陳祥科 張雪海 孫恒聰 吉曉天 邢莉菊

(三亞市人民醫(yī)院 1康復(fù)醫(yī)學(xué)科,海南 三亞 572022;2神經(jīng)內(nèi)科;3廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬粵海醫(yī)院康復(fù)科)

缺血性腦卒中容易導(dǎo)致患者死亡或致殘〔1〕,靜脈溶栓聯(lián)合阿替普酶或動(dòng)脈內(nèi)取栓是臨床上治療缺血性腦卒中的有效策略〔2〕,但是也可能在進(jìn)行腦缺血再灌注時(shí)加重腦損傷〔3〕。因此,尋找高效、低毒的新藥防治缺血性腦卒中損傷具有重要意義。香椿子多酚(PTSS)是從香椿子中提取的一種化合物,已有研究發(fā)現(xiàn)PTSS對(duì)心肌缺血再灌注大鼠具有一定的保護(hù)作用〔4〕。下調(diào)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)2/環(huán)氧合酶(COX)-2信號(hào)通路中的p-STAT3、COX-2的表達(dá)可減輕大鼠急性腦缺血再灌注損傷〔5〕。眾所周知,缺血性腦卒中的病理生理過(guò)程是復(fù)雜的,涉及氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等〔6〕。而PTSS能否通過(guò)調(diào)控STAT3/COX-2信號(hào)通路改善缺血性腦卒中鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究探究PTSS對(duì)缺血性腦卒中大鼠的保護(hù)作用,并探究可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 75只SPF級(jí)雄性SD大鼠購(gòu)自肇慶市瑞思元生物科技有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(粵)2020-0053,鼠齡6周齡,體質(zhì)量200～210 g,大鼠均生活在(25±3)℃,濕度60%,12 h光/暗循環(huán)的環(huán)境中,并可自由獲取食物和水。該研究得到醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),并遵循3R原則。

1.2主要試劑 STAT3/COX-2通路激活劑白細(xì)胞介素(IL)-6中和抗體(貨號(hào):Ab0001)購(gòu)自北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司;2,3,5氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液(2%,貨號(hào):G3005)購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司;大鼠超氧化物歧化酶(SOD,貨號(hào):RJ16643)、丙二醛(MDA,貨號(hào):RJ16659)試劑盒購(gòu)自上海仁捷生物科技有限公司;TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):KTA2010)購(gòu)自武漢安賽思生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司;兔源一抗p-STAT3(貨號(hào):ab267373)、STAT3(貨號(hào):ab68153)、COX-2(貨號(hào):ab169782)、β-actin(貨號(hào):ab5694)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(貨號(hào):ab205718)均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3藥物 香椿子購(gòu)自亳州市聚春堂中藥材銷(xiāo)售有限公司,稱(chēng)取香椿子重量,經(jīng)乙醇提取及AB-8大孔樹(shù)脂純化后,通過(guò)真空干燥獲取PTSS粉末。利用5%羧甲基纖維素鈉溶解PTSS粉末并配制成所需濃度。

1.4缺血性腦卒中模型的構(gòu)建及分組 利用改良的Longa線栓法構(gòu)建缺血性腦卒中大鼠模型〔7〕,用戊巴比妥鈉麻醉大鼠,并將大鼠進(jìn)行仰臥位固定,分離大鼠左頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈,用微動(dòng)脈夾阻閉頸總動(dòng)脈,栓線結(jié)扎頸外動(dòng)脈,將從頸外動(dòng)脈插入的栓線調(diào)整至頸內(nèi)動(dòng)脈,當(dāng)栓線進(jìn)入約18 mm時(shí)能感受到有阻力感,表明栓線已經(jīng)進(jìn)入大腦中動(dòng)脈,此時(shí)固定栓線,縫合傷口。通過(guò)Zea-Longa評(píng)分法進(jìn)行大鼠神經(jīng)功能評(píng)分,若神經(jīng)功能評(píng)分為1～3分則為造模成功〔8〕。

按照隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠分為NC組、Model組、PTSS組、IL-6組、PTSS+IL-6組,每組15只。除NC組外,其他組均需構(gòu)建缺血性腦卒中模型,NC組大鼠不插入線栓,其余操作同Model組。本研究建模成功率為100%,造模成功后,PTSS組按照200 mg/kg的劑量灌胃PTSS〔9〕,同時(shí)還需尾靜脈注射0.5 mg/kg生理鹽水;IL-6組按照0.5 mg/kg的劑量尾靜脈注射IL-6抗體〔10〕,同時(shí)還需灌胃200 mg/kg 0.5%羧甲基纖維素鈉;PTSS+IL-6組除需灌胃200 mg/kg PTSS外,還需尾靜脈注射0.5 mg/kg IL-6抗體;NC組、Model組以200 mg/kg的劑量灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉,還需按照0.5 mg/kg的劑量尾靜脈注射生理鹽水,每天1次,連續(xù)7 d。

