劉少斐,許冰冰

(1.北京四中國(guó)際課程佳蓮校區(qū),北京 102202;2.北京大學(xué)第三醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所膝關(guān)節(jié)外科,北京 100083)

關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細(xì)胞、軟骨前體細(xì)胞、Ⅱ型膠原纖維和蛋白聚糖等組成,是關(guān)節(jié)腔內(nèi)覆蓋在滑膜上直接接觸關(guān)節(jié)骨端的一種透明軟骨[1]。關(guān)節(jié)軟骨本身缺乏血管、淋巴和神經(jīng),自身修復(fù)能力有限,外界創(chuàng)傷、關(guān)節(jié)損傷或是其他疾病導(dǎo)致的軟骨損傷一般無(wú)法自行痊愈,因此,需要對(duì)損傷的軟骨進(jìn)行及時(shí)治療。常見的治療方法根據(jù)軟骨的退變程度可分為三類:姑息治療、修復(fù)治療和再生治療[2-4]。

近年來(lái),干細(xì)胞治療為軟骨損傷的修復(fù)提供了一種具有前景的治療策略,治療的關(guān)鍵就是要保證軟骨細(xì)胞的正常分化或誘導(dǎo)分化[5]。干細(xì)胞是指具有自我復(fù)制和多向分化潛能的原始細(xì)胞,在一定條件下,它們可以在體內(nèi)分化成多種成體細(xì)胞[6]。干細(xì)胞治療主要是指將干細(xì)胞輸送到身體的特定部位,以期修復(fù)病灶或受損的組織。近年來(lái),許多臨床實(shí)驗(yàn)證明,利用干細(xì)胞的自我更新和軟骨分化能力,可以有效的治療軟骨損傷[7-8]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞( bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)作為傳統(tǒng)干細(xì)胞的一種,由于其取材簡(jiǎn)單、增殖能力強(qiáng)、引起免疫應(yīng)答能力弱、分泌生長(zhǎng)因子(如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等)以及自我更新能力強(qiáng)等特點(diǎn),能夠通過體外培養(yǎng)、擴(kuò)增獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞,從而廣泛的應(yīng)用在軟骨修復(fù)治療中[7-8]。

因此,本文就近年來(lái)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提取方法、表面鑒定、多向分化能力及其在軟骨修復(fù)中的應(yīng)用進(jìn)行闡述,并對(duì)其未來(lái)的應(yīng)用進(jìn)行展望。

1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種長(zhǎng)梭形的非造血細(xì)胞,主要來(lái)源于中胚層,在特定的分化條件下,可以分化成不同的組織(如骨骼、軟骨、脂肪等)[9-10]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞主要取自骨髓,根據(jù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物特性,可以采用骨髓貼壁培養(yǎng)法、密度梯度離心法和流式細(xì)胞儀器進(jìn)行分選,下面對(duì)每種方法進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹。

(1)骨髓貼壁培養(yǎng)法

主要是根據(jù)細(xì)胞的貼壁性進(jìn)行區(qū)分,通過固定時(shí)間間隔更換培養(yǎng)基來(lái)去除不貼壁的細(xì)胞,主要包括血細(xì)胞(如紅細(xì)胞、白細(xì)胞、造血細(xì)胞等)。骨髓貼壁培養(yǎng)法具有操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等優(yōu)點(diǎn),但是該方法獲得的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成分比較復(fù)雜、純度較低。

(2)密度梯度離心法

主要是根據(jù)細(xì)胞的大小和密度進(jìn)行分選。該方法先用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)等體積稀釋骨髓血,再將稀釋后的骨髓血與等體積的 Ficoll 淋巴分離液通過梯度離心(3000 r/min,15 min)獲得不同類型的沉淀液。不同細(xì)胞根據(jù)其密度的差異分布在不同的高度上,紅細(xì)胞以及多核細(xì)胞位于最底層(1.08 g/mL),淋巴細(xì)胞分離液(1.08 g/mL)位于倒數(shù)第二層,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞等單核細(xì)胞位于第二層(1.05~1.08 g/mL),而血漿及其溶解物處于最高層(1.05 g/mL)[11]。第二層為單核細(xì)胞層,該層細(xì)胞在顏色和形狀上呈現(xiàn)出灰白色云霧狀,在實(shí)際分離過程中,可根據(jù)操作的熟練程度,直接吸取第二層;或先去除第一層,再吸取第二層。將吸取的白色云霧狀液體,用PBS 洗滌后,倒入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。通過骨髓貼壁培養(yǎng)法,進(jìn)一步分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。目前,由于梯度離心法為非破壞性分析,且操作簡(jiǎn)單性、可擴(kuò)展性強(qiáng),從而廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室高純度BMSCs 的分離。

