張弛，張建玲，薛梅，律苗，李瀧，李勤勤

北京生物制品研究所有限責(zé)任公司質(zhì)量檢定室，北京 100176

CNC（controlled not classified）區(qū)域即受控但未分級(jí)區(qū)域，該區(qū)域易于清潔，進(jìn)出受控制且空氣經(jīng)過過濾，如人員進(jìn)入一般生產(chǎn)區(qū)更衣需控制，該區(qū)域需處于受控狀態(tài)；再如廢棄物出口、氣鎖間、工藝支持區(qū)等［1］。FDA 相關(guān)法規(guī)指出，環(huán)境趨勢(shì)數(shù)據(jù)揭示微生物從非控制區(qū)或較低級(jí)別區(qū)域到無菌操作間的遷移。建立充分程序，區(qū)分較低級(jí)別環(huán)境中的微生物，通常有助于檢出這種趨勢(shì)。應(yīng)定期對(duì)這些輔助環(huán)境中的微生物進(jìn)行物種鑒定［2］。隨著國(guó)內(nèi)外法規(guī)對(duì)于制藥企業(yè)無菌保障水平要求的提升［3］，對(duì)CNC 區(qū)域進(jìn)行微生物監(jiān)測(cè)逐漸成為國(guó)際檢查的關(guān)注點(diǎn)。

制藥企業(yè)潔凈區(qū)微生物分布及數(shù)據(jù)庫的建立一直是關(guān)注的熱點(diǎn)［4-8］，并探索使用新方法進(jìn)行微生物鑒定［9-12］。但目前針對(duì)制藥企業(yè)CNC 區(qū)域微生物分布的研究國(guó)內(nèi)外均鮮有報(bào)道。在此背景下，本研究在國(guó)內(nèi)首次對(duì)制藥企業(yè)CNC區(qū)域的環(huán)境及人員進(jìn)行微生物分布分析，建立CNC 區(qū)域的微生物分布數(shù)據(jù)庫，并嘗試與潔凈區(qū)微生物分布進(jìn)行比較，確定易進(jìn)入潔凈區(qū)的微生物菌群，評(píng)估清潔或消毒規(guī)程以及微生物檢測(cè)方法的有效性，以期通過對(duì)CNC 區(qū)域微生物分布的研究實(shí)現(xiàn)對(duì)潔凈區(qū)尤其是核心無菌操作區(qū)域的良好微生物控制，提升制藥企業(yè)的無菌保障水平。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（tryptosesoya agar，TSA）和TSA 接觸碟（含中和劑）購自浙江天杭生物科技有限公司；FSC-Ⅳ型浮游菌取樣器購自PMS 美國(guó)粒子監(jiān)測(cè)系統(tǒng)公司；Bio-Ⅱ-Advance生物安全柜購自西班牙Telstar公司。

1.2 取樣點(diǎn)制定 以制藥企業(yè)生產(chǎn)車間CNC 區(qū)域作為研究對(duì)象，按照生產(chǎn)人員、物料進(jìn)入潔凈區(qū)的路線，逐個(gè)CNC 區(qū)域進(jìn)行浮游菌、沉降菌、人員和環(huán)境表面微生物取樣。對(duì)包括換鞋間、總更衣間、一更間、走廊、緩沖間在內(nèi)的10 個(gè)房間進(jìn)行取樣。浮游菌、沉降菌的取樣點(diǎn)選擇在CNC 區(qū)域的人員活動(dòng)密集處；環(huán)境表面微生物選擇對(duì)CNC 區(qū)域的門、墻、地面及物料表面等進(jìn)行取樣；人員表面微生物選擇對(duì)進(jìn)入生產(chǎn)車間的5 名人員進(jìn)行取樣，取樣點(diǎn)包括人員的帽兜、左手、右手、胸腹部、左腳底部及右腳底部。

1.3 取樣 人員、環(huán)境表面微生物取樣按照《中國(guó)藥典》四部（2020 版）9205 藥品潔凈實(shí)驗(yàn)室微生物監(jiān)測(cè)和控制指導(dǎo)原則進(jìn)行［13］。浮游菌的監(jiān)測(cè)按照《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）浮游菌的測(cè)試方法》的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行［14］。沉降菌的取樣按照《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測(cè)試方法》的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行［15］；2022年1月對(duì)1個(gè)生產(chǎn)車間CNC 區(qū)域共取樣2次，每次間隔1 周。采用FSC-Ⅳ型浮游菌取樣器進(jìn)行浮游菌取樣。

