術(shù)指導原則（試行） 要求應提供建立的參考品或?qū)φ掌穪碓?、制備、檢定結(jié)果、標定過程及穩(wěn)定性研究（定期復檢）等方面的初步研究資料［22］。

2.4.2.2 SARS-CoV-2 預防用疫苗非臨床有效性研究與評價技術(shù)要點 應提供建立的參考品或?qū)φ掌罚òㄓ糜诤怂岷俊⒓兌群蜕锘钚?，包括全序列測定）來源、制備、檢定結(jié)果、標定過程及穩(wěn)定性研究（定期復檢）等方面的初步研究資料［23］。

2.4.2.3 多肽疫苗生產(chǎn)及質(zhì)控技術(shù)指導原則 提出選取合適的1 批中間產(chǎn)品及終產(chǎn)品（最好是選擇經(jīng)過臨床評價的制品），就其化學成分、純度及生物學活性進行全面檢定，而后保存下來作為化學或生物參考品，可依此制定每批產(chǎn)品的標準要求［24］。

2.4.3 ICH Q6B 提出企業(yè)標準物質(zhì)應分級管理，主要參考物質(zhì)為企業(yè)用代表批次制備的經(jīng)質(zhì)量特性分析的物質(zhì)，用于各批產(chǎn)品的生物學檢測和物理化學試驗，并用于內(nèi)部工作參考物質(zhì)的標定，創(chuàng)新藥注冊申請的生產(chǎn)商應建立由采用生產(chǎn)和臨床研究用樣品的代表性批次制備的主要參考品。對產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)、產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)和工藝相關(guān)雜質(zhì)也應考慮分別建立參考品［25］。

3 企業(yè)疫苗標準物質(zhì)研制、使用和管理

3.1 企業(yè)疫苗標準物質(zhì)研制和管理方面存在的問題

本次調(diào)研的疫苗企業(yè)包括mRNA 疫苗、重組蛋白疫苗、滅活疫苗和減毒活疫苗等生產(chǎn)單位。企業(yè)均依據(jù)GMP 要求建立了企業(yè)疫苗標準物質(zhì)管理規(guī)程，對外購和自建標準物質(zhì)進行管理。

3.1.1 應加強對標準物質(zhì)相關(guān)法規(guī)指南的學習和理解 本次調(diào)研發(fā)現(xiàn)企業(yè)制定標準物質(zhì)管理規(guī)程主要依據(jù)《中國藥典》三部（2020 版）、四部（2020 版）和我國GMP 2010 修訂版，其中對《中國藥典》三部（2020版）人用疫苗總論中規(guī)定的標準物質(zhì)制備、標定和保存應符合“生物制品國家標準物質(zhì)的制備和標定”的相關(guān)要求，企業(yè)應做到將藥典標準物質(zhì)要求的精神與企業(yè)標準物質(zhì)實際結(jié)合，學習理解近年WHO 提出的生物制品標準物質(zhì)的新理念，并提升對標準物質(zhì)標定概念的理解。在標準物質(zhì)標定方面，目前較多的企業(yè)表現(xiàn)為將標定與檢定混為一談，認為標定是多人多次檢測，結(jié)果應符合規(guī)程規(guī)定，不符合規(guī)定的按偏差處理。

3.1.2 我國GMP 相關(guān)文件對疫苗標準物質(zhì)的適用性 國外GMP 相關(guān)標準物質(zhì)的規(guī)定均對標準物質(zhì)的概括性管理提出要求，強調(diào)當需要制備企業(yè)標準物質(zhì)時，需要采用合適的方法對標準物質(zhì)進行充分驗證保證可追溯性，并進行定期質(zhì)量監(jiān)測。

我國GMP 2010 修訂版中標準物質(zhì)的相關(guān)規(guī)定，要求通過定期標化來證明標準物質(zhì)的效價或含量在效期內(nèi)保持穩(wěn)定。這一條款對于生物制品特別是疫苗標準物質(zhì)的適用性值得商榷。在2023 年發(fā)布的藥品GMP指南文件中，未再提及對標準品的要求。因此疫苗企業(yè)應思考如何合規(guī)并科學建立和使用標準物質(zhì)。

