潘秀麗，邵長春，李 赟，許曉輝，王小喬，張虹艷

（蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院，甘肅 蘭州 730050）

防曬劑是指利用光的吸收、反射或散射作用，以保護皮膚免受特定紫外線所帶來的傷害或保護產(chǎn)品本身而在化妝品中加入的物質(zhì).它能吸收紫外線中可引起人產(chǎn)生急性皮炎（紅斑）及皮膚灼傷的波長為280～320 nm 的中波紫外線（即UVB），以及可使皮膚變黑的320～400 nm 的長波紫外線（即UVA）.隨著人們生活水平的提高，消費者對化妝品的需求不斷增加[1].作為特殊類化妝品，防曬類化妝品中含有的各類防曬劑對人體的安全性和環(huán)境的危害性并不相同，因此，一直以來國內(nèi)外對防曬劑的使用種類和使用量有嚴格的管理和限制[2-3].

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版）列出的化學防曬劑的檢測方法為高效液相色譜法，但檢測費時費力，可操作性欠佳.經(jīng)查閱文獻，目前化妝品中防曬劑的檢測方法有氣相色譜法[4]、高效液相色譜法[5-11]、靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法[12]、氣相色譜-質(zhì)譜法[13]和液相色譜-質(zhì)譜法[14-15]等.液相色譜-質(zhì)譜法靈敏度高，不用保留時間定性，一針混標就可以檢測出目標物，從而實現(xiàn)對其定性和定量，檢驗效率高，是目前檢驗中比較高效的一種檢測方法.本試驗采用三重四極桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，對文獻中液相色譜-質(zhì)譜法中的防曬劑項目和質(zhì)譜參數(shù)以及樣品前處理做了一個補充，開發(fā)出15 種防曬劑的高通量樣品前處理方法和儀器分析方法.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜/三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent 1260+6460，安捷倫科技有限公司；千分之一天平：MS105DU，十萬分之一天平：XSE205DU，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；離心機：H1850，湖南湘儀實驗室開發(fā)有限公司；智能恒溫槽：SCG-6，寧波新芝生物科技股份有限公司；IKA 振蕩器：VXR，艾卡（廣州）儀器設備有限公司；QuEChERS 試劑盒：5982-1010、G7750-10001，安捷倫科技有限公司；HLB 柱：HLB 6cc（500 mg），沃特世科技（上海）有限公司（Waters）；MCX 柱：Oasis MCX 6cc（150 mg），沃特世科技（上海）有限公司（Waters）；FaAEx-AD-001 kits 柱：巨研科技股份有限公司.

甲酸（色譜純），東京化成工業(yè)株式會社；甲醇（色譜純），乙腈（色譜純），默克股份兩合公司；乙酸銨（優(yōu)級純），天津市凱信化學工業(yè)有限公司.

對照品：奧克立林（批號：752831；純度：98.7%）、苯基苯并咪唑磺酸（批號：C15894540；純度：93.3%）、對氨基苯甲酸異辛酯（PABA 乙基己酯）（批號：458726；純度：100%）、丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷（批號：1124793；純度：99.1%）、2-羥基-4-甲氧基二苯甲酮（批號：G1013005；純度：100%）、3-亞芐基樟腦（批號：CCHM700478；純度：96.0%），以上對照品生產(chǎn)單位為Dr.Ehrenstorfer 公司；二乙胺基羥苯甲?；郊姿峒乎ィㄅ枺篏139993；純度：99.4%）、胡莫柳酯（批號：G164621；純度：98.8%）、二苯酮-3（批號：14971-01；純度：100%）生產(chǎn)單位為Accustandard；甲酚曲唑三硅氧烷（批號：D679410；純度：97.3%），生產(chǎn)單位為Toronto Research Chemicals；亞芐基樟腦磺酸（批號：97085；純度：97.0%）生產(chǎn)單位為SIGMA-ALORICH；對氨基苯甲酸（批號：100017-201704；純度：99.8%）、4-甲基芐亞基樟腦（批號：800110-202001；純度：98.4%）生產(chǎn)單位為中國食品藥品檢定研究院；對甲氧基肉桂酸異戊酯（批號：GOL414；純度：96.9%）生產(chǎn)單位為美國藥典USP；甲氧基肉桂酸乙基己酯（批號：S102885；純度：99.8%）生產(chǎn)單位為阿爾塔科技有限公司.15 種防曬劑化合物信息如表1 所列.

表1 15 種防曬劑化合物信息Table 1 Informations of 15 sunscreen compounds

樣品：試驗中所用樣品均從西太華、蘭州中心、屈臣氏購買，包含美素、鎧麗、新碧、佰草集、歐詩漫、花印、露得清、理膚泉、春瑩等品牌.

