翁紅林 張崇太 吳俊

(上饒市立醫(yī)院神經(jīng)外科,江西 上饒 334000)

腦出血占所有腦卒中的10%～20%,一年當(dāng)中每10萬人的發(fā)病率為24.6%,與缺血性腦卒中相比,其發(fā)病率和死亡率更高〔1〕。腦出血與嚴重的長期殘疾、抗凝、抗血小板藥物的使用及老齡化人口相關(guān)的發(fā)病率不斷增加都有著密切的關(guān)系,其可變風(fēng)險因素也包括飲用過量酒精、吸煙、過低的低密度脂蛋白膽固醇和低水平的血清三酰甘油等〔2,3〕。臨床上治療腦出血主要包括止血治療如給予充足活化因子Ⅶ、急性強化降壓等〔4〕。腦出血往往導(dǎo)致嚴重的神經(jīng)功能損傷從而影響患者生存質(zhì)量,所以找到一種有效安全的治療方法緩解腦出血后的神經(jīng)功能損傷至關(guān)重要〔5,6〕。

單唾液酸四己糖基神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)作為一種天然細胞產(chǎn)物,臨床上用于治療血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷等〔7〕,對興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)的釋放或再攝取及活性氧的過量產(chǎn)生具有良好的療效〔8〕,但其實際作用機制尚未完全闡明。研究表明,磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路可調(diào)控細胞內(nèi)多種生物學(xué)效應(yīng)〔9〕。糖原合成酶激酶(GSK)3β是PI3K-AKT介導(dǎo)的下游之一,調(diào)節(jié)細胞代謝、遷移、凋亡、擴散和炎癥等多種生物活性。這一通路在糖尿病、阿爾茨海默病等發(fā)生過程中也起到了重要作用〔10,11〕。AKT通過磷酸化GSK3β的Ser9位來抑制GSK3β對皮膚創(chuàng)傷愈合至關(guān)重要。GSK3β底物如β-連環(huán)蛋白(catenin)和細胞周期蛋白(cyclin)D1是促進細胞增殖和存活的關(guān)鍵蛋白〔12〕。然而GM1是否能改善腦出血后的神經(jīng)損傷,甚至保護腦出血中某些病理因素引起的損傷,目前尚未完全闡明。本研究擬通過構(gòu)建大鼠急性腦出血神經(jīng)損傷模型,觀察GM1對急性腦出血后大鼠神經(jīng)功能的影響及其作用機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物 購自杭州子源實驗動物科技有限公司的健康成年大鼠,SPF 級,合格證編號:20211107Abzz005000603。飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級實驗室。本實驗遵循動物實驗倫理要求,已通過安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗倫理委員會批準且實驗方案依據(jù)《實驗動物的護理和使用指南》進行。

1.2藥物及試劑 GM1購自SiGM1a-Aldrich公司,PI3K抑制劑LY294002購自MCE公司,PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β、GAPDH一抗購自Affinity公司,辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗購自Elabscience,蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、尼氏染色試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.3實驗儀器 多功能酶標儀(上海歐翔科學(xué)儀器公司);凝膠成像系統(tǒng)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司);電泳設(shè)備(美國Thermo Fisher Scientific公司);電子分析天平(Heal Force公司);麻醉機(德國LECIA公司);SC-2546 低溫高速離心機(日本Nikon 公司);倒置熒光顯微鏡(德國Heidolph公司)。

1.4急性腦出血神經(jīng)損傷大鼠模型構(gòu)建和實驗分組 小鼠左側(cè)尾狀核處顱骨打孔,注射0.5 μl Ⅶ型膠原酶(0.075 U)后1 d神經(jīng)功能缺損評分(NDS)≥4分視為造模成功,進行后續(xù)實驗。小鼠被分為假手術(shù)(Sham)組、模型(Model)組、GM1(25 mg/kg)組、GM11+LY294002(6 μg/kg)組各10只。于造模結(jié)束1 h后每天腹腔注射GM1,連續(xù)1 w,GM1+LY294002組為GM1治療小鼠同時每天接受腹腔注射LY294002持續(xù)1 w,Sham組和Model組腹腔注射等量生理鹽水。

1.5NDS評價小鼠神經(jīng)功能 NDS得分范圍:0～1分:自主活動,四肢對稱運動,前爪伸出;2～3分:攀爬,身體本體感覺和對觸感觸摸的反應(yīng)。由兩位研究者參與實驗,采用雙盲法分別對實驗小鼠進行評分和記錄。