1.5標(biāo)本收集 造模結(jié)束及末次給藥結(jié)束后,采用Zea-Longa評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分;神經(jīng)功能評(píng)分完成后,處死大鼠,收集大鼠海馬CA1區(qū)腦組織,均分為3部分,一部分用于TTC染色,一部分用于蘇木素-伊紅(HE)和TUNEL染色,剩余部分用于SOD、MDA水平的檢測(cè)及Western印跡實(shí)驗(yàn)。

1.6神經(jīng)功能評(píng)分的測(cè)定 根據(jù)Zea-Longa評(píng)分系統(tǒng)〔11〕進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分:0分為無(wú)神經(jīng)功能障礙癥狀;1分為不能伸展對(duì)側(cè)前爪;2分為走路時(shí)轉(zhuǎn)向偏癱側(cè);3分為向偏癱側(cè)傾倒;4分為無(wú)法自主行走,失去知覺(jué)。

1.7TTC染色檢測(cè)腦梗死體積百分率 取出腦組織,用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗并切成2 mm厚的切片,將切片置于2% TTC溶液中,并在37 ℃下避光30 min,然后在4%甲醛中固定24 h并拍照,未染色區(qū)域定義為腦梗死區(qū)域,通過(guò) Image-Pro Plus6.0軟件評(píng)估腦梗死體積,并計(jì)算腦梗死體積百分率(%)=(腦梗死體積/全部腦體積)×100%。

1.8HE染色檢測(cè)大鼠腦組織海馬CA1區(qū)病理變化 將用4%多聚甲醛固定的海馬CA1區(qū)腦組織經(jīng)石蠟包埋、切片后進(jìn)行HE染色,最后觀察海馬CA1區(qū)腦組織病理變化。

1.9大鼠腦組織中SOD、MDA水平的檢測(cè) 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟檢測(cè)腦組織勻漿中SOD、MDA水平變化。

1.10TUNEL染色神經(jīng)細(xì)胞凋亡 將石蠟包埋的腦組織切成4 μm厚的切片,固定在二甲苯中,用乙醇梯度水合后再用蛋白酶K透化30 min。然后將腦組織切片置于TUNEL試劑中,37 ℃處理1 h,再加入0.05 μg/ml 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色10 min,最后利用熒光顯微鏡觀察并拍照,綠色熒光標(biāo)記的細(xì)胞為T(mén)UNEL陽(yáng)性細(xì)胞。并計(jì)算細(xì)胞凋亡率(%)=(TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/DAPI染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù))×100%。

1.11Western印跡檢測(cè)p-STAT3、STAT3、COX-2蛋白 使用RIPA裂解緩沖液提取腦組織勻漿總蛋白,將蛋白進(jìn)行定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,加入一抗p-STAT3、STAT3、COX-2、β-actin在4 ℃下過(guò)夜。第2天,再加入二抗在室溫下孵育2 h。通過(guò)電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑觀察蛋白印跡,ImageJ軟件評(píng)估目的蛋白灰度值。

1.12統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1PTSS對(duì)各組神經(jīng)功能評(píng)分的影響 與NC組相比,Model組神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高(P<0.05);與Model組相比,PTSS組神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低,IL-6組神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高(P<0.05);與PTSS組相比,PTSS+IL-6組神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高(P<0.05),見(jiàn)表1。

2.2PTSS對(duì)各組腦梗死體積百分率變化的影響 與NC組比較,Model組腦梗死體積百分率顯著升高(P<0.05);與Model組比較,PTSS組腦梗死體積百分率顯著降低,IL-6組腦梗死體積百分率顯著升高(P<0.05);與PTSS組比較,PTSS+IL-6組腦梗死體積百分率顯著升高(P<0.05),見(jiàn)表1、圖1。

2.3PTSS對(duì)各組腦組織海馬CA1區(qū)病理變化的影響 NC組腦組織海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊,結(jié)構(gòu)完整;Model組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損,核變形、萎縮,神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞排列松散;與Model組比較,PTSS組腦組織海馬CA1區(qū)病理變化得到顯著改善,而IL-6組腦組織海馬CA1區(qū)病理?yè)p傷加劇;與PTSS組比較,PTSS+IL-6組腦組織海馬CA1區(qū)病理?yè)p傷加重,見(jiàn)圖2。