(3)流式細(xì)胞儀器分選

主要是根據(jù)不同細(xì)胞的表面標(biāo)志物進(jìn)行分選。利用電場(chǎng)的作用力分離細(xì)胞,通過標(biāo)記多個(gè)表面標(biāo)志物甚至是細(xì)胞內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別。盡管這種方法獲得的BMSCs 純度更高,但分選時(shí)間長(zhǎng)、效率低,因此,在臨床實(shí)驗(yàn)中該方法未得到普及。

2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化能力

提取純化后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,需要進(jìn)行細(xì)胞分化能力的表征鑒定。常用的方法為利用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表型進(jìn)行鑒定以及對(duì)細(xì)胞進(jìn)行三系分化誘導(dǎo)。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在流式細(xì)胞儀中,一般表現(xiàn)為CD29、CD44、CD71、CD90、CD105 和CD106 陽(yáng)性以及CD3、CD4、CD14、CD34 和CD45 陰性。其中成軟骨潛力與CD105 有關(guān),該表型為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3(transforming growth factor-β3,TGF-β3)的一個(gè)受體[12],這意味著通過與TGF-β3 相互作用,CD105 在軟骨組織的再生和修復(fù)過程中可能起到重要的調(diào)控作用。此外CD146 作為與成骨潛能密切相關(guān)的標(biāo)記物在BMSCs 中被廣泛表達(dá),即在骨組織的再生和修復(fù)過程中,BMSCs 可以分化為骨細(xì)胞,參與骨組織的生成和修復(fù)。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞三系誘導(dǎo)分化是指通過特定的培養(yǎng)條件,將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。這一過程需要在特定的時(shí)間點(diǎn)添加多種刺激和抑制因子,這些因子在特定細(xì)胞類型分化的前期和末期發(fā)揮著重要的作用[13]。成骨誘導(dǎo)主要是將處于生長(zhǎng)旺盛期的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于預(yù)埋了0.1%明膠的6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,同時(shí)加入2 mL 完全培養(yǎng)基,待細(xì)胞融合60%~70%后,去除6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的完全培養(yǎng)基,同時(shí)加入2 mL 成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清、0.1 μmol/L 地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸酯和50 μmol/L 抗壞血酸)。定時(shí)換液,在誘導(dǎo)3 周后,使用茜素紅進(jìn)行染色,并利用顯微鏡觀察染色情況。研究報(bào)道,Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runtrelated transcription factor 2,Runx2)、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(Osterix)和β-連環(huán)蛋白(β-catenin)在成骨誘導(dǎo)分化中發(fā)揮舉足輕重的作用[14-17]。成脂肪誘導(dǎo)是將處于生長(zhǎng)旺盛期的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種到6 孔板中,每孔加入2 mL 完全培養(yǎng)基并且定時(shí)換液,等到細(xì)胞融合度達(dá)到100%或者過融合時(shí),去除孔內(nèi)的培養(yǎng)基,并向每孔加入2 mL 成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A 液(1 μmol/L 地塞米松、0.5 mmol/L 甲基異丁基黃嘌呤、10 μg/mL 胰島素、100 mmol/L 吲哚美辛和10% 胎牛血清)。誘導(dǎo)3 d 后,吸走6 孔板中的A 液,加入2 mL 帶10 μg/mL 胰島素和10%胎牛血清的成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基B 液。B 液作用24 h 后,吸走B 液,換回A 液進(jìn)行誘導(dǎo)。如此循環(huán)3~5 次,繼續(xù)用B 液維持培養(yǎng)4~7 d 直到脂滴變得足夠大、足夠圓。B 液維持培養(yǎng)期間,每隔2~3 d 需要更換新鮮的B 液,21 d 后,通過油紅O 染色評(píng)估細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)空泡的形成情況。在成脂分化過程中,主要參與的轉(zhuǎn)錄因子有miR-17、miR-21 和miR-143[18]。成軟骨誘導(dǎo)分化與上述兩種分化的主要差異在于對(duì)細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。取生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞置于離心管中,用0.5 mL 間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基重懸,室溫下150 r/min 離心5 min(擰松離心管管蓋以便于氣體交換),后將其放置于37℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)聚攏現(xiàn)象時(shí),輕彈離心管底部使軟骨球脫離管底,懸浮在液體中。定時(shí)更換培養(yǎng)基,誘導(dǎo)21~28 d 后,對(duì)軟骨球進(jìn)行福爾馬林固定和石蠟包埋切片,最后進(jìn)行阿利辛藍(lán)染色。成軟骨分化中,性別決定Y 染色體區(qū)域(SRY)相關(guān)的高遷移率族盒基因9(Sox9)[19-20]以及鋅指蛋白145(ZNF145)[21]等都是起到關(guān)鍵作用的主要轉(zhuǎn)錄因子。

