張艷，趙海譽(yù)，侯紅平，王琳娜，姜珊，周嚴(yán)嚴(yán)，司南，王宏潔，王坤，王麗芳，倪理琪*，魏曉露*

1.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700；2.濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇 泰興 225441

健胃消食口服液由太子參、陳皮、山藥、炒麥芽及山楂5 味中藥組成，主要用于脾胃虛弱所致的食積，臨床見多種原因引起的消化不良、小兒厭食癥、胃炎等，是國內(nèi)目前治療消化不良的常用藥物[1]。目前對健胃消食口服液的研究主要集中在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[2-3]，以及單獨(dú)或聯(lián)合用藥治療小兒脾胃氣虛證引發(fā)的厭食、兒童或老年人功能性消化不良、慢性胃炎的臨床效果觀察研究方面[4-9]。本方中太子參、山藥、山楂、陳皮和炒麥芽均具有健脾益氣的功效。脾虛證的主要特點(diǎn)是脾胃機(jī)能不足、升降出入功能失衡，臨床表現(xiàn)有消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等功能的減退。已有研究報(bào)道，與健胃消食口服液相同成分的健胃消食片具有抗應(yīng)激、提高免疫功能和助消化作用，可增強(qiáng)胃動(dòng)力、改善胃分泌功能、提高胃蛋白酶活性、提高免疫力等[10-11]。但是健胃消食口服液相關(guān)的治療機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究制備免疫抑制小鼠模型，探討健胃消食口服液對免疫功能的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討健胃消食口服液健胃消食的作用機(jī)制，以期為健胃消食口服液的臨床應(yīng)用和后續(xù)研究提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物

無特定病原體（SPF）級(jí)雄性BALB/c 小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0006，飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫保持21～25 ℃，相對濕度45%～55%，自然晝夜節(jié)律光照，自由飲水進(jìn)食。本實(shí)驗(yàn)操作過程嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理標(biāo)準(zhǔn)，SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查表編號(hào)：2022B073。

1.2 試藥

健胃消食口服液（濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：2112225）；注射用胸腺五肽（北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司，批號(hào)：20211205）；注射用環(huán)磷酰胺（山西普德藥業(yè)有限公司，批號(hào)：04210703）。

刀豆蛋白A（ConA，美國Sigma 公司，批號(hào)：SLCF6611）；CCK-8試劑 [北仁化學(xué)科技（北京）有限公司，批號(hào)：TR688]；含雙抗的RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)液（批號(hào)：20220410）、紅細(xì)胞裂解液（批號(hào)：20211227）均購自Solarbio 生物科技有限公司；胎牛血清（ExCell Bio 公司，批號(hào)：12J040）；5%綿羊紅細(xì)胞（SRBC，北京源葉生物科技有限公司，批號(hào)：J10HH1184419）；豚鼠血清（北京博奧拓達(dá)科技有限公司，批號(hào)：2022/06）；多甲藻黃素-葉綠素-蛋白復(fù)合物（PerCP）熒光-花菁染料（Cy）5.5 偶聯(lián)抗小鼠抗原CD3e抗體、藻藍(lán)蛋白（APC）偶聯(lián)抗小鼠CD4 抗體、熒光素5-異硫氰酸酯（FITC）偶聯(lián)抗小鼠CD8a 抗體（BD Biosciences Pharmingen 公司，批號(hào)分別為1141679、1113645、1327295）；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，純度≥98%，批號(hào)：CCHM701184）、檸檬酸（純度≥99%，批號(hào)：BW1746）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH，純度≥98%，批號(hào)：SH-N201487）、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP，純度≥98%，批號(hào)：GC35420-100）、順烏頭酸（純度≥98%，批號(hào)：CCFD200673）、琥珀酸（純度≥98%，批號(hào)：BW1754）、α-酮戊二酸（純度≥98%，批號(hào)：BW2515）、乳酸（純度≥90%，批號(hào)：BW1772a）、無水葡萄糖（純度≥98%，批號(hào)：CCHM700477）、二磷酸腺苷（ADP，純度≥98%，批號(hào)：CCAD301420）、單磷酸腺苷（AMP，純度≥98%，批號(hào)：CCFD200371）均購于北京萬佳標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)中心。

