鄭曉雨,魯璽龍,聞 武,楊 帆,趙興春,*

(1.公安部禁毒情報(bào)技術(shù)中心,北京 100193;2.公安部物證鑒定中心,北京 100038)

新冠疫情暴發(fā)以來,全球公共健康受到嚴(yán)重威脅[1]。新冠病毒傳染能力極強(qiáng),除飛沫傳播和接觸傳播外,還可能通過感染患者的糞便排出體外,隨著醫(yī)院廢水或市政污水等排放后,經(jīng)城市污水管網(wǎng)/道進(jìn)入污水處理廠,長期存活于污水體系中[2-3]。2020年,荷蘭首次報(bào)道污水中檢測到新冠病毒,比首例確診病例早3周時(shí)間[4]。法國、美國等的學(xué)者[1,5-8]研究表明,采樣時(shí)段內(nèi)污水中新冠病毒含量與相應(yīng)區(qū)域內(nèi)確診人數(shù)變化趨勢呈良好的正相關(guān)性,美國和澳大利亞的學(xué)者[1,9]還根據(jù)污水中新冠病毒RNA檢測量估算相應(yīng)區(qū)域感染人數(shù)。這些研究[10]充分證明,污水流行病學(xué)可在提供疫情預(yù)警信號、動(dòng)態(tài)監(jiān)測疫情發(fā)展和輔助評估疫情干預(yù)方面發(fā)揮重要作用。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,大多數(shù)污水處理廠的污水中新冠病毒載量僅為1×104～1×106copies/L,提高目標(biāo)物的檢測靈敏度成為發(fā)揮作用的基礎(chǔ)。同時(shí),雖然溫度、日光以及其他拮抗微生物等都會影響新冠病毒的存活,但由于其極強(qiáng)的傳染性,仍然存在病毒暴露引發(fā)操作人員感染、處理不當(dāng)造成受納水體污染等風(fēng)險(xiǎn)。因此,快速有效的富集方法成為精確監(jiān)測新冠病毒的關(guān)鍵制約因素[11]。

污水流行病學(xué)用于監(jiān)測病毒等在人群中的傳播已經(jīng)得到廣泛研究和應(yīng)用,但大多為針對非包膜病毒。由于新冠病毒為包膜病毒,其與非包膜病毒的富集方法存在不同。由于研究時(shí)間、傳播特性等原因,針對新冠病毒富集方法的研究成果還不夠系統(tǒng)、成熟。因此,本文旨在系統(tǒng)梳理現(xiàn)有相關(guān)研究文獻(xiàn),通過比較不同富集方法的優(yōu)缺點(diǎn),指出當(dāng)前和未來研究的重點(diǎn)方向,為制定標(biāo)準(zhǔn)化方案提供有益參考。

1 常見富集方法

根據(jù)原理不同,富集方法可分為物理化學(xué)方法和物理方法[11]。物理化學(xué)方法是在使用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)與NaCl、MgCl2、葡萄糖或明礬等化學(xué)試劑產(chǎn)生聚合絮沉和兩相分離的基礎(chǔ)上進(jìn)行物理分離提取和富集,如膜吸附-洗脫法、絮凝沉淀法等。物理方法主要應(yīng)用離心和過濾或超速離心和再懸浮的組合,如超速離心法、超濾法、常規(guī)過濾法等。其中,PEG絮凝沉淀和超濾被世界衛(wèi)生組織推薦用于脊髓灰質(zhì)炎病毒循環(huán)的環(huán)境監(jiān)測,膜吸附脫附被美國環(huán)保局作為檢測水中隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲的標(biāo)準(zhǔn)方法。2022年,國家衛(wèi)健委將PEG絮凝沉淀、鋁鹽絮凝沉淀、離心超濾作為污水中新冠病毒富集的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布實(shí)施。本文將重點(diǎn)介紹幾種當(dāng)前最為常用的富集方法(表1)。