3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用

基于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的軟骨缺損修復(fù)應(yīng)用,主要分為兩類:一類是直接將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞注射到軟骨損傷中,通過注射,干細(xì)胞可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和分化,并為損傷區(qū)提供細(xì)胞修復(fù)所需的生物因子和生長(zhǎng)因子。該方法可以將干細(xì)胞通過局部注射的方式,直接輸送到軟骨缺損處,具有簡(jiǎn)單、非侵入性的特點(diǎn),在臨床應(yīng)用中較為方便。另外一類則是通過組織工程軟骨的遞送系統(tǒng),利用水凝膠等生物材料包裹干細(xì)胞,將材料移植到軟骨缺損處。遞送系統(tǒng)具有良好的生物相容性和可塑性,可以提供支架結(jié)構(gòu)和細(xì)胞定位,在移植后,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以逐漸分化為軟骨細(xì)胞,并與材料共同促進(jìn)軟骨組織的再生和修復(fù)。這種方法可以根據(jù)缺損的大小和形狀,精確定位和定制支架,為軟骨修復(fù)提供更好的結(jié)構(gòu)和功能重建。

由于提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的治療侵入性小,且能夠降低發(fā)病率和手術(shù)成本,因此骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床前驗(yàn)證得到了眾多學(xué)者的廣泛關(guān)注。Maeda 等[22]通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證BMSCs 制造的圓盤形細(xì)胞薄片具有較好的成軟骨性能。Al Faqeh等[23]和Ude 等[24]通過山羊的骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型,發(fā)現(xiàn)在關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射干細(xì)胞可以促進(jìn)軟骨再生。此外,比格犬、豬等大型動(dòng)物[25-26]以及兔子、小鼠[27-28]等小型動(dòng)物的關(guān)節(jié)腔注射動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有利于軟骨修復(fù)。Li 等[29]將不同來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞負(fù)載到脫鈣骨支架并研究其軟骨分化潛力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用BMSCs 修復(fù)軟骨缺損,其修復(fù)組織在細(xì)胞形態(tài)和染色特性方面的表現(xiàn)超過了其他來(lái)源(如骨膜、脂肪、滑膜和肌肉等)的干細(xì)胞(P＜0.05)。Nejadnik 等[30]將72 名病情類似的患者隨機(jī)分成兩組,對(duì)兩組患者分別使用軟骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行修復(fù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMSCs 移植在緩解疼痛和提高患者生活質(zhì)量方面與軟骨細(xì)胞同樣有效,且與患者的年齡無(wú)關(guān)。盡管目前BMSCs 的采集相對(duì)簡(jiǎn)單且具有低免疫原性,但直接注射BMSCs 仍存在一定的問題,例如注射過程剪切力和局部缺氧等問題導(dǎo)致注射過程細(xì)胞死亡率較高、細(xì)胞在病灶區(qū)粘附力弱和細(xì)胞擴(kuò)散等問題導(dǎo)致干細(xì)胞無(wú)法在病灶區(qū)長(zhǎng)時(shí)間停留等。

軟骨組織工程是利用生物材料作為遞送系統(tǒng)進(jìn)行修復(fù),以水凝膠等生物材料作為支架,通過支架模仿細(xì)胞外基質(zhì),利用支架復(fù)合細(xì)胞,將支架-細(xì)胞復(fù)合物移植到軟骨損傷區(qū)。自體軟骨替代物的產(chǎn)生和軟骨缺陷新治療策略的開發(fā)是組織工程軟骨領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)。通過使用支架為細(xì)胞生長(zhǎng)提供一個(gè)三維空間,有利于種子細(xì)胞的存活,同時(shí)避免有害微環(huán)境的影響。目前,常見的支架材料主要分成兩類:一類是自然材料,另外一類是合成材料。自然材料(如去細(xì)胞基質(zhì)、膠原蛋白、殼聚糖、絲素蛋白、海藻酸鹽等)生物相容性好,可降解,但強(qiáng)度偏低。合成材料(高分子材料(聚乳酸、聚乙二醇)、水凝膠材料(甲基丙烯酸酐化明膠、甲基丙烯?；该髻|(zhì)酸明膠)等)來(lái)源廣、強(qiáng)度高,但可能存在潛在的排異反應(yīng)。