1.3 儀器

MCO-5AC 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本Sanyo 公司）；VT-840K 型超凈工作臺(tái)（江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司）；16-K 型高速臺(tái)式低溫離心機(jī)（美國Sigma公司）；SB-1100 型恒溫水浴鍋（上海愛朗儀器有限公司）；H1 型全自動(dòng)酶標(biāo)檢測儀（美國博伯騰儀器有限公司）；CytoFLEX 型流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter 公司）；Triple Quad? 6500+LC-MS/MS 系統(tǒng)（美國AB Sciex 公司），包括Exion LC-20AC 型高效液相色譜儀、Ion Drive? TurboV 型離子源、Sciex 6500 型三重四極桿檢測器、Analyst 1.7 數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)和MutiQuant 3.0.3 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；JA503-DuaIRange 型十萬分之一電子天平（上海舜字恒平科學(xué)儀器有限公司）；Heraeus MuLtifuge X1R 型高速離心機(jī)（美國Thermo Fisher公司）；MS3 digital 型渦旋儀（德國IKA 公司）；Scientz-48L 型高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.1.1 動(dòng)物分組、模型制備與給藥 將60 只SPF級(jí)BALB/c 雄性小鼠于環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d 后，按照體質(zhì)量隨機(jī)分為對照組，模型組，陽性藥物（胸腺五肽，1.5 mg·kg-1）組，健胃消食口服液低、中、高劑量（0.620、1.240、2.480 g·kg-1）組，每組10只。對照組小鼠連續(xù)3 d 腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，其他6組小鼠連續(xù)3 d腹腔注射環(huán)磷酰胺（10 mg·kg-1），制備免疫抑制模型。于第4 天開始給藥，給藥劑量按照動(dòng)物與人體每千克體質(zhì)量劑量折算系數(shù)計(jì)算所得，對照組和模型組小鼠灌胃給予等體積0.9%氯化鈉溶液，每天1 次。連續(xù)給藥15 d，期間每隔2 d 記錄體質(zhì)量，于第15 天稱質(zhì)量，給藥后1 h 對小鼠進(jìn)行托頸處死，于無菌條件下取出小鼠胸腺、脾臟稱定質(zhì)量，計(jì)算脾體比（脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量）和胸腺體比（胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量）。

2.1.2 藥物對脾淋巴細(xì)胞增殖作用的研究 將無菌條件下取出的小鼠脾臟制備成脾細(xì)胞懸液。取部分用含10%胎牛血清的RPMI 1640 完全培養(yǎng)基混懸調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL，分2 孔加入96 孔培養(yǎng)板，每孔90 μL，其中1 孔加入ConA 液（使終質(zhì)量濃度為5 μg·mL-1）10 μL，另一孔加入RPMI 1640培養(yǎng)基10 μL 作為對照，使每孔總體積為100 μL。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。每個(gè)培養(yǎng)板設(shè)置1 個(gè)只加RPMI 1640完全培養(yǎng)液的空白對照孔。置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入CCK-8 10 μL。用酶標(biāo)儀測定450 nm 波長下的吸光度（A），按照公式（1）計(jì)算增殖刺激指數(shù)（SI）。

2.1.3 藥物對T 淋巴細(xì)胞亞群的作用研究 取適量小鼠脾細(xì)胞懸液加入磷酸鹽緩沖液（PBS）10 mL混懸洗滌2 次。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，取1 mL加入離心管中，避光依次加入CD3e、CD4 和CD8a抗體，于4 ℃避光冰浴30 min 封閉。1500 r·min-1離心5 min（離心半徑為9.8 cm）棄上清液后加入PBS 5 mL 洗滌1 次，離心棄上清液，加入PBS 1 mL混懸后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2.1.4 藥物對B 細(xì)胞抗體生成作用的研究 在免疫抑制模型小鼠連續(xù)給藥的第7 天末次給藥后，尾靜脈注射5% SRBC 懸液0.2 mL 進(jìn)行致敏，連續(xù)給藥7 d后停藥，于停藥次日，脫頸處死小鼠，解剖小鼠取脾，制備脾細(xì)胞懸液，用冷PBS 調(diào)節(jié)脾細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液。取脾細(xì)胞懸液1 mL、0.2% SRBC 1 mL、1∶10 稀釋補(bǔ)體1 mL 充分混勻，同時(shí)加設(shè)不加補(bǔ)體的空白對照管，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，置 于37 ℃水 浴60 min 后，3000 r·min-1離 心5 min（離心半徑為9.8 cm），取上清液，用酶標(biāo)儀測定每個(gè)孔A，即為各組藥物的B細(xì)胞抗體生成量。