1.6HE染色檢測組織病理損傷 將新鮮腦組織使用4%多聚甲醛溶液固定,石蠟包埋,制成4 μm厚度切片后進行乙醇梯度脫水,依次經(jīng)二甲苯溶液和梯度乙醇溶液進行脫蠟處理,蘇木素染色5 min伊紅染色1 min,在梯度濃度乙醇溶液中依次浸泡10 s,二甲苯溶液浸泡1 min,通風(fēng)櫥風(fēng)干,中性樹脂封片,通過玻掃儀采集圖片并觀察肺組織病理變化。

1.7尼氏染色檢測腦神經(jīng)損傷 將新鮮腦組織使用10%中性甲醛溶液固定48 h,結(jié)束后常規(guī)脫水包埋、脫蠟,結(jié)束后使用蒸餾水進行沖洗,后將腦組織切片置于甲苯胺藍色染液,50～60 ℃浸染30 min左右,染色結(jié)束后使用蒸餾水緩緩沖洗,然后使用70%乙醇溶液沖洗,95%乙醇迅速分化。分化完畢后無水乙醇迅速脫水,二甲苯透明,中性樹膠進行固定封片,最后倒置顯微鏡下觀察、拍照。

1.8Western印跡檢測相關(guān)蛋白表達 加入蛋白樣品與蛋白marker,待樣品到達膠板底部時,結(jié)束電泳;將裁剪好的聚偏氟乙烯(PVDF)膜用甲醇激活,根據(jù)目的蛋白所在位置切膠,200 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h;封閉:將PVDF膜夾出放入牛奶中,室溫慢搖孵育1 h;一抗孵育:取出PVDF膜,用TBST洗滌3次,5 min/次,放入對應(yīng)的一抗盒,4 ℃慢搖過夜;二抗孵育:取出PVDF膜,用TBST洗滌3次,10 min/次,放入二抗盒,室溫慢搖1 h,再用TBST洗滌3次,10 min/次;顯影:吸干PVDF膜表面TBST后放置在顯影機里,表面均勻涂抹顯影液,開始曝光。

1.9腦組織中IL-6、TNF-α、IL-1β 檢測 造模結(jié)束后,將各組新鮮小鼠腦組織取出并使用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗,沖洗完畢后使用眼科手術(shù)剪將腦組織剪碎,隨后將剪碎的組織使用組織勻漿器進行充分勻漿,3 000 r/min離心15 min,離心結(jié)束后取上清,按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒說明書步驟進行IL-6、TNF-α、IL-1β 水平檢測。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析 采用Graphpad Prism6作圖,采用SPSS24.0軟件進行非配對t檢驗、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組神經(jīng)功能比較 與Sham組〔(15.20±1.26)分〕相比,Model組、GM1組和GM1+LY294002組NDS〔(6.90±0.71)、(11.30±1.05)、(9.50±0.93)分〕明顯降低(P<0.05);與Model組相比,GM1組NDS明顯升高(P<0.05);與GM1組相比,GM1+LY294002組NDS明顯降低(P<0.05)。

2.2各組腦組織病理學(xué)觀察 與Sham組相比,Model組、GM1組和GM11+LY294002組腦組織病理明顯增多;與Model組相比,GM1組腦組織病理損傷得到緩解,與GM1組相比,GM1+LY294002組腦損傷又出現(xiàn)一定程度的加重。見圖1。

2.3各組腦神經(jīng)尼氏染色結(jié)果 Sham組神經(jīng)細胞較多并且完整。與Sham組相比,Model組的神經(jīng)元細胞損傷較為嚴重;與Model組相比,GM1組腦神經(jīng)細胞的損傷得到較大的緩解,但GM1組相比 GM1+LY294002組的腦神經(jīng)損傷又明顯增多。見圖2。

2.4各組腦組織中的炎癥因子檢測 與Sham組相比,Model組IL-1β、 IL-6、TNF-α 水平明顯升高(P<0.05);與Model組相比,GM1組IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯降低(P<0.01);與GM1組相比,GM1+LY294002組IL-1β、IL-6、TNF-α 水平明顯升高(P<0.01)。見表1。

圖1 各組腦組織(HE染色,×300)

圖2 各組神經(jīng)元細胞(尼氏染色,×400)