3.2 提升疫苗企業(yè)標準物質(zhì)管理水平的思考

3.2.1 原料選用 對于研發(fā)中的制品（WHO 國際標準物質(zhì)和國家標準物質(zhì)不可及時），疫苗企業(yè)應自行建立2 個不同級別的標準物質(zhì)，特別是抗原標準物質(zhì)。ICH 提出在申報時企業(yè)標準物質(zhì)應建議采用生產(chǎn)和臨床研究用樣品的代表性批次，制備經(jīng)過質(zhì)量特性分析的高級別工作標準物質(zhì)和用于產(chǎn)品批檢驗的低級別工作標準物質(zhì)，后者應使用高級別標準物質(zhì)標定?？墒紫瓤紤]應用毒理批建立初步的質(zhì)控品，其后應用臨床經(jīng)過有效性和安全性研制的批次建立標準物質(zhì)，用于后續(xù)批次疫苗的質(zhì)控。

3.2.2 劑型 企業(yè)標準物質(zhì)一般不采用凍干劑型，但非凍干的疫苗標準物質(zhì)可能換代或換批頻繁，不利于保證量值持續(xù)準確的傳遞，因此較為適宜的方法為在工藝優(yōu)化完成后，選擇工藝穩(wěn)定，具有典型代表性批次制備標準物質(zhì)，作為企業(yè)高級別標準物質(zhì)低溫長期保存（通常-70 ℃以下），作為后續(xù)標準物質(zhì)換代或換批時的基線。

3.2.3 分裝精度和均勻性 WHO國際標準物質(zhì)的分裝精度要求小于±1.0%，生物制品國家標準物質(zhì)分裝精度同樣要求小于±1.0%。分裝精度對凍干的標準物質(zhì)尤為重要，同時也對分裝設(shè)備要求較高，多數(shù)企業(yè)高分裝精度設(shè)備不可及，在實際中企業(yè)標準物質(zhì)按產(chǎn)品分裝的精度也可接受。均勻性是標準物質(zhì)的基本屬性，雖然對于液體標準物質(zhì)均勻性一般較理想，但對于含鋁佐劑等混懸制品的標準物質(zhì)，建議采用精密度高的方法進行均勻性檢測，以滿足標準物質(zhì)研制要求。

3.2.4 標定 企業(yè)疫苗標準物質(zhì)的標定目的是為給標準物質(zhì)準確賦值，依據(jù)標準物質(zhì)研制原則，企業(yè)疫苗標準物質(zhì)應溯源至國家標準物質(zhì)或WHO 國際標準物質(zhì)。需由有資質(zhì)的人員通過不同次數(shù)或不同人員與國家或WHO 國際標準物質(zhì)同時進行標定試驗，由統(tǒng)計學專家通過有效的統(tǒng)計模型獲得標定結(jié)果及MU，生物制品類標準品可采用95%可信限作為MU。

對標定次數(shù)，《中國藥典》規(guī)定生物制品國家標準物質(zhì)的協(xié)作標定至少3 家實驗室，每家提供具有5次以上獨立有效結(jié)果，WHO 則指出要保證足夠的獨立實驗次數(shù)。對于企業(yè)標準物質(zhì)可采用單一實驗室或少數(shù)實驗室進行足夠次數(shù)檢測，以保證標定符合統(tǒng)計學要求。目前企業(yè)在標定實驗次數(shù)規(guī)定上相差較大，建議企業(yè)在標定時應依據(jù)標準物質(zhì)的特性以及檢測方法的變異度確定人員和檢測次數(shù)，應用適合的統(tǒng)計學模型對每次檢測結(jié)果采用線性或非線性平行性分析進行計算，并證明統(tǒng)計模型的有效性，全部結(jié)果再通過統(tǒng)計分析，以獲得標定物質(zhì)的最終標定均值和MU。

3.2.5 穩(wěn)定性研究和監(jiān)測 穩(wěn)定性為標準物質(zhì)的另一關(guān)鍵質(zhì)量屬性。疫苗標準物質(zhì)的穩(wěn)定性可基于疫苗產(chǎn)品的穩(wěn)定性進行評估，在有國家或國際標準物質(zhì)時，以國家或國際標準物質(zhì)為依據(jù)，當沒有國家或國際標準物質(zhì)時，企業(yè)應以內(nèi)部高級別工作標準物質(zhì)為依據(jù)進行穩(wěn)定性研究，包括加速穩(wěn)定性考核和實時長期穩(wěn)定性監(jiān)測。

