周德聰 貝寧 李建紅 王葉青 陳聲妹

(1海南省老年病醫(yī)院神經(jīng)內科,海南 ?？?571100;2海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內科)

腦卒中又叫缺血性腦梗死,是導致患者死亡及長期殘疾的主要原因〔1〕。目前研究認為,腦缺血梗死后,缺血缺氧刺激引起的炎癥及氧化應激性反應,是導致腦卒中患者神經(jīng)元炎性損傷凋亡及神經(jīng)功能缺損癥狀發(fā)生的關鍵因素,且用抗炎及抗應激治療思路可達到緩解腦卒中后神經(jīng)系統(tǒng)損傷的目的〔2〕。

缺氧誘導因子(HIF)-1α是協(xié)調缺氧變化、介導細胞內低氧反應的重要調節(jié)因子,已有研究發(fā)現(xiàn)腦卒中缺血缺氧刺激條件下,HIF-1α活性升高可通過誘導白細胞介素(IL)-1β、IL-18的轉錄活化來加重神經(jīng)系統(tǒng)炎癥損傷進程,并認為HIF-1α可作為判定腦卒中嚴重程度的潛在靶標分子〔3〕。Nod樣受體熱蛋白結構域相關蛋白(NLRP)3可與凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)及半胱天冬蛋白酶-1前體(Pro-Caspase-1)相互結合成炎癥復合體,誘導IL-1β、IL-18等炎癥因子的成熟及分泌,研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體與腦卒中過程中的神經(jīng)免疫效應細胞,如巨噬或小膠質細胞極化介導的炎癥反應關系密切〔4〕。有研究發(fā)現(xiàn),HIF-1α可通過直接或間接增強NLRP3啟動子轉錄而誘導NLRP3表達,來參與腦卒中后神經(jīng)元炎性損傷及凋亡過程〔5〕。但引起HIF-1α/NLRP3軸活化的基因調控機制還不明確。

miRNA是控制人類大腦各種功能所必需的調節(jié)因子,腦缺血梗死后多種miRNA的異常表達可影響神經(jīng)免疫效應細胞活化,并介導神經(jīng)元炎性損傷發(fā)生〔6〕。miR-138為一種抑癌因子,其控制腦膠質瘤細胞的侵襲及轉移,延緩腦膠質瘤患者病情發(fā)展〔7〕,但其在腦卒中過程中的研究還未見報道。已有研究〔8〕發(fā)現(xiàn),miR-138為HIF-1α的上游靶向調節(jié)因子,預示腦卒中患者HIF-1α/NLRP3軸的異?；罨?很可能與miR-138的異常表達有關。本研究建立大鼠腦卒中模型,探究干預調控miR-138后對神經(jīng)元凋亡的影響,以期為腦卒中的基因靶向治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1實驗材料 清潔健康SD雄性大鼠95只,7～8周齡,體質量280～300 g,購自中山大學附屬第一醫(yī)院,生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵)2020-0056。本實驗經(jīng)醫(yī)院動物倫理委員會批準同意,符合3R原則,批號:IAU-2020011032。miR-138激動劑(miR-138 agomir)及其陰性對照(agomir-NC)均由銳博生物公司合成;HIF-1α激活劑-奧替普拉(Oltipraz,貨號:HY-12519,美國MCE公司);IL-1β、IL-18等酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自深圳海思安生物技術有限公司;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液(貨號:YT8072)購自北京伊塔生物科技有限公司;尼氏染液(貨號:OX02559)購自上海圻明生物科技有限公司;TUNEL染色液(貨號:FK-MB793J)購自上海延慕實業(yè)有限公司;M1型巨噬細胞極化表面標志物-CD11c、NLRP3、HIF-1α、IL-1β、IL-18、Caspase-1、pro-Caspase-1等兔抗大鼠抗體均購自美國abcam公司。