1.1 膜吸附-洗脫法

膜吸附-脫附法基本過程是將含有病毒的水體通過吸附性過濾器,利用過濾器與病毒之間的靜電作用使病毒吸附在帶電濾膜上,再用磷酸緩沖鹽等從濾膜上洗脫病毒[12]。濾膜可分為負(fù)電膜(如硝酸纖維素膜)和正電膜(如nanoceram膜、1MDS),根據(jù)病毒的帶電荷狀態(tài)選擇合適的濾膜。一般來說,大多數(shù)腸道病毒在接近中性pH的環(huán)境水中具有凈負(fù)電荷,因此,使用負(fù)電膜富集前需添加陽離子鹽(如MgCl2、AlCl3或NaCl)促進(jìn)帶負(fù)電的病毒通過陽離子鹽橋與膜結(jié)合,最后需要用酸將吸附的陽離子洗脫以提高病毒回收率。例如,通過加入低濃度的NaCl和MgCl2實(shí)現(xiàn)利用硝酸纖維素微孔膜對病毒進(jìn)行富集。另外,由于污水中的懸浮物會引起堵塞和基質(zhì)效應(yīng),一般應(yīng)進(jìn)行預(yù)過濾或預(yù)離心。使用正電膜富集則無需加鹽或酸化,加鹽或酸化有可能會在帶負(fù)電的病毒顆粒周圍形成正雙電層,從而降低正電膜過濾效率。從目前研究來看,相對于負(fù)電膜而言,正電膜的成本較高。

通過對比不同負(fù)電膜法對腺病毒和小鼠肝炎病毒(MHV)的富集效率發(fā)現(xiàn),對于非包膜病毒腺病毒,水樣預(yù)酸化處理后的樣品未見實(shí)時(shí)熒光定量(qPCR)抑制,且回收率是添加MgCl2方法的10倍[13],而對于與新冠病毒具有相似基因結(jié)構(gòu)和包膜蛋白的MHV[14],添加MgCl2的回收率最高達(dá)到65.7%[15],這可能是由于預(yù)酸化過程破壞了病毒結(jié)構(gòu)[16]。該課題組還對比了負(fù)電膜法與超濾法對污水中新冠病毒的富集效率,發(fā)現(xiàn)兩種方法均未出現(xiàn)qPCR抑制,但對兩個(gè)樣品檢測出現(xiàn)相反結(jié)果,其含量均低于定量限[1]。一項(xiàng)針對新冠病毒的8種富集方法對比結(jié)果表明,添加MgCl2的膜吸附脫附具有最低的回收率[17]。

1.2 絮凝沉淀法

絮凝沉淀法是通過向樣本中加入絮凝劑使病毒與絮凝體結(jié)合,然后通過物理方法收集和洗脫實(shí)現(xiàn)富集的方法[12]。PEG絮凝沉淀法是分析水樣中新冠病毒載量的常用方法之一,比一般化學(xué)絮沉效果更好[18]。

利用絮凝沉淀可回收污水中水相和固體懸浮物中的新冠病毒[19],但回收率并不高[15],可能是因?yàn)榇嬖谀孓D(zhuǎn)錄抑制[15]或qPCR抑制劑共沉淀[5]。Bar-Or等[20]分別采用PEG和明礬絮凝沉淀法富集新冠病毒,qPCR測定陽性樣本循環(huán)參數(shù)分別為33和33.6。La等[21]通過改進(jìn)世界衛(wèi)生組織關(guān)于脊髓灰質(zhì)炎病毒傳播環(huán)境監(jiān)測指南,在采用PEG沉淀法時(shí)略去其中氯仿處理步驟,保證了病毒結(jié)構(gòu)的完整性,從而提高新冠病毒的回收率?！段鬯行滦凸跔畈《靖患瘽饪s和核酸檢測方法標(biāo)準(zhǔn)》(WS/T 799—2022)中PEG沉淀法包括預(yù)離心、次級離心和濃縮富集三步,其中次級離心需在12 000g下離心2 h,鋁鹽混凝沉淀法包括預(yù)離心、絮凝處理、離心分離和絡(luò)合溶解四步,最大離心力為2 500g,且離心時(shí)間更短,該標(biāo)準(zhǔn)方法的檢出限為10 copies/mL。