1.4 微生物培養(yǎng)與純化 取樣后的胰酪大豆蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板（TSA培養(yǎng)基）置于20 ~ 25 ℃培養(yǎng)3 d，再30~35 ℃培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、光澤、濕潤(rùn)度等判定平皿上的菌落類型并計(jì)數(shù)，每個(gè)平皿上單一類型菌落>50 CFU 的結(jié)果均按50 CFU 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。采用三區(qū)劃線法對(duì)菌落進(jìn)行純化。

1.5 微生物鑒別 采用16S rRNA測(cè)序法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒別。霉菌根據(jù)其特有的形態(tài)特征直接進(jìn)行判別。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，使用Microbiomeanalyst在線分析軟件［16］進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 生產(chǎn)車間CNC 區(qū)域微生物分離 2 次取樣分別分離到1 843、2 237 株微生物，浮游菌、沉降菌、環(huán)境和人員表面微生物分離菌株見表1。表明CNC 區(qū)域存在豐富的微生物，浮游菌的數(shù)量較其他3 項(xiàng)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)略低。

表1 2次CNC區(qū)域取樣分離菌株數(shù)Tab.1 Strains isolation results of twice sampling from CNC area

人員表面微生物分布情況見表2。2 次CNC 區(qū)域取樣均分離到豐富的微生物。人員不同取樣位置微生物數(shù)量存在差異，其中人員帽兜、胸腹處微生物數(shù)量相對(duì)少，手部、腳底部微生物數(shù)量多。

表2 2 次CNC 區(qū)域取樣人員表面微生物監(jiān)測(cè)結(jié)果（CFU／平皿）Tab.2 Personnel surface microbial monitoring results of twice sampling from CNC area（CFU／plate）

2.2 生產(chǎn)車間CNC區(qū)域微生物分布 2次CNC區(qū)域取樣共分離到47 個(gè)屬的微生物，革蘭陽性菌所占比例為84.4%，革蘭陰性菌所占比例為15.6%。其中不動(dòng)桿菌屬占總體比例為9.3%，其他革蘭陰性菌占總體比例僅為6.3%。葡萄球菌屬、微球菌屬、不動(dòng)桿菌屬、微桿菌屬、芽孢桿菌屬所占比例最大，占總體比例的79.9%。CNC區(qū)域微生物總體分布見圖1。

圖1 CNC區(qū)域微生物菌屬總體分布圖Fig.1 Overall distribution of microorganism genera in CNC area

通過對(duì)2 次CNC 區(qū)域浮游菌、沉降菌、環(huán)境和人員表面微生物分布進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)葡萄球菌屬在浮游菌、沉降菌、環(huán)境和人員表面廣泛分布，且所占比例最大，其中尤以人員表面最為突出，2 次取樣人員表面葡萄球菌占比分別為86.4%和84.3%；微球菌屬的分布比例僅次與于葡萄球菌屬，在浮游菌、沉降菌、環(huán)境和人員表面均有分布；不動(dòng)桿菌屬是在浮游菌、沉降菌、環(huán)境和人員表面分布最廣泛的革蘭陰性菌；微桿菌屬和考克菌屬主要在浮游菌、沉降菌、環(huán)境表面分布；芽孢桿菌屬在浮游菌、沉降菌、環(huán)境和人員表面均有分布，但人員表面分布比例較低。見圖2。

圖2 2次CNC區(qū)域取樣微生物菌屬分布比較Fig.2 Comparison of microbial distribution of twice sampling from CNC area

從微生物分類中種的水平對(duì)2 次CNC 區(qū)域取樣浮游菌、沉降菌、環(huán)境表面微生物分布、人員表面微生物分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，表明在浮游菌、沉降菌、環(huán)境表面微生物以表皮葡萄球菌、科氏葡萄球菌、沃納利葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌、魯氏不動(dòng)桿菌、瓊氏不動(dòng)桿菌等為主；人員表面微生物以沃納利葡萄球菌、科氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血葡萄球菌、腐生葡萄球菌、云南微球菌等為主。見表3和表4。

