陳秀靈, 趙春穎, 李季生, 李忠思, 趙紅玲, 李 娜

(1.承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所,河北省高校特色蠶桑應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心, 河北 承德 067000;2.承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所-河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室, 河北 承德 067000)

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorigi)屬于唇形科黃芩屬多年生草本植物,根呈圓錐狀,莖叢生,分枝多而細,葉片披針形,為總狀無限花序,種子梯次成熟,成熟期長,具有耐旱、耐寒、不耐澇的生物學(xué)特性[1-2]。作為歷史悠久的中國秦嶺五大商藥之一,黃芩為常用大宗中藥材,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,主要以根入藥,主要分布于我國內(nèi)蒙古、河北、山西、山東、黑龍江及遼寧等省,河北承德為道地產(chǎn)區(qū),俗稱“熱河黃芩”[3-4]。黃芩的主要藥用成分為黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素等成分,在抗菌、消炎、抗腫瘤、抗氧化、止血安胎、瀉火解毒等方面具有重要功效[5-6]。黃芩已被廣泛應(yīng)用于臨床疾病的治療,約70%的清熱解毒中成藥及配方均含黃芩[6]。近年來,野生黃芩資源因過度采挖日趨減少,逐漸被人工引種栽培代替,但黃芩種子質(zhì)量良莠不齊,很難滿足規(guī)?；a(chǎn)[3,7]。而且,黃芩為短壽命種子,種子活力易喪失,導(dǎo)致種子萌發(fā)受阻、田間出苗率低及長勢弱等,不利于黃芩產(chǎn)業(yè)發(fā)展[8]。因此,研究如何提高黃芩種子萌發(fā)能力,對種苗培育以及陳種子的再利用具有重要的現(xiàn)實意義。

種子萌發(fā)是植物生命周期中的起始階段,萌發(fā)與植物的形態(tài)建成和成株狀態(tài)密切相關(guān)[9]。種子引發(fā)是在特定的條件下使其產(chǎn)生“引發(fā)記憶”的播前處理技術(shù),能夠改善種子的萌發(fā)潛力,提高種子發(fā)芽速度、出苗整齊度、幼苗健壯度以及植株抗逆性[10]。聚乙二醇(PEG)不僅可以作為評價種子抗旱能力的重要標志,也是較為理想的種子引發(fā)劑,通過滲透調(diào)節(jié)作用來延長種子吸水時間,以降低電導(dǎo)率和營養(yǎng)物質(zhì)滲漏,使細胞的修復(fù)能力增強,但本身不會滲入活細胞,對種子無毒害作用,從而提高種子活力和萌發(fā)能力[11-13]。研究表明,適宜的PEG濃度和分子量引發(fā)對茄子、大麥、高羊茅、甜菜、遠志、苜蓿等種子的發(fā)芽指標具有明顯的促進作用[13-18]。早期研究表明,PEG引發(fā)可能抑制商洛黃芩種子萌發(fā)[11],但適宜的黃芩種子PEG引發(fā)條件仍需要深入探討。本研究采用正交試驗設(shè)計,研究活力水平、PEG分子量、PEG浸種濃度和浸種時間對黃芩種子萌發(fā)的影響,為以PEG作為引發(fā)劑促進黃芩種子萌發(fā)提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃芩種子為2021年10月采集于承德醫(yī)學(xué)院中藥材種植實驗基地,收獲種子含水量為6.34%,種子初始發(fā)芽率水平為60.48%。PEG試劑購自于北京索萊寶科技有限公司,分析純試劑AR級。分別用蒸餾水配制3種分子量(600,2 000和6 000)的不同濃度(5%,10%,20%;質(zhì)量/體積分數(shù))PEG浸種液,備用。

1.2 試驗方法

1.2.1種子老化

種子置于人工加速老化箱,采用高溫(40 ℃)、高濕(相對濕度80%)處理獲得在活力水平上具有差異的種子。老化1 d和2 d后,分別取出測定,種子發(fā)芽率為41.93%和37.49%。

1.2.2種子引發(fā)

采用L9(34)正交實驗優(yōu)化種子引發(fā)處理方案,試驗因素與水平見表1。

表1 PEG處理黃芩種子實驗因素與水平

稱取約0.5 g黃芩種子,裝入對應(yīng)編號的尼龍網(wǎng)袋,將網(wǎng)袋放入種子發(fā)芽盒中,用移液器分別量取80 mL不同濃度的PEG浸種液加入到發(fā)芽盒中,以三種活力水平的未浸種處理的種子作為對照,分別記為ck1、ck2、ck3。將密封的發(fā)芽盒置于室溫(25 ℃)黑暗條件下進行浸種,浸種結(jié)束后用蒸餾水沖洗網(wǎng)袋3次,吸水紙吸干表面水分,將種子置于25 ℃、80%相對濕度條件下平衡約5 h。