1.3 超速離心法

超速離心法是在預(yù)離心去除較大顆粒的基礎(chǔ)上,利用超速離心機(jī)強(qiáng)大的離心力使物理特征不同的物質(zhì)分離。一般而言,1 000～3 000g離心15 min足以沉淀全細(xì)胞細(xì)菌,高速離心(高于5 000g)可沉淀線粒體等大細(xì)胞器,而沉淀病毒則需要提供100 000g離心力的超速離心機(jī)。通過調(diào)控離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間,還可對樣品中不同成分進(jìn)行分離。

Wurtzer等[22]將11 mL搖勻后的樣品置于離心機(jī)中,在4 ℃下200 000g離心1 h,隨后加入到400 μL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液中,取200 μL進(jìn)行檢測,新冠病毒RNA為1×104～1×107copies/L,但未提供回收率數(shù)據(jù)。Ahmed等[15]利用超速離心法對MHV的平均回收率為33.5%,而Ye等[19]在4 ℃下100 000g離心15 min后平均回收率僅為5%左右,鑒于只檢測活性病毒,推測低回收率與過高離心力造成病毒失活有關(guān),同時(shí)部分被吸附在懸浮顆粒上的病毒在除去上清液時(shí)損失。

1.4 超濾法

超濾法是利用在一定壓力下,分子大小與濾膜孔徑的關(guān)系實(shí)現(xiàn)病毒富集的目的。為避免較大雜質(zhì)顆粒堵塞[12],往往需要在超濾之前進(jìn)行預(yù)離心[19]。盡管超濾過程中病毒的富集不是通過靜電相互作用發(fā)生的,但是病毒仍然可以通過范德華力、疏水作用等被吸附到超濾膜上。病毒在超濾膜上的回收需要用甘氨酸溶液、牛肉提取物、0.1 mol/L HNO3和0.1 mol/L NaOH交替溶液或多磷酸鈉等進(jìn)行反沖洗[23]。

Medema等[4]將樣品以4 654g離心30 min,取100～200 mL上清液通過截留分子量為100 kDa的離心超濾器實(shí)現(xiàn)富集,對F-特異性RNA噬菌體回收率達(dá)73%±50%。超濾法的回收率較高,但同時(shí)不確定度較高,其中超濾筒截留分子量、富集倍數(shù)以及超濾筒是否再生均會對新冠病毒回收率產(chǎn)生影響[17],此外在預(yù)過濾步驟病毒也會通過范德華力或疏水鍵被吸附到離心過濾器,損失可高達(dá)30%[13]。研究[10]表明,采用雙重超濾法對新冠病毒富集效果更佳?！段鬯行滦凸跔畈《靖患瘽饪s和核酸檢測方法標(biāo)準(zhǔn)》(WS/T 799—2022)中給出一次性超濾杯的截留分子量為30 kDa,方法檢出限為100 copies/mL。

2 討論與分析

由于新冠病毒極強(qiáng)的傳染性等原因,針對其富集方法的研究還較為有限。但在過去幾十年里,根據(jù)污水中不同病毒的分析需求,科學(xué)家們對富集方法進(jìn)行了大量研究。通過對比分析和梳理總結(jié),有望對研究新冠病毒提供有益參考。如表2所示,著重從回收率、耗時(shí)、準(zhǔn)確性和成本等角度比較了不同富集方法的優(yōu)缺點(diǎn)。值得說明的是,由于試驗(yàn)中污水樣品(包括污水體積、基質(zhì)、新冠病毒的濃度)、替代病毒的選擇、儀器設(shè)備參數(shù)(如負(fù)電膜種類、尺寸、洗脫劑,沉淀劑種類、沉淀時(shí)間,離心速度、時(shí)間及截留分子量)等的區(qū)別,不同研究文獻(xiàn)對各富集方法的評價(jià)存在一定差異。

