劉虹汝，寧?kù)o華，張?chǎng)?，趙嚴(yán)紅，屈潤(rùn)，張鈺哲，2，3

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，云南 大理 671000；2.云南抗病原藥用植物篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 671000；3.云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 671000）

前列腺癌是指發(fā)生在前列腺上皮的惡性腫瘤，在全球男性腫瘤統(tǒng)計(jì)報(bào)告中位居第2位，每年有超過(guò)120萬(wàn)例新診斷病例，相關(guān)死亡人數(shù)超過(guò)35萬(wàn)［1-5］。影響前列腺癌發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)因素包括年齡、遺傳、高脂飲食、種族、地區(qū)、宗教信仰等。迄今為止，前列腺癌的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，全基因組DNA測(cè)序、mRNA測(cè)序、蛋白質(zhì)組分析和前列腺特異性抗原篩查為前列腺癌分型及其病理學(xué)的遺傳基礎(chǔ)提供重要見(jiàn)解［6］。前列腺癌發(fā)病機(jī)制中表觀遺傳分子途徑是目前的研究熱點(diǎn)，研究認(rèn)為，其表觀遺傳改變比遺傳改變發(fā)生得更早、更頻繁。全基因組關(guān)聯(lián)研究已確定超過(guò)170個(gè)與前列腺癌發(fā)病率相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，單核苷酸多態(tài)性不僅可檢測(cè)早發(fā)性和家族性前列腺癌，還可用于計(jì)算遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，從而進(jìn)行靶向篩查。同時(shí)，有研究［7］表明，微RNA可通過(guò)降解RNA或抑制蛋白質(zhì)翻譯來(lái)控制蛋白質(zhì)表達(dá)，其將成為前列腺癌診斷、預(yù)后和治療選擇的有潛在價(jià)值的標(biāo)志物，以及前列腺癌治療的潛在藥物。

N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）是真核細(xì)胞中最豐富的RNA修飾［8］，目前已在所有生物體的RNA中鑒定出150多種轉(zhuǎn)錄后修飾。廣泛的RNA堿基修飾統(tǒng)稱為表觀轉(zhuǎn)錄組，與翻譯控制、RNA剪接和許多癌癥類型有關(guān)。m6A甲基化由m6A甲基轉(zhuǎn)移酶（包括METTL14、METTL3、KIAA1429、RBM15、ZC3H13和WTAP）、m6A去甲基酶（包括FTO和ALKBH5）、能與甲基化結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的特殊基因（包括YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2和HNRNPC）共同參與調(diào)控，其參與RNA代謝的諸多方面，如mRNA前體剪接、3’末端加工、出核轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯調(diào)節(jié)、mRNA降解和非編碼RNA加工等。m6A甲基化異常會(huì)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和發(fā)育遲緩等，并對(duì)基因表達(dá)、調(diào)控產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響［9］。雖然近年來(lái)m6A已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)，但m6A修飾在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中的分子機(jī)制仍未被深入探索。因此，本研究旨在探尋m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子（以下簡(jiǎn)稱m6A調(diào)節(jié)因子）在前列腺癌組織中的差異表達(dá)情況，并探討其與預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載和整理

從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)下載416例前列腺癌組織樣本和80例癌旁組織樣本（共496例）的相關(guān)RNA-seq 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和相關(guān)臨床病理數(shù)據(jù)，包括年齡、T分期（原發(fā)腫瘤）、N分期（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）、生存時(shí)間、生存狀態(tài)。

1.2 m6A調(diào)節(jié)因子的篩選和比較

本研究使用的12個(gè)m6A調(diào)節(jié)因子包括5個(gè)m6A甲基轉(zhuǎn)移酶（METTL3、METTL14、WTAP、RBM15和ZC3H13），5個(gè)能與甲基化結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的特殊基因（YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2和HNRNPC），2個(gè)m6A去甲基酶（FTO和ALKBH5）。從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載這些調(diào)節(jié)因子在前列腺癌組織和癌旁組織中的mRNA表達(dá)量，使用R軟件Pheatmap包以及Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，比較前列腺癌組織和癌旁組織中12個(gè)m6A調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平。

1.3 前列腺癌樣本的無(wú)監(jiān)督聚類分析

使用R軟件Consensus Cluster Plus包和χ2檢驗(yàn)，對(duì)前列腺癌組織進(jìn)行無(wú)監(jiān)督聚類分組，確定前列腺癌樣本分層聚類分析的最佳樣本組數(shù)，繪制Kaplan-Meier生存曲線，分析各組間的預(yù)后差異，探究m6A調(diào)節(jié)因子與前列腺癌預(yù)后的潛在關(guān)聯(lián)。