2.1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有結(jié)果以（）表示，采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），比較各實(shí)驗(yàn)組與對照組的差異。對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，滿足正態(tài)性或方差齊性要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.2.1 化合物作用靶點(diǎn)獲取 利用中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)（TCMIP，http://www.tcmip.cn/）[12]中藥材數(shù)據(jù)庫、中藥方劑數(shù)據(jù)庫，搜集收載的太子參、陳皮、山藥、山楂、麥芽中相關(guān)化學(xué)成分靶點(diǎn)，成分以“ADMET Absorption Level”水平在中等及以上，或“Druglikeness Grading”在moderate 及以上進(jìn)行篩選。同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)，對報(bào)道有生物活性和藥理作用的，雖然不符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的成分依然納入研究。靶點(diǎn)以Tanimoto Score≥0.8進(jìn)行篩選。

2.2.2 疾病靶點(diǎn)獲取 在疾病數(shù)據(jù)庫中以健胃消食口服液相應(yīng)的臨床癥狀“Gastritis”“Anorexia”為關(guān)鍵詞進(jìn)行疾病靶點(diǎn)的搜索?？紤]TCMIP 平臺(tái)疾病靶點(diǎn)主要來自HPO、DisGeNET 及OMIM 數(shù)據(jù)庫。為防止靶點(diǎn)的遺漏，以相同關(guān)鍵詞在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（http://www.genecards.org/）篩選疾病對應(yīng)的靶點(diǎn)信息，合并刪除重復(fù)項(xiàng)作為健胃消食的作用靶點(diǎn)。

2.2.3 交集基因的獲取 利用微生信平臺(tái)（http://www.bioinformatics.com.cn/）將健胃消食口服液與疾病相關(guān)的作用靶點(diǎn)取交集，獲取不同成分的交集基因，并根據(jù)各個(gè)藥物作用靶點(diǎn)的差異性進(jìn)行分析。

2.2.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）分析 將交集靶基因輸入String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，限定物種為“Homo sanpiens”，隱藏游離節(jié)點(diǎn)，medium confidence（0.07）處理后，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，下載.tsv格式文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2中，利用CytoNCA 插件篩選核心靶點(diǎn)，并進(jìn)行差異性分析。

2.2.5 靶點(diǎn)作用通路京都基因與基因組百科全書（KEGG）和基因本體（GO）分析 利用歐易生物云平臺(tái)（https://www.majorbio.com/）核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO及KEGG富集分析，選擇“homo sapiens”，設(shè)置P為0.01，其中GO 功能分析包括生物過程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞組成（CC）。

2.3 基于三羧酸（TCA）循環(huán)通路的機(jī)制探討

取各對照品適量進(jìn)行精密稱定，加入50%甲醇超聲溶解并定容至刻度線，待用。

精確稱量各組小鼠脾臟組織，加入等量0.9%氯化鈉溶液，適量鋼珠，使用高通量組織研磨器研磨1 min 后加入等量乙腈（0.2%甲酸）勻漿2 min，4000 r·min-1離心5 min（離心半徑為9.8 cm），取上清液100 μL，加入乙腈200 μL，渦旋混勻3 min，12 000 r·min-1離心15 min（離心半徑為9.8 cm），取上清液，待檢。色譜、質(zhì)譜分析條件參見文獻(xiàn)[13]。

3 結(jié)果

3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 藥物對小鼠表觀指標(biāo)及體質(zhì)量的影響 連續(xù)給小鼠注射環(huán)磷酰胺3 d后，對照組小鼠精神狀態(tài)良好，皮毛順滑、活動(dòng)敏捷、動(dòng)作協(xié)調(diào)、飲食飲水及活動(dòng)表現(xiàn)均正常，對外界刺激反應(yīng)敏捷。模型組小鼠出現(xiàn)進(jìn)食、飲水減少，體質(zhì)量減輕，活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍，蜷縮弓背，毛松等免疫低下體征，表明小鼠免疫抑制模型制備成功。小鼠體質(zhì)量變化見圖1，模型組小鼠體質(zhì)量持續(xù)下降，而給藥組小鼠從給藥后第4 天開始體質(zhì)量相繼出現(xiàn)不同程度的恢復(fù)，其中健胃消食口服液中、高劑量組小鼠體質(zhì)量與對照組水平接近，給藥組小鼠的飲食減少、反應(yīng)遲鈍、蜷縮弓背情況也均有不同程度的改善。