表2 富集方法對比Tab.2 Comparison of Concentration Methods

2.1 回收率

不同富集方法回收率的差異主要來自于處理過程中目標(biāo)物的損失以及檢測時(shí)基質(zhì)等成分對目標(biāo)物響應(yīng)的干擾等。大量研究[27]表明,新冠病毒容易被吸附到污水中懸浮顆粒物上,因此,預(yù)離心或預(yù)過濾步驟有可能導(dǎo)致病毒損失。膜吸附脫附法和超濾法的回收率較高[27-28],但病毒與膜或設(shè)備之間的靜電力、范德華力或疏水鍵等會引起病毒損失,使用惰性材料或優(yōu)化洗脫劑會提高回收率[29],不同病毒的生物性差異造成不同洗脫劑洗脫效率的差異[30]。例如,被廣泛應(yīng)用于回收病毒的甘氨酸在其最佳堿性洗脫pH下會造成病毒失活,牛肉提取物能夠在更溫和的pH下洗脫,但其蛋白質(zhì)成分會引起基質(zhì)效應(yīng),造成整體回收率下降。在針對新冠病毒的研究中,大多數(shù)采用磷酸鹽緩沖液洗脫,特別要注意氯仿等有機(jī)物可能會造成新冠病毒包膜的破壞[31]。超速離心法無需引入牛肉提取物等干擾物[32],還可以通過離心程序設(shè)置等去除樣品中的一些干擾物[33],但預(yù)離心步驟仍可能引起病毒損失。

絮凝沉淀法和超濾法對目標(biāo)物缺乏特異性選擇使得富集產(chǎn)物的基質(zhì)較為復(fù)雜[34]。Ikner等[29]認(rèn)為,絮凝共沉淀物中的有毒物質(zhì)可能導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)物中毒,且PEG存在反滲析和污染樣品等情況。Barril等[27]采用類似于新冠病毒的貓杯狀病毒(feline calicivirus,FCV)作為替代病毒,對比了包括絮凝沉淀、膜吸附脫附等在內(nèi)的11種富集方法。結(jié)果表明,PEG沉淀的平均回收率較高,而膜吸附脫附法對FCV病毒無效。這與Ahmed等[15]以MHV為替代病毒的研究結(jié)果不一致。Barril等[27]認(rèn)為除樣品體積、污水雜質(zhì)對濾孔堵塞以及基質(zhì)效應(yīng)外,病毒結(jié)構(gòu)不同是造成回收率差異的主要原因。Zheng等[17]采用單因素方差分析法系統(tǒng)比對8種不同富集方法的Ct值平均值和回收率。其中超速離心法的回收率(25.4%±5.9%)明顯高于其他方法,因此,適于快速靈敏地監(jiān)測污水中新冠病毒。之后依次是絮凝沉淀法、超濾法和膜吸附脫附法。其中,絮凝沉淀法中不同沉淀劑(AlCl3、MgCl2和PEG)的平均回收率也有顯著差異,AlCl3的可變性最低。因此,盡管回收率較低(11.0%±4.36%),但考慮到所需特殊設(shè)備較少,認(rèn)為AlCl3沉淀為最優(yōu)富集方法。

2.2 耗時(shí)