表3 2次CNC區(qū)域取樣浮游菌、沉降菌、環(huán)境表面微生物菌種分布統(tǒng)計(jì)Tab.3 Distribution statistics of airborne microorganisms，settling microorganisms and environmental surface microorganisms in twice sampling from CNC area

表4 2次CNC區(qū)域取樣人員表面微生物菌種分布統(tǒng)計(jì)Tab.4 Distribution statistics of personnel surface microorganisms in twice sampling from CNC area

對(duì)2 次CNC 區(qū)域取樣微生物分布的多樣性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以Alpha多樣性指數(shù)表征浮游菌、沉降菌、環(huán)境和人員表面微生物的種群豐富度，結(jié)果表明，浮游菌、沉降菌的微生物種群豐富度最高，環(huán)境表面微生物次之，人員表面微生物種群豐富度最低。見圖3。

圖3 CNC區(qū)域微生物分布多樣性Fig.3 Distribution diversity of microorganisms in CNC area

2.3 CNC 區(qū)域與同生產(chǎn)車間潔凈區(qū)的微生物分布比較 將2 次CNC 區(qū)域微生物分布與該生產(chǎn)車間1年內(nèi)B、C 級(jí)潔凈區(qū)的微生物分布進(jìn)行比較，結(jié)果表明，近1 年內(nèi)該車間B、C 級(jí)潔凈區(qū)共收集到25 個(gè)菌屬的微生物，絕大部分包含在CNC 區(qū)域微生物種群中，只有分枝桿菌屬和纖維單胞菌屬在CNC 區(qū)域中未發(fā)現(xiàn)（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。B、C 級(jí)潔凈區(qū)與CNC 區(qū)域類似，均以葡萄球菌屬、微球菌屬為主。B 級(jí)潔凈區(qū)由于采取更為嚴(yán)格的人員、物料進(jìn)出程序和更為頻繁的消毒措施，尚未發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌。不動(dòng)桿菌屬在B、C 級(jí)潔凈區(qū)的分布比例較CNC 區(qū)域有所下降。鞘氨醇單胞菌屬在B、C級(jí)潔凈區(qū)的分布比例較CNC區(qū)域有所提升。見表5。

表5 生產(chǎn)車間B、C級(jí)潔凈區(qū)與CNC區(qū)域微生物分布（%）Tab.5 Distribution of microorganisms in Class B and C clean areas and CNC area of sampled production workshop（%）

3 討論

通過對(duì)生產(chǎn)車間2 次CNC 區(qū)域微生物取樣及菌種鑒別，發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)車間CNC區(qū)域以革蘭陽性菌為主，革蘭陰性菌所占比例較少。疫苗生產(chǎn)CNC區(qū)域微生物種類非常豐富，在2 次取樣中共分類到47 個(gè)屬的微生物，按照屬進(jìn)行分類，2 次取樣結(jié)果重合率為63.8%。革蘭陽性菌以葡萄球菌、微球菌、微桿菌屬為主，革蘭陰性菌以不動(dòng)桿菌屬為主，與已報(bào)道的潔凈區(qū)微生物分布類似［4-8］。

葡萄球菌屬是CNC區(qū)域分布數(shù)量最多的一類微生物。微球菌屬和葡萄球菌屬同屬于微球菌科，其分布比例僅次于葡萄球菌屬。CNC 區(qū)域存在一定比例的芽孢桿菌，而芽孢的存在足以對(duì)潔凈區(qū)的微生物控制構(gòu)成威脅［17-18］。因此，人員、物料由CNC 區(qū)域進(jìn)入潔凈區(qū)前采取嚴(yán)格的進(jìn)入流程和針對(duì)葡萄球菌屬、微球菌屬、芽孢桿菌屬的有效消毒程序有利于潔凈區(qū)的微生物控制。

另一類值得引起關(guān)注的微生物為不動(dòng)桿菌屬，該屬是CNC區(qū)域分布數(shù)量最多的革蘭陰性菌。通過對(duì)2 次監(jiān)測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)，不動(dòng)桿菌屬出現(xiàn)的頻次較低，但總菌落數(shù)高，具有菌落聚集出現(xiàn)的特點(diǎn)。根據(jù)此結(jié)果結(jié)合不動(dòng)桿菌的生長(zhǎng)特性，分析原因?yàn)椴粍?dòng)桿菌黏附力極強(qiáng)，易在各類材料上黏附，而可能成為貯菌源，從而造成長(zhǎng)菌區(qū)域形成多個(gè)菌落。不動(dòng)桿菌屬在CNC區(qū)域的分布特點(diǎn)可解釋B、C級(jí)潔凈區(qū)不動(dòng)桿菌屬所占比例明顯下降。