圖1 健胃消食口服液對小鼠體質(zhì)量的影響（,n=10）

3.1.2 藥物對小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響 健胃消食口服液對免疫低下小鼠脾體比和胸腺體比的影響見表1。模型組小鼠脾體比和胸腺體比較對照組顯著降低，證明免疫抑制模型制備成功。與模型組比較，胸腺五肽組小鼠脾體比和胸腺體比顯著升高，健胃消食口服液各給藥組小鼠脾臟體比和胸腺臟體比均有不同程度升高，提示健胃消食口服液可提高動(dòng)物免疫器官功能水平。

表1 健胃消食口服液對小鼠脾體比和胸腺體比的影響（,n=10）

表1 健胃消食口服液對小鼠脾體比和胸腺體比的影響（,n=10）

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；表2同。

3.1.3 藥物對小鼠免疫功能的影響 健胃消食口服液對免疫低下小鼠的脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力和B細(xì)胞抗體生成能力的影響見表2。與對照組比較，模型組小鼠脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力和B 細(xì)胞抗體生成能力均顯著降低，證明免疫抑制模型制備成功。與模型組比較，胸腺五肽組和健胃消食口服液低、中、高劑量組小鼠脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力和B 細(xì)胞抗體生成能力均不同程度地升高，證明健胃消食口服液可提高小鼠細(xì)胞免疫和體液免疫能力。

表2 健胃消食口服液對小鼠免疫功能調(diào)節(jié)的影響（,n=10）

表2 健胃消食口服液對小鼠免疫功能調(diào)節(jié)的影響（,n=10）

3.1.4 藥物對T 淋巴細(xì)胞亞群的影響 健胃消食口服液對免疫低下小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的影響結(jié)果見表3。設(shè)CD3+作為門類檢測基數(shù)，通過熒光比值獲得CD4+和CD8+的相對數(shù)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組的CD4+、CD8+和CD4+/CD8+的值均低于對照組（P<0.01）。與模型組比較，胸腺五肽陽性藥和健胃消食口服液低、中、高劑量組均有不用程度的提高（P<0.05，P<0.01），其中健胃消食口服液低、中劑量組的CD4+值顯著提高（P<0.01），中劑量組CD8+值顯著提高（P<0.01），高低劑量組CD4+/CD8+值顯著提高（P<0.01）。

表3 健胃消食口服液對T淋巴細(xì)胞亞群的作用（,n=10）

表3 健胃消食口服液對T淋巴細(xì)胞亞群的作用（,n=10）

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 成分靶點(diǎn)信息整合 通過數(shù)據(jù)庫搜索與文獻(xiàn)補(bǔ)充[14]，收集太子參化學(xué)成分9 個(gè)、陳皮化學(xué)成分50 個(gè)、山藥化學(xué)成分34 個(gè)、麥芽化學(xué)成分9 個(gè)、山楂化學(xué)成分27 個(gè)，經(jīng)篩選共收集成分靶點(diǎn)2552 個(gè)，最終刪除重復(fù)值得到靶點(diǎn)650 個(gè)，提示各成分之間共性靶點(diǎn)較多，各成分之間可能存在潛在的疊加作用。化合物見表4。

表4 健胃消食口服液中各中藥成分

3.2.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的獲取 飲食積滯臨床常見厭食、胃炎等病癥。以“Gastritis”與“Anorexia”為關(guān)鍵詞，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫分別獲得靶點(diǎn)3739、2470 個(gè)，根據(jù)Relevance score 參數(shù)進(jìn)行篩選，最終得到1490個(gè)靶點(diǎn)，結(jié)合TCMIP疾病數(shù)據(jù)庫結(jié)果，去除重復(fù)值，最終得到1512個(gè)疾病靶點(diǎn)。

3.2.3 健胃消食口服液、疾病作用靶點(diǎn)差異分析 將成分靶點(diǎn)信息與疾病靶點(diǎn)基因在微生信平臺(tái)取交集，繪制韋恩圖，見圖2。通過取交集靶點(diǎn)，共獲得了健胃消食口服液與疾病相關(guān)作用靶點(diǎn)149個(gè)，與消食相關(guān)作用靶點(diǎn)94個(gè)，與胃炎作用靶點(diǎn)78個(gè)，三者共同靶點(diǎn)23 個(gè)。將交集基因?qū)隨tring 11.0 平臺(tái)，隱藏游離節(jié)點(diǎn)，以.tsv 格式導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。

圖2 健胃消食口服液-疾病作用靶點(diǎn)韋恩圖

圖3 健胃消食口服液-疾病作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

3.2.4 核心靶點(diǎn)的功能與通路的分析 為確定健胃消食口服液的核心作用靶點(diǎn)，結(jié)合CytoNCA 插件以度（degree）值進(jìn)行排序篩選了56 個(gè)核心靶點(diǎn)。對核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 及GO 功能分析（P<0.01），結(jié)果見圖4、圖5。