1.3 指標測定

1.3.1發(fā)芽指標

將處理后的種子放入鋪有2層濾紙且對應(yīng)編號的發(fā)芽盒中,加入12 mL蒸餾水,每盒50粒黃芩種子,置于人工氣候箱中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度設(shè)為25 ℃(晝/夜),相對濕度為80%,光照12 h/d,光照強度為2 000 lx。 每個處理4個重復(fù),每天記錄種子發(fā)芽數(shù),培養(yǎng)至第7天結(jié)束。發(fā)芽標準按照國際種子協(xié)會(ISTA)規(guī)定,有明顯的胚根“露白”且胚根長度為種子的1/2認定為發(fā)芽[19]。以發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)作為萌發(fā)測試分析指標[13,19-20]。

發(fā)芽率/%=(發(fā)芽終期全部正常發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù))×100%,以第7天種子發(fā)芽數(shù)計算;

發(fā)芽勢/%=(規(guī)定時期內(nèi)正常發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù))×100%,以第4天種子發(fā)芽數(shù)計算;

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(每日種子發(fā)芽數(shù)/相應(yīng)種子發(fā)芽天數(shù));

活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×平均根苗干重,干重為將7 d后幼苗放入70 ℃恒溫箱烘干48 h后稱重。

1.3.2生理指標

選擇每個活力水平上種子引發(fā)處理效果相對較好的組合以及相應(yīng)的未引發(fā)種子,吸干引發(fā)種子表面水分,液氮速凍,置于-80 ℃的冰箱保存,用于測定生理指標?？扇苄蕴呛坎捎幂焱壬y定,丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測定,總淀粉酶活力采用3,5-二硝基水楊酸顯色試劑盒測定,活性氧含量采用熒光探針檢測試劑盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)測定,總抗氧化能力采用亞鐵還原微板法試劑盒測定。活性氧檢測試劑盒購自上海酶科生物科技有限公司,其余試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對4個測試指標進行極差分析、方差分析和多重比較。處理間平均數(shù)差異顯著性比較采用Duncan’s新復(fù)極差法,所有數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG引發(fā)對人工老化黃芩種子發(fā)芽率的影響

4因素的極差大小順序為RC>RB>RA>RD,表明其對發(fā)芽率影響作用為浸種時間>浸種濃度>PEG分子量>種子活力(表2)。根據(jù)4因素均值最優(yōu)組合為A1B2C1D1,即PEG分子量為600,浸種濃度為10%,浸種時間為8 h,種子活力為60.48%(表2)。方差分析結(jié)果表明, PEG分子量、浸種濃度和種子活力均對發(fā)芽率的影響差異達到顯著水平(p<0.05),浸種時間對發(fā)芽率的影響差異達到極顯著水平(p<0.01)(表4)。進一步的多重比較顯示,PEG分子量(A)的高低順序為A1>A2>A3,A1顯著高于A3,即在PEG分子量為600時,發(fā)芽率最高,其次為2000;浸種濃度(B)的高低順序為B2>B3>B1,B2和B3顯著高于B1,即在PEG浸種濃度為10%時,發(fā)芽率最高,其次為20%;浸種時間(C)的高低順序為C1>C2>C3,三水平間存在顯著差異,即浸種時間為8 h時,發(fā)芽率最高;種子活力(D)的高低順序為D1>D3>D2,D1顯著高于D2和D3,即當種子處于60.48%的活力水平時,發(fā)芽率最高(表4)。與對照相比,當種子活力為D1水平時,僅A1B1C1D1組合對發(fā)芽率具有顯著的促進作用,促進程度為15.86%;當種子活力為D2水平時, A1B2C2D2和A2B3C1D2組合對發(fā)芽率具有促進作用,促進程度分別為55.28%和62.03%;當種子活力為D3水平時,三種組合均對發(fā)芽率具有促進作用,促進程度為34.92%～69.49%,A3B2C1D3組合的促進程度最高(表3)。