需關(guān)注的是，采用單抗等免疫學方法檢測疫苗標準物質(zhì)的穩(wěn)定性，可能出現(xiàn)加速后穩(wěn)定性升高的現(xiàn)象，分析可能為抗原結(jié)構(gòu)改變，充分暴露出單抗的結(jié)合位點。因此研制特異、準確及敏感的穩(wěn)定性檢測方法是疫苗及疫苗標準物質(zhì)穩(wěn)定性研究的前提。

3.2.6 效期 WHO國際標準物質(zhì)和生物制品國家標準物質(zhì)不設(shè)效期，企業(yè)可依據(jù)生物制品特性和穩(wěn)定性考核數(shù)據(jù)預設(shè)效期，但應在預計效期內(nèi)持續(xù)進行穩(wěn)定性監(jiān)測，設(shè)立穩(wěn)定性下降預設(shè)標準。

3.2.7 表征 WHO指南建議對疫苗標準物質(zhì)進行表征研究［2］。如對新研制的SARS-CoV-2 mRNA 疫苗，WHO 要求在申請上市許可時提供標準物質(zhì)信息，選擇充分表征結(jié)構(gòu)、純度和生物活性，經(jīng)過臨床試驗評估的批次作為候選標準物質(zhì)原料?！吨袊幍洹啡浚?020版）人用疫苗總論未對疫苗標準物質(zhì)提出表征要求，而人用重組單克隆抗體制品總論提出選擇適當或代表性批次用于各種分析，并應進行全面分析鑒定標準物質(zhì)。近期CDE頒布的溶瘤病毒產(chǎn)品藥學研究與評價技術(shù)指導原則提出［26］，標準品／對照品應開展全面的質(zhì)量研究、標定和穩(wěn)定性研究。建議對用于疫苗效價或抗原檢測的標準物質(zhì)進行全面表征，了解標準物質(zhì)的降解模式，在此基礎(chǔ)上研究穩(wěn)定性敏感的檢測方法，用于標準物質(zhì)穩(wěn)定性監(jiān)測，以及建立模型預測標準物質(zhì)的有效期。

3.2.8 標準物質(zhì)的生命周期 企業(yè)應結(jié)合基于風險評估的全生命周期標準物質(zhì)管理理念［8］，對標準物質(zhì)原材料、制備、標定、保存、使用、換代換批及停用的各個環(huán)節(jié)進行風險評估，分析標準物質(zhì)生命周期不同階段存在的風險點，提出相應的風險控制措施，以保證標準物質(zhì)的準確性。重點關(guān)注均一性、穩(wěn)定性、協(xié)作標定以及賦值準確性，保證企業(yè)標準物質(zhì)的量值準確傳遞，建議開發(fā)穩(wěn)定性敏感的檢測方法用于穩(wěn)定性評估和監(jiān)測，為疫苗質(zhì)控和評價提供可靠的標尺。

4 小結(jié)

企業(yè)疫苗標準物質(zhì)對保證疫苗制品的質(zhì)量發(fā)揮重要作用。近年，我國多個mRNA、新佐劑重組蛋白及腺病毒、流感病毒載體等新型疫苗品種的出現(xiàn)，對疫苗標準物質(zhì)的研制和應用提出了挑戰(zhàn)。為適應生物制品發(fā)展需要，WHO 對企業(yè)（三級）標準物質(zhì)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性提出了新的技術(shù)要求。本文在對疫苗企業(yè)調(diào)研基礎(chǔ)上，歸納總結(jié)了疫苗類標準物質(zhì)相關(guān)的法規(guī)和指南性文件，分析了企業(yè)疫苗標準物質(zhì)存在的問題，建議企業(yè)應理解并正確應用生物制品標準物質(zhì)相關(guān)法規(guī)和指南文件，并制定企業(yè)疫苗標準物質(zhì)制備和應用的指導原則。