1.2腦卒中患者標本采集 取2016年1月至2020年1月于海南省老年病醫(yī)院腦病科確診的腦卒中患者60例(初次發(fā)病,發(fā)病后24 h內入院治療),男33例,女27例;平均年齡(63.00±8.00)歲;美國國立衛(wèi)生研究院腦卒中量表(NIHSS)評分為4～15分,排除腦出血傾向。納入標準:參照全國第四屆腦血管病學術會議修訂的《各類腦血管疾病診斷要點》〔9〕確診為腦卒中。排除標準:排除短暫性腦缺血發(fā)作、心源性腦栓塞、外傷性腦血管病、隱匿性腦血管畸形、出血性腦梗死等神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者。同期選擇醫(yī)院健康體檢者20例,平均年齡(62.00±9.00)歲,男12例,女8例。收集腦卒中患者及健康體檢者血清2 ml,用RNA提取試劑盒方法提取血清中總RNA后,用qRT-聚合酶鏈反應(PCR)法檢測miR-138表達?；颊呒凹覍倬炇鹬橥鈺?。

1.3腦卒中模型建立及分組 取健康大鼠80只,麻醉后參照文獻〔10〕方法結扎大鼠右側中動脈建立腦卒中模型,術后7 d,以大鼠出現(xiàn)行走困難、左前肢屈曲或行走時左側轉圈或傾倒現(xiàn)象,視為造模成功(共成功75只,2只術后感染死亡,2只術中手術失敗死亡,1只未出現(xiàn)行走困難等腦卒中表型特征而剔出實驗)。將造模成功的大鼠隨機分為模型組、miR-138激動劑(miR-138 agomir)組、agomir-NC組、HIF-1α激活劑組、miR-138 agomir+HIF-1α激活劑組,每組15只。另取15只健康大鼠只暴露右側中動脈,不進行結扎,作為假手術組。

miR-138 agomir組及agomir-NC組用腦立體定向儀經(jīng)右側腦室注射miR-138 agomir及agomir-NC試劑各50 μl,1次/2 d進行干預治療;HIF-1α激活劑組參照文獻〔11〕經(jīng)腹腔注射HIF-1α激活劑(奧替普拉,0.5 mg/kg),1次/2 d進行干預治療;miR-138 agomir+HIF-1α激活劑組給予miR-138 agomir的同時,經(jīng)腹腔注射奧替普拉。模型組及假手術組腹腔注射10 ml/kg生理鹽水進行干預治療,各組連續(xù)給藥4 w后,進行后續(xù)試驗。

1.4改良神經(jīng)功能損害程度評分(mNSS)評價神經(jīng)功能缺損程度 各組給藥結束后,參照文獻〔12〕方法對運動、感覺、平衡、反射等行為進行mNSS評分,總分18分,評分越高預示神經(jīng)功能缺損行為越嚴重。

1.5TTC染色觀察腦梗死面積檢測 隨機取6只大鼠,麻醉處死后,取完整腦組織,切成厚為20 μmol/L的連續(xù)切片,按TCC染色液說明書方法染色后,Image Pro Plus5.0圖像處理系統(tǒng)掃描并計算觀察腦梗死面積(染成白色部位)及非梗死部位面積,根據(jù)公式:腦梗死面積=梗死面積/(梗死面積+非梗死面積)×100%,評價腦梗死程度。

1.6尼氏及TUNEL染色觀察海馬神經(jīng)元損傷及凋亡變化 剩余大鼠斷頭處死,取完整腦組織,冰上剝離海馬組織,將海馬組織分成兩部分,一部分海馬組織置于-80 ℃保存?zhèn)溆?另一部分用4%多聚甲醛固定后,制成5 μmol/L的石蠟切片,取相同部位石蠟切片,進行尼氏及TUNEL染色后,置于光鏡下觀察神經(jīng)元染色情況,TUNEL染色切片,用Image Pro Plus6.0系統(tǒng)檢測單位面積內凋亡細胞(陽性染色為棕黃色)數(shù)目,并計算凋亡細胞比例,凋亡細胞比例=(凋亡細胞數(shù)目/總細胞數(shù)目)×100%。