表2 PEG處理下三因子的黃芩種子極差分析結(jié)果

表3 PEG處理對黃芩種子萌發(fā)狀況的影響

表4 黃芩種子萌發(fā)方差分析及多重比較

2.2 PEG引發(fā)對人工老化黃芩種子發(fā)芽勢的影響

4因素對發(fā)芽勢的極差順序為RA>RC>RD>RB,表明其對發(fā)芽率影響作用為PEG分子量>浸種時間>種子活力>浸種濃度(表2)。根據(jù)4因素均值最優(yōu)組合為A1B3C1D1,即PEG分子量為600,浸種濃度為20%,浸種時間為8 h,種子活力為60.48%(表2)。方差分析結(jié)果表明:PEG浸種濃度和種子活力水平對發(fā)芽勢的影響差異達到顯著性水平(p<0.05),浸種時間對發(fā)芽勢的影響差異達到極顯著水平(p<0.01)(表4)。進一步的多重比較結(jié)果顯示,B2和B3顯著高于B1,即在浸種濃度為20%和10%時,發(fā)芽勢最高;浸種時間因素的三水平間存在顯著差異,且C1水平最高,即在浸種時間為8 h時,發(fā)芽勢較高;種子活力水平為D1時,發(fā)芽勢最高,顯著高于D2和D3(表4)。與對照相比,當種子活力為D1水平時,僅A1B1C1D1組合對發(fā)芽勢具有顯著的促進作用,促進程度為17.15%;當種子活力為D2水平時,A1B2C2D2和A2B3C1D2組合對發(fā)芽勢具有促進作用,促進程度分別為102.32%和132.57%;當種子活力為D3水平時,三種組合均對發(fā)芽勢具有促進作用,促進程度為103.95%～153.47%,A3B2C1D3組合的促進程度最高(表3)。

2.3 PEG引發(fā)對人工老化黃芩種子發(fā)芽指數(shù)的影響

4因素對發(fā)芽指數(shù)的極差順序為RC>RD>RB>RA,表明其對發(fā)芽指數(shù)影響作用為浸種時間>種子活力>浸種濃度>PEG分子量(表2)。根據(jù)4因素均值最優(yōu)組合為A1B2C1D1,即PEG分子量為600,浸種濃度為10%,浸種時間為8 h,種子活力為60.48%(表2)。方差分析結(jié)果表明:浸種濃度對發(fā)芽指數(shù)的影響差異達顯著水平(p<0.05),浸種時間和種子活力水平對發(fā)芽指數(shù)的影響差異達極顯著水平(p<0.01)(表4)。進一步的多重比較結(jié)果顯示:浸種濃度(B)中B2顯著高于B1,而B3與B2和B1間無顯著差異,即浸種濃度為10%的發(fā)芽指數(shù)最高;浸種時間(C)中C1和C2顯著高于C3,C1和C2之間無顯著差異,即浸種時間為8 h的發(fā)芽指數(shù)最高,浸種24 h次之;種子活力(D)中D1顯著高于D2和D3,而D2和D3之間無顯著差異,即種子活力水平為60.48%時,發(fā)芽指數(shù)最高(表4)。與對照相比,當種子活力為D1水平時,三種組合對發(fā)芽指數(shù)的促進程度為41.12%～88.24%,A1B1C1D1和A3B3C2D1組合的促進程度相對較高;當種子活力為D2水平時,三種組合對發(fā)芽指數(shù)的促進程度為99.53%～342.84%;A1B2C2D2和A2B3C1D2組合對發(fā)芽指數(shù)促進程度較高;當種子活力為D3水平時,三種組合對發(fā)芽指數(shù)的促進程度為177.04%～332.45%,A3B2C1D3組合的促進程度最高(表3)。

2.4 PEG引發(fā)對人工老化黃芩種子活力指數(shù)的影響

4因素對活力指數(shù)的極差順序為RC>RA>RB>RD,表明其對發(fā)芽指數(shù)影響作用為浸種時間>PEG分子量>浸種濃度>種子活力(表2)。根據(jù)4因素均值最優(yōu)組合為A3B1C2D3,即PEG分子量為6000,浸種濃度為5%,浸種時間為24 h,種子活力為37.49%(表1)。方差分析結(jié)果表明,浸種時間對活力指數(shù)的影響差異達顯著水平(p<0.05),而PEG分子量、浸種濃度和種子活力水平對活力指數(shù)的影響差異均未達顯著水平(表4)。進一步的多重比較結(jié)果顯示:浸種時間(C)中C2顯著高于C1和C3,而C1和C3之間無顯著差異,即浸種時間為24 h的活力指數(shù)最高(表4)。與對照相比,當種子活力為D1水平時,三種組合對活力指數(shù)的促進程度為71.78%～145.78%,A3B3C2D1組合的促進程度相對較高;當種子活力為D2水平時,三種組合對活力指數(shù)的促進程度為108.36%～132.40%,A3B1C3D2和A1B2C2D2組合對發(fā)芽指數(shù)促進程度較高;當種子活力為D3水平時,三種組合對活力指數(shù)的促進程度為86.01%～270.09%,A2B1C2D3組合的促進程度最高(表3)。