1.4 構(gòu)建m6A調(diào)節(jié)因子的多因素Cox回歸模型及繪制生存曲線

通過(guò)R軟件對(duì)m6A調(diào)節(jié)因子進(jìn)行多因素Cox回歸分析，篩選出差異表達(dá)的m6A調(diào)節(jié)因子，應(yīng)用survival包繪制高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組的Kaplan-Meier生存曲線，評(píng)估高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)對(duì)前列腺癌患者總生存率（overall survival，OS）的影響。

1.5 臨床病理因素的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和多因素Cox回歸模型

對(duì)臨床病理因素（包括年齡、T分期、N分期）進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，通過(guò)R軟件survival包對(duì)臨床病理因素和總風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分進(jìn)行多因素 Cox 回歸分析，繪制森林圖，判斷臨床病理因素和總風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分能否作為獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。

1.6 列線圖分析

使用 library（rms）函數(shù)包進(jìn)行由年齡、分期和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組成的列線圖分析，用于預(yù)測(cè)患者2年、3年和5年的OS。

1.7 免疫組織化學(xué)染色

采用免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)包含前列腺癌組織樣本（n=20）和癌旁組織樣本（n=20）的組織芯片中METTL14和FTO蛋白表達(dá)水平。組織芯片經(jīng)脫蠟、水化后，采用枸櫞酸緩沖液高壓修復(fù)抗原，冷卻至常溫。再用3% H2O2處理，避光封閉15 min；PBS洗滌3次，每次5 min；滴加山羊血清，37 ℃封閉30 min；4 ℃過(guò)夜，孵育兔抗人METTL14（EPR27234-62，中國(guó)Abcam公司）和FTO（ab94482，中國(guó)Abcam公司）單克隆抗體，稀釋濃度為1 ∶100；PBS洗滌3次，每次5 min，滴加兔通用IgG二抗，37 ℃孵育30 min；PBS洗滌3次，滴加辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的三抗，37 ℃孵育30 min；PBS洗滌3次后，DAB顯色；流水沖洗15 min，蘇木精復(fù)染1 min后，流水沖洗30 min，脫水封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像。采用半定量方法評(píng)價(jià)METTL14和FTO蛋白表達(dá)情況。METTL14和FTO蛋白染色強(qiáng)度：陰性，0分；弱陽(yáng)性，1分；中陽(yáng)性，2分；強(qiáng)陽(yáng)性，3分。METTL14和FTO蛋白陽(yáng)性染色百分比：＜5%，0分；5%～＜25%，1分；25%～＜50%，2分；50%～＜75%，3分；≥75%，4分。每個(gè)組織標(biāo)本METTL14和FTO蛋白的染色積分為強(qiáng)度得分×百分比得分，總分為0～12分，其中＜9分為低表達(dá)，≥9分為高表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)下載和m6A調(diào)節(jié)因子的篩選與比較

本研究的496例前列腺癌患者中，年齡＜45歲223例，≥45歲273例；T分期：T2187例，T3291例，T411例；N分期：N0343例，N180 例；生存時(shí)間：＞5年84例，≤5年412例；生存狀態(tài)：死亡9例，存活487例。

416例癌組織樣本和80例癌旁組織樣本的m6A調(diào)節(jié)因子的差異表達(dá)分析結(jié)果顯示，8個(gè)m6A調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。其中ALKBH5、FTO、METTL14、YTHDC1和ZC3H13在癌組織中下調(diào)，HNRNPC、METTL3和YTHDF1在癌組織中上調(diào)（圖1A）。比較12個(gè)m6A調(diào)節(jié)因子在不同T分期癌組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，不同分期時(shí)HNRNPC、YTHDC2、YTHDF1和YTHDF2的表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），其中HNRNPC的表達(dá)量隨前列腺癌的進(jìn)展出現(xiàn)顯著持續(xù)升高（圖1B）。將前列腺癌樣本按淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為轉(zhuǎn)移組（N1）和無(wú)轉(zhuǎn)移組（N0），分析2組間12個(gè)m6A調(diào)節(jié)因子的表達(dá)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，N1組HNRNPC、RBM15、YTHDF1和YTHDF2mRNA的表達(dá)水平明顯高于N0組（圖1C）。上述結(jié)果表明，m6A調(diào)節(jié)因子與前列腺癌的發(fā)生和進(jìn)展存在潛在關(guān)聯(lián)，對(duì)前列腺癌預(yù)后標(biāo)志物的篩選具有研究?jī)r(jià)值。

圖1 前列腺癌樣本中 m6A 調(diào)節(jié)因子的表達(dá)情況Fig.1 Expression of m6A regulators in prostate cancer samples