1.7免疫組化染色檢測海馬組織CD11c、NLRP3陽性表達 海馬組織石蠟切片,脫蠟、水化、透化及抗原修復處理后,加入1∶200的CD11c、NLRP3抗體孵育過夜,1∶400的二抗羊抗兔IgG孵育40 min后,進行二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色及蘇木素染色處理后,Image Pro Plus5.0圖像系統(tǒng)測單位面積內陽性染色的平均光密度(AOD)值。

1.8qRT-PCR法檢測miR-138表達 提取血清及海馬組織中總RNA,逆轉錄得到cDNA,行PCR(反應條件:92 ℃預變性50 s、1個循環(huán),95 ℃變性20 s、60 ℃退火60 s、46個循環(huán))。以U6為內參用2-ΔΔCt法計算miR-138(引物序列:正向-5′-GGCAGTGTGTGAATCG-3′,反向-5′-CAGGGCTTGTCGTAGAG-3′)相對表達水平。各引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.9Western印跡檢測海馬組織蛋白表達 將冰凍海馬組織于4 ℃解凍后,粉碎勻漿后提取蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白總濃度,取60 μg蛋白行加樣電泳、濕轉法轉膜操作,5%脫脂奶粉封閉,滴加1∶700的一抗(HIF-1α、NLRP3、IL-1β、IL-18、Caspase-1、pro-Caspase-1)抗體及1∶1 500的內參β-actin抗體孵育過夜,滴加辣根過氧化酶(HRP)羊抗兔二抗(1∶2 000)室溫孵育80 min,化學發(fā)光液及顯影液浸泡曝光、晾干,以ImageJ軟件分析條帶相對灰度值。

1.10統(tǒng)計學分析 采用SPSS24.0軟件進行t檢驗及SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1兩組血清miR-138表達比較 與健康組(1.00±0.00)相比,腦卒中組血清中miR-138表達(0.32±0.06)顯著降低(P<0.05)。

2.2miR-138上調對神經(jīng)功能缺損及腦梗死面積的影響 與假手術組相比,模型組神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死面積顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,miR-138 agomir組神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死面積顯著降低(P<0.05);HIF-1α激活劑組神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死面積顯著升高(P<0.05)。與miR-138 agomir組相比,HIF-1α激活劑組、agomir-NC組及miR-138 agomir+HIF-1α激活劑組神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死面積顯著升高(P<0.05),見表1。

2.3miR-138上調對腦卒中大鼠海馬神經(jīng)元損傷及凋亡的影響 尼氏及TUNEL染色可見,假手術組海馬神經(jīng)元排列整齊,細胞結構正常,僅有少量染成棕黃色的凋亡細胞。模型組可見海馬神經(jīng)元排列紊亂,神經(jīng)元細胞腫脹、破裂及核固縮等損傷現(xiàn)象明顯,神經(jīng)元凋亡率顯著高于假手術組(P<0.05)。miR-138 agomir組神經(jīng)元排列稍整齊,神經(jīng)元細胞破裂及核固縮等病理損傷緩解,神經(jīng)元凋亡率顯著低于模型組(P<0.05)。HIF-1α激活劑組神經(jīng)元損傷進一步加重,可見空泡化的神經(jīng)元形成,神經(jīng)元凋亡率較模型組及miR-138 agomir組顯著升高(P<0.05)。agomir-NC組神經(jīng)元損傷較模型組相近,神經(jīng)元凋亡率與模型組相比差異不顯著(P>0.05),較miR-138 agomir組顯著升高(P<0.05)。與miR-138 agomir組相比,miR-138 agomir+HIF-1α激活劑組神經(jīng)元損傷加重,凋亡率顯著升高(P<0.05),見表1、圖1。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死面積、神經(jīng)元凋亡率及CD11c、NLRP3陽性表達比較

圖1 各組海馬組織(×400)