2.5 PEG引發(fā)對黃芩種子活性氧積累的影響

為進一步探究PEG引發(fā)處理對黃芩種子生理的影響,選擇了6個引發(fā)效果相對較好的處理組合進行比較分析。活性氧積累在引發(fā)處理組間差異達顯著水平,當種子生活力水平為D1時,A1B1C1D1、A1B1C2D1分別較對照降低了20.30%和5.02%,但A1B2C1D1、A1B2C2D1分別較對照增加了7.91%和17.26%,且A1B1C1D1活性氧含量最低;生活力為D2和D3的黃芩種子引發(fā)處理(A1B2C2D2和A1B2C2D3)后,活性氧仍處于非常高的水平,且無顯著差異(圖1A)。相對于未引發(fā)處理,PEG引發(fā)處理能夠降低丙二醛含量,當種子生活力為D1水平時,A1B1C1D1、A1B1C2D1和A1B2C2D1分別較對照降低了16.32%,5.79%和24.83%,A1B2C1D1較對照增加了3.80%;人工老化導(dǎo)致D2和D3生活力水平的黃芩種子丙二醛含量急劇升高,A1B2C2D2和A1B2C2D3引發(fā)處理后,丙二醛含量分別降低了54.43%和41.82%(圖1B)?？偪寡趸芰υ诓煌盍λ介g的PEG引發(fā)結(jié)果變化不一致,當種子生活力水平為D1時,總抗氧化能力呈增加和不變的趨勢,A1B1C1D1、A1B2C2D1、A1B1C2D1和A1B2C2D1分別較對照增加了6.77%,26.56%,11.45%和0.80%;當種子生活力下降至D2和D3時,總抗氧化能力被提高,但A1B2C2D2和A1B2C2D3引發(fā)處理后,相對于未引發(fā)處理,其值出現(xiàn)輕微下降(圖1C)。

注:1～6分別表示黃芩種子引發(fā)處理為A1B1C1D1、A1B2C1D1、A1B1C2D1、A1B2C2D1、A1B2C2D2和A1B2C2D3,7～9分別表示未引發(fā)生活力水平為D1、D2和D3的對照種子。圖1 PEG引發(fā)適宜處理對黃芩種子活性氧、丙二醛、總抗氧化能力、可溶性糖和總淀粉酶的影響

2.6 PEG引發(fā)對黃芩種子可溶性糖和淀粉酶活力的影響

相對于未引發(fā)處理,PEG引發(fā)處理顯著地降低了可溶性糖含量,在種子生活力水平為D1時,A1B1C1D1、A1B2C2D1、A1B1C2D1和A1B2C2D1分別較對照降低了42.19%,40.17%,56.89%和54.80%;在黃芩種子生活力下降至D2和D3水平時,可溶性糖含量出現(xiàn)輕微下降,A1B2C2D2和A1B2C2D3引發(fā)后,可溶性糖含量進一步下降,下降幅度分別達53.78%和56.49%(圖1D)。可溶性糖含量的下降,可能是因為PEG引發(fā)處理促進了糖代謝。在生活力水平為D1時,相對于未引發(fā)處理,PEG引發(fā)處理導(dǎo)致總淀粉酶活力顯著增加,A1B1C1D1、A1B2C2D1、A1B1C2D1和A1B2C2D1分別較對照增加了14.39%,13.85%,13.59%和14.55%;人工老化使D2和D3水平種子的總淀粉酶活力增加,但A1B2C2D2和A1B2C2D3引發(fā)后造成了總淀粉酶活力不同程度的下降,下降幅度分別為3.97%和11.26%(圖1E)。