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

Agilent C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流動相A 為含0.1%甲酸的2 mmol/L 乙酸銨溶液，流動相B 為含0.1%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脫；柱溫35℃；進樣量2 μL；流速0.2 mL/min.梯度洗脫程序如表2 所列.

表2 高效液相色譜流動相條件Table 2 Mobile phase conditions of high performance liquid chromatography

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧（ESI）離子源；掃描模式：正離子模式；檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）；干燥氣溫度：325 ℃；干燥氣流速：6 L/min；噴霧電壓：45 psi（1 psi=6.895 kPa）；鞘氣溫度：400 ℃；鞘氣流速：12 L/min；毛細管電壓：4 000 V.其他參數(shù)如表3 所列.

表3 15 種防曬劑的質(zhì)譜條件Table 3 Mass spectrometer conditions of 15 sunscreens

1.2.3 樣品前處理

準確稱取樣品1.0 g（精確到0.001 g）于10 mL具塞離心管中，加入1 mL 無水乙醇，渦旋1 min，用乙腈∶水（體積比為4∶1）定容至刻度，加入QuEChERS 鹽包一包，混勻，40 ℃下超聲振蕩30 min，在0 ℃下于3 900 r/min 離心10 min.吸取離心好的樣品溶液3 mL 于QuEChERS 凈化管中，渦旋2 min，在0 ℃下10 000 r/min 離心10 min.如要稀釋，取上清液，用乙腈∶水（體積比4∶1）進行適當稀釋，經(jīng)0.22 μm 有機濾膜過濾后作為待測溶液.

1.2.4 標準溶液配制

準確稱取固體對照品各10 mg，置于10 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的標準儲備液.其中苯基苯并咪唑磺酸標準溶液在加入定容溶劑前，預先加入少量無水乙醇使其溶解，再用乙腈定容至刻度，配制成l mg/mL 的標準儲備液.精密吸取上述各溶液適量，置于容量瓶中用乙腈稀釋，配制成胡莫柳酯和亞芐基樟腦磺酸質(zhì)量濃度為2 μg/mL，其余成分質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的混合標準溶液，于?18 ℃冷凍條件下保存?zhèn)溆?系列標準溶液的配制：取混合標準溶液配制成胡莫柳酯和亞芐基樟腦磺酸質(zhì)量濃度分別為10、20、40、80、120、200、400 ng/mL，其余成分質(zhì)量濃度分別為5、10、20、40 、60、100、200 ng/mL的15 種紫外吸收劑的標準系列溶液，混勻后，經(jīng)0.22 μm 有機濾膜過濾，備用.

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

化妝品規(guī)范中使用的提取液是四氫呋喃、高氯酸、甲醇、水.其中，四氫呋喃和高氯酸屬于高毒、強刺激性氣味的試劑，對身體危害極大，同時四氫呋喃和高氯酸對管路和質(zhì)譜的損害較大，在質(zhì)譜檢測中是盡量避免使用的.因此優(yōu)先選擇甲醇和乙腈作為提取溶劑，但直接用甲醇和乙腈提取，樣品溶解不理想，懸浮物較多.加入1 mL 水，渦旋1 min，再分別用甲醇和乙腈進行提取比較，發(fā)現(xiàn)防曬劑的提取效果大大增加，而乙腈對丁基甲氧基二苯甲?；淄楹蛫W克立林的提取率更好，最后選擇用乙腈-水（體積比為4∶1）溶解，為了提高苯基苯并咪唑磺酸的回收率，在樣品中先加入1mL 無水乙醇，再用乙腈-水（體積比為4∶1）定容至刻度.

2.2 提取液凈化的選擇

選擇QuEChERS 柱、HLB 柱、MCX 柱、FaAEx-AD-001 kits 柱對樣品進行凈化比較，回收率較高的為QuEChERS 柱，但是凈化效果不太好，增加離心步驟后，雜質(zhì)沉淀，待測液澄清，經(jīng)上機檢測，柱壓穩(wěn)定，回收率較高，能滿足質(zhì)譜檢測要求.使用4 種凈化柱凈化樣品的色譜圖如圖1 所示.

圖1 4 種凈化柱處理的樣品色譜圖（a）QuEChERS 柱，（b）HLB 柱，（c）MCX 柱，（d）FaAEx-AD-001 kitsFig.1 Chromatograms of samples treated with 4 kinds of purification columns

2.3 離心條件的選擇

選擇冷凍離心機，在0、5、10、25 ℃離心溫度下，轉(zhuǎn)速分別為3 900、6 000、8 000、10 000 r/min，分別離心5、10、15 min，發(fā)現(xiàn)在0 ℃、10 000 r/min條件下，離心效果最好，這是因為樣品乳液密度較小，溫度越低，轉(zhuǎn)速越快，樣品雜質(zhì)沉淀越好.離心時間為10 和15 min 時質(zhì)譜圖雜質(zhì)峰相當，故選擇0 ℃、10 000 r/min、離心10 min 作為離心條件.

