范昌文 ,李欣 ,徐明 ,楊磊* ,付卓銳 ,莫開(kāi)林*

1.東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040；

2.涼山州林業(yè)調(diào)查規(guī)劃設(shè)計(jì)院,四川 西昌 615000；

3.四川省林業(yè)科學(xué)研究院,四川 成都 610081

槐角是豆科喬木植物槐（Styphnolobium japonicum）的莢果，成熟后經(jīng)過(guò)炮制可入藥，具有清熱涼血之功效，常用于腸熱便血，眩暈?zāi)砍嗟劝Y狀，因此被收錄于2020 年版本的《中國(guó)藥典》[1]。化學(xué)成分研究表明槐角中含有豐富的異黃酮類物質(zhì)，如染料木苷和槐角苷等[2]，異黃酮被人們認(rèn)為是植物雌激素，具有預(yù)防骨質(zhì)疏松和心腦血管病變，抗癌等功效[3]。在已有的研究報(bào)道中，異黃酮類物質(zhì)提取的方法有回流提取法、亞臨界水提取法、加壓溶劑提取等方法[4,5]，但都存在提取效率低、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、操作成本高等缺點(diǎn)。因此，尋找高效的具有工業(yè)化前景的提取槐角中的染料木苷與槐角苷的工藝研究勢(shì)在必行。

勻漿是通過(guò)高速運(yùn)轉(zhuǎn)的刀片和流體切割的作用，在勻漿裝置中將物料與提取溶劑混合，將物料粉碎。勻漿還有助于將樣品與萃取溶劑徹底混合，因此萃取溶劑可以更好地滲透到樣品中，讓物料的破碎與提取同步進(jìn)行，強(qiáng)化提取效率。該方法以往經(jīng)常用于在動(dòng)物組織中提取蛋白質(zhì)[6]、氨基酸[7]等成分，由于它操作簡(jiǎn)單，還省去了粉碎的步驟，同時(shí)還能避免粉塵的出現(xiàn)，因此對(duì)于植物材料的提取也有很大的適用價(jià)值[8]。作為一種常用的提取方法，超聲輔助提取的優(yōu)點(diǎn)是提取效率高，而且易于工業(yè)放大。超聲波產(chǎn)生的振動(dòng)效應(yīng)和空化效應(yīng)，使異黃酮等胞內(nèi)物質(zhì)釋放、溶解和擴(kuò)散速度加快，從而使提取效率明顯提高[9-12]。嘗試采用勻漿-超聲協(xié)同提取法從槐角中同時(shí)提取染料木苷與槐角苷，為槐角進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供一定的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

槐角購(gòu)于大西北藥業(yè)有限責(zé)任公司，室溫下避光儲(chǔ)存在密閉玻璃干燥器內(nèi)，所有用到的槐角原料均來(lái)自同一批次。對(duì)照品染料木苷（純度≥98%）、槐角苷（純度≥98%）從阿拉丁（中國(guó)上海）生化科技股份有限公司購(gòu)入，色譜級(jí)甲醇和磷酸從塞莫非世爾科技（中國(guó)）有限公司購(gòu)入，乙醇從天力（中國(guó)天津）化學(xué)試劑有限公司購(gòu)入。1260 高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；JY92-IID 超聲波細(xì)胞破碎儀，上海熙揚(yáng)儀器有限公司；多功能破壁機(jī)，中山市今彩電器廠。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 高效液相色譜定量測(cè)定的條件

染料木苷和槐角苷分別采用高效液相色譜法測(cè)定，儀器為安捷倫Agilent1260 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司），安捷倫色譜柱，型號(hào)為Agilent 5 TCC18，填料粒徑5 μm，柱長(zhǎng)度250 mm，直徑4.6 mm，色譜條件：流動(dòng)相比例為甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液，洗脫梯度為：0—2 min，10%A；2—13 min，10%A—60%A；13—15 min，60%A—85%A；15—20 min，85%A；20—21 min，85%A—10%A；21—25 min，10%A。洗脫流速是1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)是262 nm，柱溫是30 ℃，檢測(cè)總運(yùn)行時(shí)間是25 min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

分別配置0.1，0.2，0.4，0.5，0.75，0.85 和1 mg·mL-1染料木苷對(duì)照品溶液與0.067，0.133，0.200，0.267，0.333，0.400 和0.667 mg·mL-1的槐角苷對(duì)照品溶液。對(duì)上述對(duì)照品按順序分別取10μL 的溶液分別進(jìn)樣，將每個(gè)濃度重復(fù)3 次，得回歸方程?；貧w方程經(jīng)線性擬合后得到為：