2.2 前列腺癌樣本無(wú)監(jiān)督聚類分析

根據(jù)8個(gè)差異表達(dá)的m6A調(diào)節(jié)因子的mRNA表達(dá)水平對(duì)前列腺癌樣本進(jìn)行無(wú)監(jiān)督聚類分析，確定最佳樣本聚類數(shù)為3（圖2A）。采用層次聚類方法將前列腺癌樣本分為3組，分別為Cluster 1、Cluster 2、Cluster 3（圖2B）。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，3組間OS的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Cluster 2的10年OS較Cluster 1和Cluster 3高，表明Cluster 2有較好的預(yù)后（圖2C）。以上結(jié)果表明，m6A調(diào)節(jié)因子對(duì)前列腺癌聚類結(jié)果與前列腺癌預(yù)后存在潛在關(guān)聯(lián)。

圖2 前列腺癌樣本的聚類和預(yù)后分析Fig.2 Clustering and prognostic analysis of prostate cancer samples

2.3 構(gòu)建m6A調(diào)節(jié)因子的多因素Cox回歸模型及繪制生存曲線

構(gòu)建多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，進(jìn)一步篩選出與前列腺癌OS相關(guān)的m6A調(diào)節(jié)因子，其中METTL14和FTO的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的HR和95%CI，確定METTL14為前列腺癌獨(dú)立高風(fēng)險(xiǎn)影響因素（圖3A）。根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將樣本分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，與低風(fēng)險(xiǎn)組相比，高風(fēng)險(xiǎn)組前列腺癌患者OS較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3B）。

圖3 m6A調(diào)節(jié)因子與前列腺癌預(yù)后的關(guān)聯(lián)Fig.3 Association between m6A regulators and prostate cancer prognosis

2.4 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與臨床病理因素的關(guān)系及多因素Cox回歸模型

對(duì)不同前列腺癌患者的臨床病理因素（包括年齡、T分期和N分期）進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，結(jié)果顯示，前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)與臨床病理因素?zé)o關(guān)（圖4A～4C）。通過(guò)構(gòu)建多因素Cox回歸模型對(duì)前列腺癌患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、年齡、T分期和N分期進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分可作為前列腺癌的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)（P＜0.05，圖4 D）。

圖4 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與前列腺癌臨床病理因素的關(guān)系Fig.4 Association of risk score with clinicopathological factors in prostate cancer samples

2.5 列線圖的構(gòu)建和驗(yàn)證

通過(guò)多變量Cox回歸分析中包含的重要因素，即年齡、T分期、N分期和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，發(fā)現(xiàn)列線圖構(gòu)建的模型能夠較好地預(yù)測(cè)患者2、3和5年的OS（圖5）。

圖5 年齡、分期和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組成的列線圖預(yù)測(cè)前列腺癌患者2年、3年和5年的OSFig.5 A nomogram of age，stage，and risk score predicts 2-，3-，and 5-year OS for prostate cancer patients.

2.6 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

每張切片由2名病理科醫(yī)師進(jìn)行獨(dú)立判斷并評(píng)分，兩者不一致時(shí)采取重新評(píng)估原則。每張玻片在高倍鏡視野下進(jìn)行多處觀察，同一范圍采100個(gè)細(xì)胞。結(jié)果顯示，包含前列腺癌組織樣本和癌旁組織樣本的組織芯片中，METTL14和FTO蛋白陽(yáng)性標(biāo)記為棕黃色染色顆粒并彌漫分布于細(xì)胞核，前列腺癌組織與癌旁正常組織均表達(dá)METTL14和FTO。前列腺癌組織和癌旁正常組織中FTO蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為76%（76/100）和28%（28/100），染色積分分別為12分（高表達(dá)）和4分（低表達(dá)）；METTL14蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為54%（54/100）和11%（11/100），染色積分分別為9分（高表達(dá)）和2分（低表達(dá)）。鄰近正常組織中FTO和METTL14蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均明顯低于前列腺癌組織（均P＜0.05）。見(jiàn)圖6。

圖6 前列腺癌組織和癌旁正常組織中FTO和METTL14蛋白的表達(dá)Fig.6 Expression of FTO and METTL14 protein in prostate cancer tissues and adjacent normal tissues

3 討論

在人類基因組表觀遺傳學(xué)修飾中，已發(fā)現(xiàn)超過(guò)7 000多種mRNA和300多種非編碼RNA中存在m6A表觀遺傳學(xué)修飾［10］，并且越來(lái)越多的證據(jù)表明m6A這種高豐度修飾在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中均有重要作用［11］。目前，對(duì)于前列腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究和治療尚未取得突破性進(jìn)展，迫切需要確定前列腺癌治療的新靶點(diǎn)，進(jìn)而為前列腺癌的早期診斷和預(yù)后提供科學(xué)依據(jù)。因此，在前列腺癌中鑒定m6A甲基化調(diào)控基因可能提供有價(jià)值的治療新靶點(diǎn)。

