華杭菊，陳武進(jìn)，倪卓娜，劉錦洪，安虹霖，黃 彬，4，林久茂，4*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院，福建 福州 350108；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；4.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122）

大腸癌（包括結(jié)腸癌和直腸癌）是我國(guó)臨床中常見的消化道惡性腫瘤之一，容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，60%～80%大腸癌患者確診時(shí)屬于晚期［1］。目前研究顯示：大腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），上游信號(hào)鋅指轉(zhuǎn)錄因子Slug 是導(dǎo)致EMT 的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其介導(dǎo)的Slug/Smad相關(guān)通路能夠促進(jìn)EMT的發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［2］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）在多種腫瘤中表達(dá)異常，對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移有重要調(diào)控功能［3-4］。研究發(fā)現(xiàn) lncRNA MALAT1 可上調(diào)Slug 的表達(dá)，提高EMT，從而促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［5］。白花蛇舌草（Hedyotis DiffusaWilld.，HDW）具有清熱解毒、消癰散結(jié)等功效，現(xiàn)代研究表明HDW可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和血管新生，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)多藥耐藥，且無明顯的毒副作用［6-7］。前期研究發(fā)現(xiàn)，HDW 可通過抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）誘導(dǎo)的結(jié)直腸上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，減少結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲［8］，但HDW 抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未完全闡明，對(duì)HDW 是否通過調(diào)控lncRNA MALAT1/Slug/Smad通路影響EMT 表達(dá)，進(jìn)而抑制大腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲，還需進(jìn)一步明確。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)lncRNA MALAT1的人結(jié)腸癌HCT-116穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，通過HDW 干預(yù)，以期進(jìn)一步明確lncRNA MALAT1/Slug/Smad 通路在大腸癌EMT 和轉(zhuǎn)移中的作用，以及HDW 發(fā)揮藥效的關(guān)鍵機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116 購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液均購自美國(guó)Life Technologies公司；Transwell 板、基質(zhì)膠均購自美國(guó)Corning 公

司；四甲基偶氮唑藍(lán)干粉（美國(guó)Sigma 公司）；TRIzol試劑盒［美國(guó)賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司］；NE-PER 核蛋白和胞漿蛋白抽提試劑盒（美國(guó)Thermo 公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；過表達(dá)慢病毒lncRNA MALAT1（上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司）；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Slug、Snail、TGF-β、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、Smad2/3、磷酸化Smad2/3（p-Smad2/3）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、GAPDH 抗體和二抗（HRP）均購自美國(guó)CST 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 CO2培養(yǎng)箱、-80 ℃超低溫冰箱均購自美國(guó)Thermo 公司；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；多功能酶標(biāo)儀（奧地利Tecan 公司）；倒置顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）；形態(tài)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)LASV 4.1、Countstar 全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀均購自美國(guó)Life 公司；電泳儀、電泳槽、ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)均購自美國(guó)Bio-Rad 公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 HDW 藥液制備 HDW 全草用85%乙醇回流提取3 次并過濾，合并提取液，濃縮至無醇味，提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)得到浸膏，真空干燥后得到干燥粉末，即HDW 提取物。稱取HDW 提取物粉末0.5 g，加入高壓滅菌超純水1 mL，配制成0.5 g/mL HDW 藥液，置于4 ℃冰箱中保存待用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將HCT-116 細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%FBS、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔1 d 更換RPMI-1640 培養(yǎng)液，每3 d 傳代1次。細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右時(shí)應(yīng)用0.25%胰酶消化并傳代。

2.3 細(xì)胞分組及病毒轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT-116 細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種于6 孔細(xì)胞板中，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)80%匯合度時(shí)，將細(xì)胞分為空白組、藥物組、病毒組和藥物聯(lián)合病毒組?？瞻捉M和藥物組加入不含lncRNA MALAT1的空載慢病毒液，病毒組和藥物聯(lián)合病毒組加入含lncRNA MALAT1 過表達(dá)的慢病毒液。感染4 d 后，當(dāng)感染效率達(dá)90%以上時(shí)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。加入1 mg/L 的嘌呤霉素篩選7 d，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。

2.4 藥物干預(yù) 空白組和病毒組用0 mg/mL HDW藥液干預(yù)，藥物組和藥物聯(lián)合病毒組用0.5 mg/mL HDW 藥液干預(yù)。

2.5 RT-qPCR 法檢測(cè)細(xì)胞lncRNA MALAT1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平 取各組細(xì)胞，按2.5×105個(gè)/mL 細(xì)胞密度接種于6 孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL。按“2.4”項(xiàng)下方法干預(yù)24 h，使用TRIzol 試劑提取總RNA。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。引物序列由中國(guó)寶生物工程（大連）有限公司提供，見表1，lncRNA MALAT1 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCt方法計(jì)算。