不同富集方法的機(jī)理決定其耗時(shí)存在顯著差異,一般來說,超濾法和超速離心法的耗時(shí)明顯短于膜吸附脫附法,特別是許多新型超濾的平均耗時(shí)僅有10～15 min[29],絮凝沉淀法耗時(shí)最長。但必須說明的是,同一方法也存在巨大差異,這不僅與資源配置或樣品等存在密切關(guān)系,而且有時(shí)直接影響了回收率和靈敏度等。超濾法和超速離心法不需要洗脫或次級富集,還可以不調(diào)整pH或者添加陽離子[29],大大減少了處理步驟,但不同設(shè)備最大離心速度差異對耗時(shí)和離心效果具有顯著影響。在膜吸附脫附法和超濾法中,由于樣品基質(zhì)和進(jìn)樣體積的不同、濾孔堵塞等問題,不可避免地影響方法耗時(shí)。為保證絮凝劑充分反應(yīng),絮凝沉淀法往往需要在加入絮凝劑后低速攪拌過夜,耗時(shí)長(長達(dá)15 h以上[11])。Laturner等[12]認(rèn)為沉淀時(shí)間縮短至4 h不降低回收率,甚至可進(jìn)一步縮短沉淀時(shí)間,但對牛冠狀病毒(BCoV)僅有0.09%的回收率,確實(shí)低于其他一些報(bào)道。

2.3 成本

本文的成本主要考慮富集方法所需要的設(shè)備耗材等,而不包括與耗時(shí)相關(guān)的人力成本等。昂貴的離心機(jī)是富集成本的重要組成部分,膜吸附脫附法是唯一可不需要離心步驟的方法,但在過濾之前通過離心去除固體雜質(zhì)可大大提高方法通量,且對定量結(jié)果無明顯影響[35],因此,也被多個(gè)課題組采用。就單個(gè)樣品的耗材成本而言,目前最昂貴的方法是超濾,主要在于其過濾器價(jià)格昂貴且不可重復(fù)使用[12,29]。出于類似的原因,PEG絮凝沉淀法的成本也相對較高。將0.22 μm過濾器用于過濾裝置有可能降低成本,但代價(jià)是潛在的裝置污染風(fēng)險(xiǎn)或增加耗時(shí)以徹底清洗。采用膜吸附脫附法時(shí),不同的濾膜價(jià)格成本也存在較大差異。報(bào)道稱,正電膜Virosorb 1MDS 和NanoCeram的售價(jià)分別為250美元和50美元,而負(fù)電膜則相對便宜得多[29]。盡管超速離心設(shè)備較為昂貴,但由于容器可以重復(fù)使用,每個(gè)樣品的材料成本較低[29]。

2.4 通量

污水中病毒并非均勻分布,因此,樣品體積會影響到富集方法的靈敏度、重復(fù)性和可變性。比如,隨著污水樣品體積的增加,所得濃縮物中病毒RNA的濃度液也會增加。通常來說,受儀器設(shè)備體積的限制,超速離心法和超濾法只能處理少量樣品,更多應(yīng)用于次級富集。相對而言,膜吸附脫附法和絮凝沉淀法可處理大體積的樣品,因此,更適合于初級富集。但處理更大體積的樣品也存在弊端,比如耗時(shí)相應(yīng)增加。此外,以膜吸附脫附法為例,處理過程中濾膜的孔可能會被堵塞,或者吸附活性位點(diǎn)被占據(jù),從而導(dǎo)致吸附效率降低,因此,樣品體積也存在極限和最佳平衡值。事實(shí)上,濾孔被堵塞的問題也存在于超濾法中,使其通量同樣受到限制。在PEG絮凝沉淀法中,增加樣品體積則意味著需要更大體積容量和更高效率的離心機(jī),從而增加方法成本。

3 存在的主要問題

污水中新冠病毒富集方法的選擇,需要從回收率、資源配置、成本、耗時(shí)以及試驗(yàn)?zāi)康牡确矫娼y(tǒng)籌考慮。當(dāng)前有關(guān)研究報(bào)道缺乏可比性,尚不能形成完全令人信服的理論性指導(dǎo)方法,在富集方法的比較分析與選擇以及實(shí)踐應(yīng)用上還存在不少問題。