本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載了年齡、T分期、N分期等數(shù)據(jù)完整的496例樣本的臨床病理資料及mRNA相關(guān)數(shù)據(jù)，獲取了METTL3、METTL14、WTAP、RBM15、ZC3H13、YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2、HNRNPC、FTO和ALKBH5共12種m6A調(diào)節(jié)因子，篩選出5個(gè)下調(diào)（ALKBH5、FTO、METTL14、YTHDC1和ZC3H13）和3個(gè)上調(diào)（HNRNPC、METTL3和YTHDF1）調(diào)節(jié)因子；不同T分期的前列腺癌中HNRNPC、YTHDC2、YTHDF1和YTHDF2mRNA的表達(dá)水平不同，并且HNRNPC的表達(dá)量隨著前列腺癌的進(jìn)展出現(xiàn)顯著持續(xù)升高；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組RBM15、HNRNPC、YTHDF2和YTHDF1mRNA的表達(dá)水平明顯高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組。對(duì)8個(gè)差異表達(dá)的m6A調(diào)節(jié)因子進(jìn)行無(wú)監(jiān)督聚類分析，將樣本分成Cluster 1、Cluster 2和Cluster 3，并且發(fā)現(xiàn)3組間OS存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，m6A調(diào)節(jié)因子METTL14和FTO與前列腺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。構(gòu)建LASSO回歸模型對(duì)前列腺癌患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，并分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組，發(fā)現(xiàn)2組間OS有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分可作為獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，用于預(yù)測(cè)患者的生存情況。前列腺癌組織樣本和癌旁正常組織樣本的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，METTL14和FTO蛋白水平在前列腺癌組織中高表達(dá)。值得注意的是，由于前列腺患者的死亡率低，且臨床數(shù)據(jù)中T4分期的樣本過(guò)少，導(dǎo)致根據(jù)T分期預(yù)測(cè)患者的生存情況結(jié)果欠準(zhǔn)確，但這并不影響列線圖預(yù)測(cè)整體的準(zhǔn)確性。未來(lái)可以通過(guò)擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步提高T分期在預(yù)測(cè)中的準(zhǔn)確性。

研究發(fā)現(xiàn)，m6A甲基化結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的特殊基因中的HNRNPC可參與RNA的剪接、非特異性RNA輸出、RNA表達(dá)、3’末端加工和翻譯，并在黑色素瘤、肝癌、肺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)。研究［12］表明，沉默HNRNPC可減少膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖并增強(qiáng)依托泊苷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表明HNRNPC可作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后和治療的潛在標(biāo)志物。研究［13］指出，過(guò)表達(dá)HNRNPC時(shí)可促進(jìn)化學(xué)抗性，通過(guò)小干擾RNA敲低HNRNPC可逆轉(zhuǎn)化學(xué)抗性，HNRNPC過(guò)表達(dá)與接受化療藥物治療的胃癌患者的生存率呈負(fù)相關(guān)，這表明HNRNPC與胃癌預(yù)后不良有關(guān)。研究［14］發(fā)現(xiàn)，HNRNPC過(guò)表達(dá)可通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促使口腔鱗狀細(xì)胞發(fā)生癌變。本研究發(fā)現(xiàn)，HNRNPC的表達(dá)水平與前列腺T分期相關(guān)，HNRNPC的表達(dá)隨著前列腺癌的進(jìn)展而顯著持續(xù)升高。從而推測(cè)，HNRNPC可能為前列腺癌提供新的治療靶點(diǎn)。

METTL14是m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的重要組成成分，在體外甲基化轉(zhuǎn)移能力較高，且在多種腫瘤中表達(dá)異常，參與多種腫瘤的惡性表型調(diào)控。FTO是第1個(gè)發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶，可以影響相鄰基因轉(zhuǎn)錄，消除mRNA的m6A修飾。FTO在急性髓系白血病、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞自我更新、宮頸鱗狀細(xì)胞癌化療、放療耐藥性中起關(guān)鍵作用。此外，F(xiàn)TO高表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移、侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，與不良預(yù)后密切相關(guān)。METTL14和FTO盡管已經(jīng)被證明與多種癌癥的發(fā)展有關(guān)，但其在前列腺中的作用目前仍然不明確，且m6A調(diào)節(jié)因子在前列腺癌中的作用機(jī)制相關(guān)研究較少。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，METTL14和FTO可成為獨(dú)立預(yù)測(cè)前列腺癌患者預(yù)后的關(guān)鍵調(diào)控基因，強(qiáng)調(diào)了RNA修飾在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中的重要作用，并為治療方法的選擇提供了潛在的標(biāo)志物。