圖4 健胃消食口服液-疾病KEGG富集分析

圖5 健胃消食口服液-疾病靶點(diǎn)GO功能富集

根據(jù)KEGG 分析結(jié)果顯示，健胃消食口服液主要作用于生物體系統(tǒng)分類下的免疫系統(tǒng) [C 型凝集素受體信號(hào)通路、白細(xì)胞介素-17（IL-17）信號(hào)通路、輔助性T 細(xì)胞17（Th17）細(xì)胞分化、Toll 樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)]、環(huán)境信息處理分類下的信號(hào)傳導(dǎo)（腫瘤壞死因子信號(hào)通路、環(huán)腺苷3',5'-單磷酸信號(hào)通路、核轉(zhuǎn)錄因子-κB 信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長因子信號(hào)通路）及新陳代謝分類下的糖代謝（TCA 循環(huán)）。同時(shí)，TCA 循環(huán)也是前20的KEGG 條目中唯一顯著富集在metabolism 的代謝通路，這為后續(xù)的機(jī)制研究帶來新的提示。

BP 富集分析提示，健胃消食口服液主要通過干預(yù)發(fā)熱的正調(diào)控、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控及凋亡過程的負(fù)調(diào)控等過程發(fā)揮相應(yīng)作用。CC 及MF 富集分析表明，健胃消食口服液靶點(diǎn)的產(chǎn)物主要在線粒體、膜筏及突觸等部位通過影響淀粉樣蛋白β結(jié)合、N-甲基-D-天冬氨酸受體NMDA 谷氨酸受體活性、非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性等發(fā)揮作用，見圖5。

3.3 藥物對TCA循環(huán)的影響

健胃消食口服液對免疫低下小鼠TCA 循環(huán)影響見表5。在造模的過程中琥珀酸、ADP、烏頭酸、檸檬酸、丙酮酸的含量均呈現(xiàn)了上升趨勢，而在灌胃給予健胃消食口服液后，琥珀酸、烏頭酸、檸檬酸、丙酮酸含量降低，其中ADP 只在低劑量給藥后呈現(xiàn)下降趨勢。

表5 健胃消食口服液對TCA循環(huán)代謝的影響（,n=4）

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，##P<0.01，###P<0.001。

4 討論

健胃消食口服液具有益氣健脾、消食導(dǎo)滯的功效。研究表明，太子參能促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、提高免疫功能，明顯改善大黃所致脾虛型小鼠小腸功能紊亂的癥狀[15]。陳皮所含揮發(fā)油有利于分泌消化液，促進(jìn)腸道積氣消散，增強(qiáng)食欲；橙皮苷能抑制潰瘍，可利膽和調(diào)節(jié)腸胃[16]。山藥作為我國傳統(tǒng)藥食同源食物之一，主要含有多糖、氨基酸、脂肪酸、山藥素類化合物、微量元素、淀粉、蛋白質(zhì)等化學(xué)成分。研究表明，山藥多糖可有效抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長，具有顯著免疫調(diào)節(jié)效用[17]，對環(huán)磷酰胺所致小鼠肝脾損傷有良好保護(hù)作用[18]。山藥蛋白肽還可以通過激活和保護(hù)免疫系統(tǒng)中的免疫器官、細(xì)胞和活性物質(zhì)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力[19]。麥芽主要含有多糖類、生物堿類等化學(xué)成分。對麥芽的研究熱點(diǎn)集中在其助消化、回乳、抗結(jié)腸炎及抗氧化的活性[20]。山楂是原衛(wèi)生部批準(zhǔn)的藥食兩用藥材之一，主要含有總黃酮、有機(jī)酸、三萜酸和原花青素等化學(xué)成分。研究表明山楂黃酮對小鼠脾淋巴細(xì)胞具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用[21]。山楂提取物對小鼠胃平滑肌具有雙向調(diào)節(jié)作用，可調(diào)節(jié)腸道功能紊亂，起到健胃消食的作用[22]。因此結(jié)合上述5味中藥，可起到補(bǔ)而不滯、通而不峻、不熱不燥的功效[23]。