3.1 替代病毒的選擇

由于新冠病毒的高傳染性,科學(xué)研究中經(jīng)常采用替代病毒。目前,研究中常用的替代病毒種類繁多不利于梳理比較,且由于病毒之間結(jié)構(gòu)差異等原因,各項(xiàng)評價(jià)結(jié)果并不能真實(shí)反映對新冠病毒的富集效率。比如辣椒輕斑駁病毒(PMMoV)和MHV被廣泛作為新冠病毒的替代病毒,其回收率經(jīng)常被用于評估污水富集效率,但其與新冠病毒RNA衰減率不同。這表明其作為新冠病毒在環(huán)境中存活率的替代標(biāo)記物作用有限,而不同病毒的富集效率直接影響分析結(jié)果。Tanimoto等[38]對污水的原液、固體和PEG沉淀樣品中PMMoV和新冠病毒分別進(jìn)行分析。就PMMoV的RNA拷貝數(shù)和回收率而言,PEG沉淀部分明顯高于固體部分,但固體部分的新冠病毒RNA陽性率卻明顯高于PEG沉淀部分,許多最新研究也都證明了固相沉淀物對病毒,特別是對包膜病毒的吸附作用。高達(dá)26%的鼠肝炎病毒等包覆病毒存在于固相部分,而6%的MS2等未包覆病毒存在于廢水樣品中[19]。Kitamura等[28]發(fā)現(xiàn)在富集脊髓灰質(zhì)炎病毒中有效的負(fù)電膜濾法、PEG沉淀法和超濾法,回收樣品都來自于上清液,因此,對新冠病毒富集效率差強(qiáng)人意。用新冠病毒直接摻入更能代表新型冠狀病毒污水監(jiān)測中病毒富集方法的性能。然而,用于評價(jià)的加標(biāo)滅活病毒同樣不能完全反映新冠病毒在污水樣品中的實(shí)際行為,這可能影響病毒富集方法在實(shí)際應(yīng)用中的性能。

3.2 污水樣品的多變性

關(guān)于新冠病毒在污水中的存活時(shí)間、增殖和消亡規(guī)律等問題,相關(guān)研究還不夠深入。事實(shí)上,溫度、pH和拮抗微生物等環(huán)境因子不僅影響新冠病毒的存活,也會影響新冠病毒的檢測[39]。研究發(fā)現(xiàn),新冠病毒在污水中的衰減具有較強(qiáng)溫度依賴性,其結(jié)構(gòu)完整性差且衰減較快[40],長期儲存在4 ℃或冷凍下平均含量可下降60%[28]。當(dāng)pH值>6時(shí),RNA更容易發(fā)生堿性水解[41]。Kitamura等[28]認(rèn)為負(fù)電膜濾法中酸性環(huán)境可能會破壞包覆病毒的完整性,從而降低回收率。污水中存在環(huán)境PCR抑制劑,在富集、檢測過程中有可能導(dǎo)致抑制劑的共純化和富集,從而影響qPCR檢測。也有研究[17]表明,增加樣品體積并不能顯著提高檢測靈敏度,這可能是污水基質(zhì)干擾了病毒RNA的提取與檢測。目前許多研究并未考慮富集操作過程中污水基質(zhì)、污水體積、污水中目標(biāo)物濃度、富集環(huán)境條件等對富集效率的影響。事實(shí)上,不同污水樣品的富集效率在同樣富集方法下也存在較大變動(dòng),因此,需要不同采樣點(diǎn)的污水在選擇合適富集方法時(shí)需要重新考慮和評估。需要注意的是,由于污泥固體等對新冠病毒的吸附作用[28,32,42],在采用污水進(jìn)行疫情監(jiān)測時(shí),要特別注意污泥中病毒的檢測,但污泥中的蛋白質(zhì)、重金屬等各種有機(jī)物和無機(jī)物,可能造成病毒失活或者對病毒檢測造成基質(zhì)干擾,而且新冠病毒在污泥中的穩(wěn)定性尚未開展足夠的研究[18]。