2.4 流動相選擇

首先使用乙腈-水和甲醇-水進行色譜比對，結(jié)果表明：使用乙腈-水在梯度洗脫中柱壓更低，目標物保留時間更短，分離效果好，同時對泵也有較好的保護作用.其次由于15 種目標物使用的是正離子掃描模式，酸性環(huán)境更有利于目標物的質(zhì)譜響應，故可以在流動相中添加甲酸或乙酸，由于甲酸比乙酸具有更好的揮發(fā)性，故選擇甲酸作為流動相的調(diào)節(jié)劑.比較乙腈-水和乙腈（0.1%甲酸）-水（0.1%甲酸）兩種流動相，結(jié)果表明：乙腈（0.1%甲酸）-水（0.1%甲酸）為流動相其目標物的響應值較好，但是二苯酮-3 和PABA 乙基己酯的峰形較寬，有拖尾.比較乙腈（0.1%甲酸）-2 mmol/L 的乙酸銨水溶液（0.1%甲酸）和乙腈（0.1%甲酸）-水（0.1%甲酸），發(fā)現(xiàn)添加乙酸銨后兩種成分的峰形有了明顯的改善.故選擇乙腈（0.1%甲酸）-2 mmol/L 的乙酸銨水溶液（0.1%甲酸）作為流動相.

2.5 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用負離子掃描模式進行SCAN 全掃描，部分目標物找不到離子對，對于找到離子對的目標物進行MRM 檢測，響應值很低，達不到檢測的需求.采用正離子掃描模式進行SCAN 全掃描，能找到母離子，通過product ion 掃描方式可以找到2種以上定量定性離子對，選用正離子模式來對15種目標物的母離子、子離子、碰撞電壓和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化，使碎片離子的響應度達到最大，從而確定最優(yōu)的質(zhì)譜條件，15 種防曬劑的定性（黑色）、定量（藍色）離子對色譜圖如圖2所示.

圖2 15 種防曬劑的MRM 圖譜Fig.2 MRM spectra of 15 sunscreens（a）OC，（b）PBSA，（c）EHDP，（d）BMDM，（e）4-MBC，（f）IMC，（g）PABA，（h）BP3，（i）BEC，（j）BZ3，（k）DHHB，（l）HMS，（m）DTT，（n）BCSA，（o）EHMC

2.6 各防曬劑的線性關(guān)系和檢出限

將各成分配制成系列標準溶液，繪制一系列標準曲線，相關(guān)系數(shù)（R2）不小于0.99 時認為線性關(guān)系良好.配制一定質(zhì)量濃度的標準溶液確定檢出限，當檢測結(jié)果為3 倍信噪比時確定為檢出限.各成分標準曲線和檢出限結(jié)果如表4 所列.試驗表明，HMS 和EHMC 在10～400 ng/mL、其余防曬劑在5～200 ng/mL 范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，R2均大于0.99，檢出限均不小于10 μg/kg，滿足試驗要求.

表4 15 種防曬劑的標準曲線和檢出限Table 4 Standard curves and limits of detection of 15 sunscreens

2.7 各防曬劑成分的回收率試驗

稱取一定量的空白樣品，加入混合標準溶液，配制成HMS 和BCSA 加入量分別為60、120、240 ng/mL，其余防曬劑成分加入量分別為30、60、120 ng/mL 的3 個濃度水平，每個水平作3 個平行樣，以平均值計算回收率.結(jié)果如表5 所列.15 種防曬劑在不同水平下的回收率為68.4%～84.2%，相對標準偏差（RSD）為1.7%～9.0%，符合試驗對回收率和精密度的要求.

表5 15 種防曬劑的回收率及相對標準偏差Table 5 Recoveries and relative standard deviations of 15 sunscreens

3 結(jié)論

本研究使用QuEChERS 前處理技術(shù)結(jié)合高效液相色譜/三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，測定防曬類化妝品中奧克立林、苯基苯并咪唑磺酸等15 種防曬劑，可在15 min 內(nèi)完成對防曬劑的分離測定，所選用的提取試劑替代了傳統(tǒng)毒性較大的四氫呋喃和高氯酸.該方法前處理簡單，回收率高，QuEChERS 柱凈化能滿足質(zhì)譜對樣品的要求，適用于化妝品中15種防曬劑的定性定量分析，能滿足市場監(jiān)管部門對防曬類化妝品的監(jiān)督要求.