表1 引物序列

2.6 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力 按1×105個(gè)/mL 將細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，細(xì)胞貼壁后按“2.4”項(xiàng)下方法干預(yù)，每組均設(shè)8 個(gè)復(fù)孔。干預(yù)培養(yǎng)24 h 后，每孔加入10 μL 的0.5 mg/mL MTT 后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄液體后加入100 μL DMSO，室溫放置10 min，充分振蕩混勻后于酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度OD 值，計(jì)算細(xì)胞活力。

2.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞劃痕愈合能力 按照2.5×105個(gè)/mL 將細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL，細(xì)胞培養(yǎng)至匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)，進(jìn)行劃痕，PBS 溶液清洗2 次，按“2.4”項(xiàng)下方法干預(yù)，分別在干預(yù)0、6、24 h 后于顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕修復(fù)情況。

2.8 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲能力 按2.5×105個(gè)/mL細(xì)胞密度接種于6孔板中，每孔2 mL，細(xì)胞貼壁后按“2.4”項(xiàng)下方法干預(yù)24 h，吸棄各孔溶液后進(jìn)行消化。用空白培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105個(gè)/mL，將200 μL 細(xì)胞懸液滴加于不用基質(zhì)膠包被（遷移實(shí)驗(yàn)）或預(yù)先基質(zhì)膠包被（侵襲實(shí)驗(yàn)）的Transwell 上室，下室加入700 μL 完全培養(yǎng)基，放入恒溫箱培育12 h。將小室拿出用4%多聚甲醛固定20 min，用0.1%的結(jié)晶紫染色15 min，超純水漂洗3 次，用棉簽將上室未遷移細(xì)胞擦拭掉，倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)取5 個(gè)視野拍照，以遷移、侵襲至小室底部的細(xì)胞數(shù)作為細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力評(píng)價(jià)指標(biāo)。

2.9 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)量 藥物干預(yù)同前，干預(yù)后棄上清用PBS 清洗，應(yīng)用 NEPER 核蛋白和胞漿蛋白抽提試劑盒提取蛋白，用BCA 法做蛋白質(zhì)定量，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，一抗加入Slug、Snail、TGF-β、N-cadherin、Vimentin、p-Smad2/3、Smad2/3、E-cadherin（1∶1 000）和β-actin（1∶5 000）一抗，4 ℃下?lián)u床過夜，TBST 溶液清洗3 次，每次5 min。加入對(duì)應(yīng)種屬的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST 溶液清洗3 次，每次5 min。滴加電化學(xué)發(fā)光（ECL）發(fā)光液，在顯影板上用ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)成像，并用Image Lab 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料屬于正態(tài)分布的以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn)；方差不齊采用Dunnett's T3 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 4 組lncRNA MALAT1 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平比較 與空白組比較，藥物組lncRNA MALAT1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），病毒組lncRNA MALAT1 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與病毒組比較，藥物聯(lián)合病毒組lncRNA MALAT1mRNA 相對(duì)表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 4 組lncRNA MALAT1 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平比較

3.2 4 組細(xì)胞活力比較 與空白組比較，藥物組細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.05），病毒組細(xì)胞活力明顯升高（P＜0.05）；與病毒組比較，藥物聯(lián)合病毒組細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 4 組細(xì)胞活力比較

3.3 4 組細(xì)胞劃痕愈合能力比較 病毒轉(zhuǎn)染后lncRNA MALAT1 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平的提升促進(jìn)了的HCT-116 細(xì)胞的細(xì)胞劃痕愈合能力。HDW 可以顯著性抑制HCT-116 細(xì)胞的劃痕愈合能力，并且HDW 對(duì)過表達(dá)lncRNA MALAT1 的HCT-116 的劃痕愈合能力仍具有抑制作用。見圖3。

圖3 4 組劃痕實(shí)驗(yàn)細(xì)胞形態(tài)圖（×200）

3.4 4 組細(xì)胞遷移、侵襲能力比較 與空白組比較，病毒組HCT-116 細(xì)胞遷移和侵襲能力提高。HDW不僅對(duì)于正常HCT-116 細(xì)胞的遷移、侵襲能力有顯著性抑制作用，并且對(duì)過表達(dá)lncRNA MALAT1 的HCT-116 細(xì)胞遷移、侵襲能力仍具有抑制作用。見圖4。

圖4 4 組Transwell 遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)圖（×200）

3.5 4 組相關(guān)蛋白表達(dá)量比較 與空白組比較，藥物組Slug、Snail、TGF-β、N-cadherin、Vimentin 蛋白表達(dá)量和p-Smad/Smad 明顯降低（P＜0.05），E-cadherin 蛋白表達(dá)量明顯提高（P＜0.05）；病毒組Slug、Snail、TGF-β、N-cadherin、Vimentin 蛋白表達(dá)量和p-Smad/Smad 明顯提高（P＜0.05），E-cadherin 蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）；與病毒組比較，藥物聯(lián)合病毒組Slug、Snail、TGF-β、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)量和p-Smad/Smad 明顯降低（P＜0.05），E-cadherin 蛋白表達(dá)量明顯提高（P＜0.05）。見圖5、表2。