將CNC區(qū)域微生物分布與同生產(chǎn)車間B、C級(jí)潔凈區(qū)微生物分布進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)近1 年內(nèi)潔凈區(qū)分離到的微生物與CNC 區(qū)域具有極高的重合率，潔凈區(qū)中只有分枝桿菌屬和纖維單胞菌屬在CNC區(qū)域中未發(fā)現(xiàn)，分析原因?yàn)? 次CNC 區(qū)域微生物取樣并未捕獲CNC 區(qū)域的全部微生物。相較于CNC 區(qū)域，潔凈區(qū)的微生物菌屬減少了22 個(gè)，表明各級(jí)別潔凈區(qū)空調(diào)系統(tǒng)運(yùn)行、定期的清潔消毒措施、不同潔凈級(jí)別人員的更衣流程、物品進(jìn)入車間的退包／消毒措施有效阻止了一部分微生物進(jìn)入潔凈區(qū)。高重合率也說明潔凈區(qū)監(jiān)測(cè)到的微生物來源于CNC 區(qū)域，因此，生產(chǎn)車間實(shí)現(xiàn)對(duì)CNC區(qū)域微生物的良好控制可提高潔凈區(qū)域的微生物控制水平。

人員是潔凈區(qū)最大的污染源［19］。在CNC區(qū)域人員身著白色潔凈服、穿一次性襪子，手部裸露的情況下對(duì)10 名人員的表面微生物進(jìn)行監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)人員帽兜和胸腹部微生物數(shù)量相對(duì)較少，腳底和手部微生物數(shù)量較多。人員表面微生物種類相對(duì)較少，且葡萄球球菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。該結(jié)果表明，生產(chǎn)人員的個(gè)人清潔衛(wèi)生以及在更衣前對(duì)手部進(jìn)行充分的清潔消毒對(duì)于潔凈區(qū)微生物的控制非常重要［19］。另外，對(duì)于此次監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)的人員腳底微生物數(shù)量眾多應(yīng)引起關(guān)注，因?yàn)槟_底部的微生物存在透過潔凈服污染潔凈區(qū)的風(fēng)險(xiǎn)，可采取穿潔凈拖鞋或潔凈服腳底部選用避免微生物滲透的材質(zhì)等方式減少生產(chǎn)人員腳部微生物對(duì)潔凈區(qū)的污染。

通過對(duì)疫苗生產(chǎn)車間CNC區(qū)域進(jìn)行微生物監(jiān)測(cè)掌握了疫苗生產(chǎn)車間CNC 區(qū)域的微生物分布特征，并了解了需重點(diǎn)關(guān)注的主要微生物種群。CNC 區(qū)域微生物監(jiān)測(cè)同時(shí)也有利于對(duì)潔凈區(qū)環(huán)境監(jiān)測(cè)微生物超標(biāo)事件進(jìn)行追溯和調(diào)查。通過與B、C 級(jí)潔凈區(qū)的微生物分布進(jìn)行對(duì)比，證實(shí)了潔凈區(qū)內(nèi)環(huán)境菌來源于CNC 區(qū)域，確定了易進(jìn)入潔凈區(qū)的微生物種群。據(jù)此制定更具針對(duì)性的清潔消毒程序，優(yōu)化人員更衣流程等措施，有助于提升潔凈區(qū)的微生物控制及疫苗生產(chǎn)的無菌保障水平［20-21］。

此次CNC 區(qū)域微生物分布研究?jī)H針對(duì)1 個(gè)疫苗生產(chǎn)車間在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行取樣。CNC 區(qū)域微生物分布規(guī)律隨時(shí)間和季節(jié)的變化，以及不同生產(chǎn)車間CNC 區(qū)域微生物的分布是否存在差異尚有待研究。后續(xù)將按照不同季度對(duì)多個(gè)生產(chǎn)車間進(jìn)行CNC區(qū)域監(jiān)測(cè)，收集數(shù)據(jù)，為建立CNC區(qū)域微生物監(jiān)測(cè)合格標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。