3 討論與結(jié)論

種子萌發(fā)期屬于植物生長史的關(guān)鍵階段,極易受外界環(huán)境條件影響,屬于比較敏感的時期,決定了田間出苗率高低與整齊度[21]。種子類型、貯藏條件等因素影響了種子老化速率,導(dǎo)致種子活力水平出現(xiàn)了不同程度的下降,誘發(fā)DNA損傷、氧化脅迫及活性氧積累等一系列生理變化,直接影響了種子萌發(fā)狀況[22]。適宜的引發(fā)劑能夠改善種子活力,促進種子萌發(fā)[23]。種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)是衡量種子質(zhì)量的重要指標,能夠有效地反映種子的萌發(fā)能力。

PEG引發(fā)通過調(diào)節(jié)溶液水勢,影響種子的吸水速率,使種子萌發(fā)所需物質(zhì)和能量提前啟動,降低了吸脹傷害事件的發(fā)生,促進種子萌發(fā)[23-25]。PEG處理對種子萌發(fā)的影響與種子類型、種子活力、PEG分子量、浸種濃度、浸種時間等多種因素有關(guān)[13,16,18,26]。種子引發(fā)的PEG分子量主要為6000和8000,如李衛(wèi)芬等[12]利用PEG-6000引發(fā)陳年野菜種子,表明濃度為15%～30%的PEG處理能顯著提高藿香、羅勒、板藍根等的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)等;辛秋宇等[27]研究發(fā)現(xiàn),濃度為15%的PEG-8000浸種顯著提高了谷子種子的活力水平。適宜的PEG濃度因種子老化程度存在差異,安衍茹等[16]研究表明,20%的PEG-6000溶液引發(fā)能促進人工加速老化36 h(種子活力:24.44%)遠志幼苗株高、根長、地上部分生物量和地下部分生物量的增加,而人工老化48 h的種子引發(fā)效果減弱;類似的研究結(jié)果也在甜菜中被報道[28]。在本研究中,相對于未經(jīng)人工老化的黃芩種子,老化24 h和48 h黃芩種子的引發(fā)效果明顯減弱。適宜的引發(fā)時間因PEG濃度高低也存在差異,如在甜菜的研究中,60%的PEG-6000浸種24 h、40%PEG-6000浸種72 h對種子萌發(fā)的促進作用最大[17];在紫花苜蓿中,10%的PEG-6000溶液引發(fā)24 h能夠顯著提高種子發(fā)芽速度[18];PEG濃度為13.33%,引發(fā)時間為24.57 h時,玉米種子的萌發(fā)效果最好[29]。

為了全面評價PEG引發(fā)對黃芩種子萌發(fā)的影響,本試驗研究了不同PEG分子量、浸種濃度、浸種時間以及種子生活力對黃芩種子引發(fā)的影響。結(jié)果表明,PEG浸種時間對種子萌發(fā)影響更大,其次為種子生活力和浸種濃度,PEG分子量影響程度最小。PEG浸種時間為8 h的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)獲得了最大程度的提高,但活力指數(shù)卻在浸種24 h獲得了最大值,推測適宜的浸種時間可能在8～24 h之間;浸種濃度和種子生活力均對引發(fā)處理發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)的影響差異達到顯著水平,且分別在浸種濃度為10%和種子生活力為60.48%時獲得最強的引發(fā)促進作用;PEG分子量僅對發(fā)芽率的影響差異達到顯著水平,且低分子量(600)和中分子量(2000)PEG對發(fā)芽率的促進作用最大。這與李小玲等[10]、華智銳和李小玲[11]得出PEG抑制黃芩種子萌發(fā)的結(jié)果相反,這可能是因為黃芩種質(zhì)不同所致。PEG引發(fā)處理后,對膜系統(tǒng)損傷具有一定的修復(fù)作用,可以改善種子生活力,但隨著種子老化程度的加深,生物體的修復(fù)作用被削弱。從四種發(fā)芽指標促進程度來看,D1(60.48%)生活力水平下的黃芩種子,組合A1B1C1的引發(fā)效果相對更好。根據(jù)活性氧積累、丙二醛含量、總抗氧化能力、可溶性糖含量以及總淀粉酶活力等生理指標的變化,組合A1B1C1D1相對更能有效地避免ROS過量積累,防止細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化,抑制MDA的產(chǎn)生,維持相對較高的總抗氧化能力水平,促進糖代謝和淀粉水解,從而為種子萌發(fā)提供能量[30-31]。

綜合上述結(jié)果,可將PEG引發(fā)處理技術(shù)應(yīng)用于黃芩種子,對提高種子萌發(fā)能力、增強抗逆性能等方面具有重要的應(yīng)用價值。