2.4PTSS對(duì)各組腦組織中SOD、MDA水平變化的影響 與NC組相比,Model組SOD活性明顯降低,MDA水平明顯升高(P<0.05);與Model組相比,PTSS組SOD活性明顯升高,MDA水平明顯降低,IL-6組SOD活性明顯降低,MDA水平明顯升高(P<0.05);與PTSS組相比,PTSS+IL-6組腦組織中SOD水平顯著降低,MDA水平顯著升高(P<0.05),見(jiàn)表1。

2.5PTSS對(duì)各組腦組織中神經(jīng)細(xì)胞凋亡變化的影響 與NC組相比,Model組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與Model組相比,PTSS組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著降低,IL-6組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與PTSS組比較,PTSS+IL-6組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05),見(jiàn)表1、圖3。

2.6PTSS對(duì)各組腦組織中STAT3/COX-2通路蛋白表達(dá)變化的影響 與NC組相比,Model組p-STAT3/STAT3、COX-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);與Model組相比,PTSS組p-STAT3/STAT3、COX-2蛋白表達(dá)水平顯著降低,IL-6組腦組織中p-STAT3/STAT3、COX-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與PTSS組比較,PTSS+IL-6組腦組織中p-STAT3/STAT3、COX-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),見(jiàn)表1、圖4。

表1 各組神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積百分率、腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、SOD和MDA水平及 p-STAT3、COX-2蛋白表達(dá)比較

圖1 TTC染色檢測(cè)各組腦梗死

圖2 各組腦組織海馬CA1區(qū)病理(HE染色,×400)

圖3 各組腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡(TUNEL染色,×200)

1～5:NC組、Model組、PTSS組、IL-6組、PTSS+IL-6組圖4 各組腦組織中p-STAT3、STAT3、COX-2蛋白表達(dá)

3 討 論

缺血性腦卒中是一種與細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的多因素疾病,缺血性腦卒中的后續(xù)氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、血腦屏障受損、神經(jīng)血管損傷、水腫和出血〔12〕。據(jù)報(bào)道,腦卒中后的細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激是缺血性腦損傷的重要分子機(jī)制〔13〕。本研究通過(guò)利用改良的Longa線栓法進(jìn)行缺血性腦卒中大鼠模型的構(gòu)建,結(jié)果證明缺血性腦卒中大鼠模型構(gòu)建成功。SOD、MDA分別是常用于衡量機(jī)體抗氧化、氧化能力的重要標(biāo)志物,已有研究證實(shí)在缺血性腦卒中大鼠模型中SOD水平降低,MDA水平升高〔14〕。本研究得出了類(lèi)似的結(jié)論,提示氧化應(yīng)激及神經(jīng)細(xì)胞凋亡可能參與了缺血性腦卒中大鼠腦組織損傷過(guò)程。

香椿子是香椿的果實(shí),具有抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等作用〔15〕。PTSS是從香椿子中提取的一種化合物,已有研究報(bào)道,PTSS可減輕帕金森病大鼠的神經(jīng)炎癥反應(yīng)〔16〕;PTSS可減輕心肌缺血再灌注大鼠心肌梗死程度〔17〕。而關(guān)于PTSS對(duì)缺血性腦卒中大鼠的影響尚不清楚。本研究結(jié)果表明,PTSS可能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激及神經(jīng)細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮對(duì)缺血性腦卒中大鼠的保護(hù)作用。

STAT3是STAT信號(hào)蛋白家族的成員之一,促進(jìn)STAT3的磷酸化可激活COX-2進(jìn)而促進(jìn)炎癥性疾病的發(fā)展〔18〕。據(jù)報(bào)道,葛根素對(duì)腦梗死大鼠的神經(jīng)功能及神經(jīng)細(xì)胞凋亡具有改善作用,該作用與抑制STAT3表達(dá)有關(guān)〔19〕;COX-2在伴有糖尿病的腦梗死患者中高表達(dá)〔20〕。本研究結(jié)果推測(cè)PTSS可能通過(guò)抑制STAT3/COX-2通路減輕大鼠缺血性腦卒中損傷。為了驗(yàn)證該推測(cè),本研究利用STAT3/COX-2通路激活劑IL-6抗體進(jìn)行干預(yù),證實(shí)了STAT3/COX-2通路確實(shí)參與了缺血性腦卒中的氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡過(guò)程,PTSS可能通過(guò)抑制STAT3/COX-2通路減輕大鼠缺血性腦卒中損傷。

綜上所述,PTSS可能通過(guò)抑制STAT3/COX-2通路減輕大鼠缺血性腦卒中損傷。但PTSS保護(hù)缺血性腦卒中大鼠涉及的機(jī)制較為復(fù)雜,具體通過(guò)STAT3/COX-2通路下游的哪些蛋白來(lái)發(fā)揮作用有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。