圖5 4 組相關(guān)蛋白條帶圖

表2 4 組相關(guān)蛋白表達(dá)量比較（±s）

表2 4 組相關(guān)蛋白表達(dá)量比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與病毒組比較，2） P＜0.05。

Vimentin 0.96±0.05 0.49±0.031）1.40±0.071）0.85±0.032）組別空白組藥物組病毒組藥物聯(lián)合病毒組Slug 0.98±0.06 0.72±0.031）1.32±0.081）0.83±0.062）Snail 0.94±0.04 0.73±0.091）1.48±0.041）1.11±0.042）TGF-β 0.95±0.04 0.65±0.081）1.43±0.091）0.97±0.052）p-Smad/Smad 0.99±0.06 0.34±0.041）1.03±0.081）0.86±0.052）E-cadherin 0.70±0.041）1.25±0.031）0.43±0.051）0.52±0.042）N-cadherin 0.97±0.03 0.65±0.081）1.40±0.011）0.97±0.062）

4 討 論

目前大腸癌早期主要以手術(shù)為主，晚期以放化療、免疫治療及營(yíng)養(yǎng)支持治療為主。中醫(yī)藥在大腸癌康復(fù)治療過程中起到重要作用，可增強(qiáng)大腸癌康復(fù)過程中放化療效果，減少免疫、靶向治療毒副作用，改善大腸癌晚期并發(fā)癥作用，特別是在預(yù)防大腸癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用［9］。大腸癌屬于中醫(yī)學(xué)“腸蕈”“積聚”“腸積”等范疇，其病機(jī)為濕熱與癌毒郁結(jié)大腸，濕熱傷腸絡(luò)，毒邪蘊(yùn)毒成癰，以濕熱瘀毒為主要證候特征，其主要治則是清熱利濕、解毒散結(jié)、化瘀消癰。HDW 為茜草科耳草屬植物，性寒、味微苦、微甘，歸胃經(jīng)、大腸經(jīng)、小腸經(jīng)，具有清熱解毒、消痛散結(jié)、利尿除濕等功效，符合大腸癌的辨證論治。

EMT 是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要步驟。EMT的主要分子特征為細(xì)胞黏附分子E-cadherin 表達(dá)的喪失和N-cadherin、Vimentin 表達(dá)升高。EMT 轉(zhuǎn)化過程受到Slug、Snail 等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，Slug 蛋白被認(rèn)為是EMT 轉(zhuǎn)化過程的重要調(diào)控因子［10］。lncRNA 在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用被逐漸重視，并被證實(shí)可以抑制包括大腸癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，lncRNA MALAT1 可上調(diào)Snail、TGF-β的表達(dá)［11］。進(jìn)一步與下游轉(zhuǎn)錄因子Smad 結(jié)合形成復(fù)合物轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，并與其他轉(zhuǎn)錄因子或者輔助蛋白一起調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，使E-cadherin 表達(dá)降低，N-cadherin、Vimentin 表達(dá)升高，提高EMT 能力，進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)［3-5］。因此，阻斷l(xiāng)ncRNA MALAT1/Slug/Smad 通路調(diào)控EMT 是有效的防治腫瘤轉(zhuǎn)移方式。

本研究構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)lncRNA MALAT1 的HCT-116 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，與空白組比較，藥物組HDW可下調(diào)lncRNA MALAT1 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，而病毒組中單獨(dú)過表達(dá)lncRNA MALAT1 后促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞增殖、遷移能力。此外，lncRNA MALAT1 過表達(dá)后再進(jìn)行HDW 的干預(yù)，腫瘤細(xì)胞增殖、遷移能力下降，提示MALAT1 是藥物的靶點(diǎn)之一。

研究結(jié)果顯示：lncRNA MALAT1過表達(dá)后HCT-116 細(xì)胞Slug、Snail、TGF-β、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)量和Smad2/3 蛋白磷酸化程度明顯上調(diào)，E-cadherin 蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)，而藥物組和藥物聯(lián)合病毒組均可以逆轉(zhuǎn)上述相關(guān)蛋白的表達(dá)。提示lncRNA MALAT1 可通過激活Slug/Smad 通路促進(jìn)大腸癌的EMT 和轉(zhuǎn)移，而HDW 抑制大腸癌細(xì)胞遷移和侵襲的藥效關(guān)鍵機(jī)制之一是MALAT1/Slug/Smad 信號(hào)通路，減少EMT，進(jìn)而抑制大腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

綜上所述，HDW 可明顯下調(diào)MALAT1進(jìn)而顯著抑制Slug/Smad 通路活化，降低了腫瘤的侵襲性，進(jìn)而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。但由于人體腫瘤轉(zhuǎn)移過程中免疫、激素調(diào)節(jié)、營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境以及治療的相互影響，白花蛇舌草準(zhǔn)確的抗腫瘤機(jī)制需要更深入地研究。