2.4miR-138上調對海馬組織CD11c及NLRP3陽性表達的影響 免疫組化染色可見,CD11c及NLRP3可在海馬神經(jīng)元中呈陽性表達。與假手術組相比,模型組CD11c及NLRP3陽性表達顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,miR-138 agomir組CD11c及NLRP3陽性表達顯著降低(P<0.05);HIF-1α激活劑組CD11c及NLRP3陽性表達顯著升高(P<0.05)。與miR-138 agomir組相比,HIF-1α激活劑組、agomir-NC組及miR-138 agomir+HIF-1α激活劑組CD11c及NLRP3陽性表達顯著升高(P<0.05),見表1、圖2。

圖2 各組海馬組織CD11c及NLRP3表達(免疫組化染色,×400)

2.5miR-138上調對海馬組織miR-138/HIF-1α/NLRP3信號軸的影響 與假手術組相比,模型組海馬組織miR-138表達顯著降低,HIF-1α、NLRP3蛋白表達顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,miR-138 agomir組海馬組織miR-138表達顯著升高,HIF-1α、NLRP3蛋白表達顯著降低(P<0.05);HIF-1α激活劑組HIF-1α、NLRP3蛋白表達顯著升高(P<0.05);miR-138 agomir+HIF-1α激活劑組miR-138表達顯著升高(P<0.05)。與miR-138 agomir組相比,miR-138 agomir+HIF-1α激活劑組HIF-1α、NLRP3蛋白表達顯著升高(P<0.05);HIF-1激活劑組及agomir-NC組miR-138表達顯著降低,HIF-1α、NLRP3蛋白表達顯著升高(P<0.05),見表2、圖3。

2.6miR-138上調對海馬組織IL-1β、IL-18、Caspase-1、pro-Caspase-1蛋白表達的影響 與假手術組相比,模型組海馬組織IL-1β、IL-18、Caspase-1、pro-Caspase-1蛋白表達顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,miR-138 agomir組IL-1β、IL-18、Caspase-1、pro-Caspase-1蛋白表達顯著降低(P<0.05);HIF-1α激活劑組IL-1β、IL-18、Caspase-1、pro-Caspase-1蛋白表達顯著升高(P<0.05)。與miR-138 agomir組相比,HIF-1α激活劑組、agomir-NC組及miR-138 agomir+HIF-1α激活劑組IL-1β、IL-18、Caspase-1、pro-Caspase-1蛋白表達顯著升高(P<0.05),見表2、圖3。

表2 各組海馬組織miR-138、HIF-1α、NLRP3、IL-1β、IL-18、Caspase-1、pro-Caspase-1蛋白表達比較

1～6:假手術組、模型組、miR-138 agomir組、HIF-1α激活劑組、agomir-NC組、miR-138 agomir+HIF-1α激活劑組圖3 各組海馬組織HIF-1α、NLRP3、IL-1β、IL-18、 Caspase-1、pro-Caspase-1蛋白表達

3 討 論

腦卒中后,神經(jīng)元廣泛性缺血缺氧壞死、病變及凋亡是導致腦神經(jīng)功能障礙發(fā)生的根本原因,而腦部炎癥反應是神經(jīng)系統(tǒng)病理損傷的主要過程之一〔13〕。大量研究發(fā)現(xiàn),缺血缺氧刺激、凋亡均會誘導免疫細胞活化及炎癥介質的大量釋放,炎癥介質在促進循環(huán)免疫細胞向缺血部位趨化的過程中,可進一步促進炎癥反應的惡化及神經(jīng)元的凋亡,并認為炎癥反應、炎癥消退是腦卒中后神經(jīng)功能損傷及修復的關鍵環(huán)節(jié)〔14〕。巨噬細胞或小膠質細胞是神經(jīng)系統(tǒng)的主要免疫細胞,其M1型極化,具有促炎特性,檢測M1型極化表面特異性物質CD11c表達,可反應組織促炎反應特性〔15〕。本研究結果提示,腦卒中模型造模成功,且炎癥反應參與腦卒中后神經(jīng)元損傷過程。