目前,軟骨組織工程中常用BMSCs 和水凝膠相結(jié)合的治療方法,基于免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用相關(guān)的“醫(yī)學(xué)信號(hào)細(xì)胞”特性,在受傷組織中誘導(dǎo)再生微環(huán)境的建立。Feng 等[31]首先合成了巰基明膠和乙烯基磺化透明質(zhì)酸,并通過微流道法將其與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合后注射至軟骨損傷部位,結(jié)果發(fā)現(xiàn),細(xì)胞在水凝膠材料中具有較高的活性、增殖能力和分化能力,這種可注射的自組裝負(fù)載干細(xì)胞的水凝膠能夠?qū)崿F(xiàn)簡(jiǎn)單有效的軟骨修復(fù)。Abdul Rahman等[32]以聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-coglycolic acid),PLGA)/纖維蛋白構(gòu)建了一個(gè)三維支架,將細(xì)胞接種于三維支架上有利于細(xì)胞成軟骨分化。Liu 等[33]通過3D 打印技術(shù),利用甲基丙烯酸透明質(zhì)酸(methacrylated hyaluronic acid,MeHA)/聚己酸內(nèi)酯打印了復(fù)合BMSCs 的多層支架,其中MeHA 用于負(fù)載干細(xì)胞,雙氯芬酸鈉用于抑制炎癥反應(yīng),結(jié)果顯示,負(fù)載BMSCs 的支架有利于促進(jìn)二型膠原表達(dá)和抑制白細(xì)胞介素1 表達(dá),進(jìn)一步說明利用BMSCs 復(fù)合支架能夠有效的避免關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥反應(yīng)并促進(jìn)軟骨修復(fù)。Erickson 等[34]研究表明,在體外植入BMSCs 的透明質(zhì)酸水凝膠可以改善軟骨修復(fù)。Ansboro 等[35]將擬軟骨的透明質(zhì)酸微球用作誘導(dǎo)BMSCs 軟骨形成的生長(zhǎng)因子傳遞源,負(fù)載TGF-β3 的微球孵育生長(zhǎng)的BMSCs 增強(qiáng)了軟骨相關(guān)糖胺聚糖的積累,并且II 型膠原蛋白和蛋白聚糖的陽(yáng)性染色證實(shí)了體外軟骨的形成;體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)同時(shí)也發(fā)現(xiàn)組織中蛋白聚糖表達(dá)的增加。Meng 等[36]設(shè)計(jì)了一種由親和肽修飾的脫礦質(zhì)骨基質(zhì)顆粒與殼聚糖水凝膠結(jié)合的復(fù)合支架用于軟骨工程,這種支架具有適當(dāng)?shù)目紫堵?并為細(xì)胞粘附和增殖提供了微環(huán)境,能夠改善BMSCs 體外軟骨分化的能力,可用于不規(guī)則形狀軟骨缺陷的修復(fù)。在臨床軟骨修復(fù)中使用BMSCs 可以避免自體軟骨細(xì)胞植入(autologous chondrocyte implantation,ACI)的局限性。在過去的10 年中,BMSCs 用于治療軟骨缺損的植入方法取得了與第一代ACI 相當(dāng)?shù)呐R床結(jié)果。此外,這種治療方法并沒有顯著增加腫瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)[37]。

4 小結(jié)與展望

目前,大量的研究人員就骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在軟骨修復(fù)中的應(yīng)用進(jìn)行了豐富的研究。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)研究結(jié)果表明,利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠較好的實(shí)現(xiàn)對(duì)軟骨的修復(fù),干細(xì)胞軟骨治療具有較好的發(fā)展前景。

盡管干細(xì)胞療法為軟骨損傷修復(fù)應(yīng)用開辟了新途徑,但移植后干細(xì)胞的存活率普遍較低。因此,研究如何支持干細(xì)胞的存活、促進(jìn)細(xì)胞生物活性以及增強(qiáng)細(xì)胞與周圍環(huán)境的結(jié)合,對(duì)于提高治療效果具有重要的意義。另外,與細(xì)胞外基質(zhì)類似的水凝膠材料作為遞送干細(xì)胞的載體已經(jīng)得到了廣泛的研究。目前,實(shí)現(xiàn)軟骨完全恢復(fù)到其原始的組成、結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能和生物功能仍然是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。例如,同時(shí)實(shí)現(xiàn)整合軟骨和軟骨下骨再生已成為組織工程學(xué)中的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。同時(shí),在考慮軟骨修復(fù)過程中,還需要考慮軟骨下骨修復(fù),在組織工程支架設(shè)計(jì)上應(yīng)仔細(xì)考慮兩種不同類型組織的結(jié)構(gòu)和模量差異。對(duì)于軟骨修復(fù)部分,需要支架表現(xiàn)出高彈性模量以承受壓力并抵抗摩擦,同時(shí)增強(qiáng)BMSCs 的軟骨形成,抑制肥大分化。軟骨下骨修復(fù)部分,則需考慮促進(jìn)水凝膠內(nèi)血管網(wǎng)絡(luò)的形成能力,以促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸,刺激成骨細(xì)胞的增殖并為再生軟骨提供強(qiáng)大的支持。另外還需考慮,植入物與周圍軟骨界面粘附力,提高組織工程軟骨的植入成功率。

在未來(lái),隨著科技的進(jìn)一步發(fā)展,隨著問題的逐一解決,將能夠?qū)崿F(xiàn)利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞精準(zhǔn)、高效地修復(fù)軟骨損傷。