3.3 RNA提取方法選擇

回收率是對富集效率評價(jià)的一項(xiàng)重要指標(biāo),而這與新冠病毒RNA提取方法和基因靶的選擇有著直接關(guān)聯(lián),如檢出率和Ct值的差異可能來自于不同試劑盒的提取效率。Zheng等[17]發(fā)現(xiàn),尤其是在處理相對無顆粒的樣品時(shí),研究中所用的兩種試劑盒病毒提取有著顯著差異。

3.4 硬件設(shè)備

一方面,新冠病毒極強(qiáng)的傳染性要求富集過程必須充分考慮安全性。一般地,直接處理新冠病毒樣本至少需要在生物安全二級實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下進(jìn)行,同時(shí)采用不低于生物安全三級實(shí)驗(yàn)室的個(gè)人防護(hù)。另一方面,污水中的低載量使得對其分析檢測限要求很高。一般而言,100 mL的污水足夠大多數(shù)腸道病毒檢測,但對于檢測新冠病毒往往需要200 mL以上,對于病例少的地區(qū)需要的污水量則更多。當(dāng)富集污水量不夠時(shí),會導(dǎo)致樣品低于分析檢測限[43],這在一定程度上限制了超濾法和超離心法等方法的應(yīng)用。

4 結(jié)論與展望

目前,研究工作者已開發(fā)了多種方法應(yīng)用于污水中新冠病毒的富集。相對而言,膜吸附脫附法和絮凝沉淀法成本低、耗時(shí)長,適用于大體積樣品初級富集;超速離心法和超濾法成本高、耗時(shí)短,適用于小體積樣品次級富集。通過優(yōu)化過濾膜種類尺寸、陽離子、絮沉劑、離心速度和截留分子量等可進(jìn)一步提高回收率等富集效果。

由于前期關(guān)于污水中新冠病毒富集的研究缺乏統(tǒng)一的實(shí)踐規(guī)范,存在不同富集方法處理后檢測結(jié)果不一致以及不同研究對富集方法效率的評價(jià)和解釋矛盾等情況。為此,應(yīng)組織有關(guān)權(quán)威部門和研究機(jī)構(gòu),建立統(tǒng)一的富集操作規(guī)范。例如,為解決基于污水分析的毒品濫用監(jiān)測技術(shù)中不同方法所得結(jié)果無法系統(tǒng)比較的問題,經(jīng)過近二十年發(fā)展,我國及歐盟等均建立了統(tǒng)一的操作規(guī)范,從而使該技術(shù)真正推向?qū)崙?zhàn)應(yīng)用。目前,國家衛(wèi)健委發(fā)布了《污水中新型冠狀病毒富集濃縮和核酸檢測方法標(biāo)準(zhǔn)》(WS/T 799—2022),有望首先將絮凝沉淀法與超濾法在污水中新冠病毒富集工作中推向?qū)嵱谩?/p>

不同的富集方法各有優(yōu)缺,在實(shí)際工作中,要結(jié)合各實(shí)驗(yàn)室和污水樣品的具體情況進(jìn)行選擇。另外,可將多種方法同時(shí)應(yīng)用于富集過程,充分發(fā)揮各富集方法的優(yōu)點(diǎn),從而保證試驗(yàn)更加高效、準(zhǔn)確。例如,將通過膜吸附脫附法進(jìn)行初級富集的污水樣品,用較大體積洗脫劑進(jìn)行洗脫后,再利用超速離心法進(jìn)行次級富集,可有效提高回收率,同時(shí)解決超速離心不適用于大體積污水樣品分析的問題。

除進(jìn)一步優(yōu)化富集方法之外,采用同位素內(nèi)標(biāo)、被動(dòng)采樣器、無需試劑盒的RNA提取方法、無需預(yù)處理的超快檢測方法、生物傳感器等也可以有效提高污水中新冠病毒的分析水平。