脾臟和胸腺的發(fā)育狀況與機(jī)體免疫功能密切相關(guān)，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)能客觀反映免疫器官的功能狀況，是機(jī)體非特異性免疫的一個(gè)方面[24]。本研究結(jié)果顯示，健胃消食口服液與模型組相比可增加免疫低下小鼠的脾體比和胸腺體比，其中中劑量組的作用效果最明顯，說明健胃消食口服液可提高動(dòng)物免疫器官的功能水平。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，對成分-疾病核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 富集分析，發(fā)現(xiàn)前10位的條目中有4 條屬于免疫系統(tǒng)，進(jìn)一步提示健胃消食口服液可能是通過影響免疫系統(tǒng)來發(fā)揮相應(yīng)作用。

研究表明，機(jī)體在參與免疫應(yīng)答過程中會(huì)釋放出多種TCA 循環(huán)代謝中間產(chǎn)物[25]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，每個(gè)階段的T 細(xì)胞，甚至是不同的T 細(xì)胞相似階段的亞群均可表現(xiàn)出獨(dú)特的代謝特征，如幼稚 T 細(xì)胞以靜止?fàn)顟B(tài)避免非特異性或過度免疫反應(yīng)[26]。因此，細(xì)胞內(nèi)代謝在很大程度上依賴于TCA 循環(huán)，見圖6。激活后，T細(xì)胞迅速增殖，進(jìn)一步分化成輔助T淋巴細(xì)胞即CD4+T 細(xì)胞和細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞即CD8+T細(xì)胞，兩者比值（CD4+/CD8+）反映T淋巴細(xì)胞的生物活性，比值上升，說明免疫功能增強(qiáng)，相反則說明免疫功能低下。本研究通過流式細(xì)胞儀檢測健胃消食口服液對T 淋巴細(xì)胞亞群增殖的影響，結(jié)果顯示，與模型組相比，健胃消食口服液可提高免疫抑制小鼠的CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞數(shù)量及兩者比值（CD4+/CD8+），但不存在劑量依賴關(guān)系，且低于對照組小鼠，說明健胃消食口服液發(fā)揮免疫活性的方式并不完全是直接激活T 淋巴細(xì)胞。B 細(xì)胞在抗原刺激及Th 細(xì)胞輔助下被激活，經(jīng)過細(xì)胞增殖、抗原選擇、免疫球蛋白類型轉(zhuǎn)換和細(xì)胞表面某些標(biāo)志的改變、細(xì)胞體突變，最終分化為能產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞。因此B 細(xì)胞抗體形成細(xì)胞數(shù)量的多少反映機(jī)體體液免疫的狀態(tài)。與模型組相比，給予健胃消食口服液后抗體釋放量均有不同程度升高，中劑量組的效果較為明顯，說明健胃消食口服液可一定程度提高小鼠體液免疫能力。

圖6 三羧酸循環(huán)代謝與細(xì)胞免疫關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)富集結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，琥珀酸脫氫酶復(fù)合體B 亞基（SDHB）、檸檬酸合酶（CS）、琥珀酸脫氫酶復(fù)合體C 亞基（SDHC）、異檸檬酸脫氫酶1（IDH1）等靶點(diǎn)在TCA 循環(huán)通路顯著富集。TCA 循環(huán)是前20的KEGG條目中唯一顯著富集在metabolism的代謝通路，提示TCA 通路的改變與健胃消食口服液的免疫作用機(jī)制息息相關(guān)。在造模的過程中琥珀酸、ADP、烏頭酸、檸檬酸、丙酮酸的含量均呈現(xiàn)了上升趨勢。琥珀酸被認(rèn)為是一種先天免疫信號(hào)代謝物，可作為代謝紊亂的生物標(biāo)志物。造模過程中過量的琥珀酸會(huì)增加線粒體膜電位，促進(jìn)IL-1β的生成，造成機(jī)體炎癥反應(yīng)。順烏頭酸可促進(jìn)檸檬酸轉(zhuǎn)化成異檸檬酸，檸檬酸作為TCA 循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物之一，含量累積，代謝加快。因此，推測健胃消食口服液可能通過降低代謝產(chǎn)物的積累，緩解異常能量代謝從而影響細(xì)胞免疫代謝功能。

綜上所述，本研究通過注射環(huán)磷酰胺制備免疫抑制小鼠模型，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及體外實(shí)驗(yàn)，評估健胃消食口服液對T 淋巴細(xì)胞亞群的變化提示其免疫調(diào)節(jié)作用的多元性，并結(jié)合代謝組學(xué)的方法，研究TCA 循環(huán)相關(guān)代謝產(chǎn)物與免疫功能的相關(guān)性，為后續(xù)健胃消食口服液的作用機(jī)制研究提供借鑒。