表1 各組腦組織內(nèi)IL-6、TNF-α、IL-1β水平 比較

2.5各組腦組織內(nèi)相關(guān)蛋白表達 與Sham組相比,Model組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、Bcl-2 表達明顯下調(diào),Bax、裂解的胱天蛋白酶(cleaved caspase)-3、p-GSK3β蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.05);與Model組相比,GM1治療組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、Bcl-2 蛋白表達明顯上調(diào),Bax、cleaved caspase-3、p-GSK3β蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.01);與GM1組相比,GM1+LY294002組Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達明顯下降,p-GSK3β、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達明顯上調(diào)(均P<0.01)。見圖3、表2。

圖3 各組相關(guān)蛋白表達

表2 各組相關(guān)蛋白表達

3 討 論

自發(fā)性腦內(nèi)出血是最具破壞性的腦卒中類型,占所有腦卒中類型的15%以上,是全球發(fā)病率、死亡率和殘疾的主要原因〔13〕。腦出血后的原發(fā)性腦損傷往往是由出血和血腫生長引起的,血腫生長導(dǎo)致鄰近腦血管結(jié)構(gòu)受壓、顱內(nèi)壓升高和腦血屏障(BBB)破壞,隨后,破裂血管滲出的血液成分和降解產(chǎn)物觸發(fā)了一系列復(fù)雜的炎癥和凋亡途徑。最終,周圍區(qū)域的神經(jīng)元發(fā)生凋亡,神經(jīng)功能惡化〔14,15〕。盡管對腦出血后腦損傷的病理生理機制的研究已經(jīng)得到了很大的進步,但目前還沒有有效的腦出血損傷治療方法〔16〕。因此,尋找有效的腦出血神經(jīng)保護劑,能夠拮抗有害的生物化學(xué)和分子信號通路或增強保護通路被認為是治療腦出血的主要有前途的策略。

GM1可以穩(wěn)定地與細胞膜結(jié)合,并通過影響膜的功能來提高膜中的酶活性〔17〕。動物實驗表明,GM1可以改善帕金森病引起的行為障礙〔18〕。臨床上,GM1廣泛用于恢復(fù)各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙,其作用機制涉及促進神經(jīng)重建(神經(jīng)再生),如神經(jīng)細胞存活〔19〕、軸突生長和突觸生長〔20,21〕等。本研究提示,在GM1 的治療下小鼠的神經(jīng)功能有了明顯的改善,GM1在保護急性腦出血小鼠的腦組織病理進程中也發(fā)揮了重要作用,GM1對于神經(jīng)細胞有良好的保護作用,絲氨酸-蘇氨酸激酶AKT可被PI3K磷酸化,在多種生理和發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用,包括炎癥和細胞凋亡〔22〕?；罨腁KT調(diào)節(jié)存活和凋亡途徑的幾個下游靶點以抑制細胞凋亡,包括抑制神經(jīng)元和非神經(jīng)元細胞中GSK3β的活性。激活的GSK3β可進一步加重細胞損傷,并增加cleaved caspase3活性,這是細胞凋亡執(zhí)行階段的早期步驟〔23〕。此外有報道提出,通過激活A(yù)KT/GSK3β信號通路對蛛網(wǎng)膜下腔出血表現(xiàn)出神經(jīng)保護作用〔24〕。本研究結(jié)果表明,在急性腦出血模型中p-PI3K /PI3K和p-AKT/AKT的蛋白水平是被抑制的,這造成了下游p-GSK3β/GSK3β蛋白水平的升高,在使用GM1治療之后可以有效回調(diào)這條通路上蛋白水平的改變,表明GM1發(fā)揮對神經(jīng)細胞凋亡損傷的機制很可能就是通過PI3K/AKT/GSK3β來實現(xiàn)的,而用PI3K抑制劑LY294002對給予GM1治療的小鼠進行處理,發(fā)現(xiàn)相對于GM1組,小鼠的神經(jīng)功能損傷又加重了,GM組GM1+LY294002組促凋亡蛋白也出現(xiàn)了一定程度升高,抗凋亡蛋白出現(xiàn)一定程度減少。

綜上,GM1能夠有效保護急性腦出血小鼠導(dǎo)致的神經(jīng)功能損傷,其作用機制可能與調(diào)控PI3K/AKT/GSK3β信號通路有關(guān)。