腦卒中過程,血液循環(huán)障礙使組織營養(yǎng)及氧供減少而梗死,缺血組織在氧供減少情況下,具有介導及感受低氧反應的調節(jié)因子HIF-1以異源二聚體(HIF-1α)的形式穩(wěn)定存在及活化,HIF-1α的活化可與其亞基(HIF-1β)結合,促進下游目的基因如IL-1β、IL-18的缺氧反應元件結合序列活化,而促進IL-1β、IL-18的轉錄,IL-1β、IL-18活性的升高可促進HIF-1α的進一步活化,實現(xiàn)“炎癥-HIF-1α-炎癥”的正反饋循環(huán)而放大炎癥反應〔16〕。Davis等〔17〕發(fā)現(xiàn),HIF-1α與腦卒中嚴重程度相關,用蛋白酶體抑制劑抑制HIF-1α降解而促進HIF-1α活化后,可降低IL-1β的生成而緩解神經(jīng)元缺氧性凋亡,證實HIF-1α可能是放大腦卒中后神經(jīng)炎性反應損傷的關鍵調節(jié)因子。另外,HIF-1α的活化也可誘導NLRP3炎癥小體活化而進一步促進炎癥反應。研究證實,NLRP3為炎癥反應的核心因子,在病原微生物、應激刺激等引起固有免疫系統(tǒng)活化過程中,NLRP3可與ASC及pro-Caspase-1結合形成分子量約為700 kD的多蛋白復合體,即炎癥小體,來識別多種病原微生物、炎癥應激、內源性危險信號的活化,而介導IL-1β、IL-18等免疫炎性分子的成熟及分泌,加大炎癥級聯(lián)反應的傳導,而HIF-1α活化后可通過活性氧簇(ROS)生成或結合NLRP3啟動子或增強子區(qū)域,來間接或直接誘導NLRP3的轉錄及表達并參與組織炎性損傷過程〔18〕。Jiang等〔5〕發(fā)現(xiàn),用HIF-1α抑制劑YC-1抑制HIF-1α表達后,腦卒中大鼠模型NLRP3炎癥小體及下游IL-1β、IL-18炎癥因子表達均明顯減弱,大鼠神經(jīng)元凋亡及神經(jīng)功能缺損癥狀均得到明顯緩解,證實抑制HIF-1介導的NLRP3炎癥小體激活,可能是治療腦卒中的潛在策略。本研究也證實,HIF-1介導的NLRP3炎癥小體激活,可能是引起腦卒中后神經(jīng)元炎性損傷及凋亡的關鍵原因。但引起腦卒中HIF-1α/NLRP3炎癥反應活化的靶向基因調控機制還不甚明確。

miRNAs已被證明可靶向多種基因的轉錄及表達而參與腦卒中后炎癥反應過程〔19〕。Yu等〔20〕研究發(fā)現(xiàn),腦卒中患者血清中約有200種異常表達的miRNAs,且這些異常表達的miRNAs在腦卒中的診斷及預后評估中發(fā)揮巨大作用。miRNAs中的miR-138為抑癌因子,其可在膠質瘤細胞中異常表達而參與膠質瘤細胞的異常增殖過程〔7〕。已有研究發(fā)現(xiàn),miR-138可靶向抑制炎癥通路——核轉錄因子(NF)-κB表達來抑制脊髓損傷患者促炎因子釋放及小膠質細胞活化,發(fā)揮抗神經(jīng)炎性損傷作用〔21〕。另外,miR-138與HIF-1α之間有靶向結合位點,Gai等〔8〕研究證實,miR-138可靶向抑制HIF-1α表達來阻止心肌細胞缺氧復氧性凋亡,預示HIF-1α的活化可能與miR-138表達降低有關。本研究提示,miR-138發(fā)揮抗腦卒中后神經(jīng)元損傷及凋亡作用,可能與抑制HIF-1介導的NLRP3炎癥小體激活有關。這為腦卒中的藥物研發(fā)及基因靶向治療,提供新思路。但腦卒中后神經(jīng)元炎性損傷及凋亡作用,往往需要多個miRNAs及mRNA調控,且HIF-1α啟動NLRP3活化的具體機制研究較少,還存在許多盲點,有待后續(xù)深入探究。