式中：X 為對(duì)照品濃度(mg·mL-1)，YA、YB分別為染料木苷和槐角苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液對(duì)應(yīng)的峰面積。

2.3 樣品中染料木苷和槐角苷的含量測(cè)定

稱取槐角原料5 g，加入乙醇溶液后一同放入勻漿機(jī)里勻漿處理一段時(shí)間，之后再將溶液超聲處理。超聲結(jié)束后，對(duì)提取液進(jìn)行減壓抽濾，取上清液1 ml，加甲醇稀釋10 倍，再取稀釋溶液2 ml，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，HPLC 檢測(cè)得到稀釋溶液樣品中染料木苷與槐角苷的峰面積，將其帶入回歸方程，得到染料木苷和槐角苷的濃度。兩種目標(biāo)成分得率計(jì)算公式：

式中：Y 為提取產(chǎn)物染料木苷或槐角苷的得率(mg·g-1)，c 為稀釋溶液濃度(mg·mL-1)，v 為稀釋溶液的體積(mL)，m 為加入的槐角的質(zhì)量(mg)。

2.4 勻漿-超聲協(xié)同提取染料木苷和槐角苷

精密稱取槐角原料5 g，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液后放入勻漿機(jī)中在特定的勻漿速率下勻漿處理一段時(shí)間后，將溶液轉(zhuǎn)移到燒杯中，之后放入超聲提取儀中進(jìn)行超聲處理，反應(yīng)結(jié)束后，再將提取液減壓抽濾，之后從上清液中吸取1 mL,用甲醇稀釋10 倍，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾后，進(jìn)行HPLC 檢測(cè)。在其他條件不變的前提下，分別改變乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、勻漿時(shí)間、勻漿速率、超聲時(shí)間、超聲功率、超聲空化時(shí)間、超聲緩沖時(shí)間這些因素，確定最佳提取方案。

3 結(jié)果與討論

3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

以乙醇為提取溶劑，在液料比20 mL·g-1，勻漿時(shí)間3 min，勻漿速率22 000 r·min-1，超聲時(shí)間30 min，超聲功率250 W，超聲空化時(shí)間2 s，超聲間隔時(shí)間2 s 的條件下，選取乙醇溶液濃度0%，10%，30%，50%，70%和90%進(jìn)行勻漿-超聲協(xié)同提取單因素試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1 可以看出，染料木苷、槐角苷的得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，逐漸變大，推測(cè)是因?yàn)殡S著有機(jī)溶劑濃度升高，溶劑的極性逐漸降低，染料木苷和槐角苷根據(jù)相似相溶原理，溶解量增加所致。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，二者得率達(dá)到最大，之后略有下降，可能是因?yàn)槿軇舛冗^(guò)高，脂溶性變大，導(dǎo)致物料中油脂成分析出，使目標(biāo)產(chǎn)物的溶解量相對(duì)減少。因此選擇50%的乙醇作為最佳溶液濃度。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響Fig.1 Effects of ethanol volume fraction on the yield of genistin and sophoricoside

3.2 液料比的影響

在其他提取條件不變的情況下，選擇液料比10，15，20，25 和30 mL·g-1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示，染料木苷、槐角苷的得率隨著液料比增大而逐漸變大，當(dāng)液料比超過(guò)20 mL·g-1時(shí)，得率不再有顯著增長(zhǎng)，因此為了節(jié)約原料，降低成本，選擇20 mL·g-1作為最佳液料比。

圖2 液料比的影響Fig.2 Effects of liquid-solid ratio on the yield of genistin and sophoricoside

3.3 勻漿時(shí)間的影響

其他條件不變，選擇勻漿時(shí)間分別為1，2，3，4 和5 min 進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，兩個(gè)目標(biāo)產(chǎn)物的得率隨著勻漿時(shí)間的增加而變大，這是因?yàn)閯驖{時(shí)間越長(zhǎng)，物料粉碎效果越好，促進(jìn)了槐角異黃酮苷的釋放和溶解。當(dāng)勻漿時(shí)間增加到3 min 時(shí)，得率增加趨勢(shì)趨于平緩，說(shuō)明粉碎程度已經(jīng)接近最好，因此選擇3 min 作為最佳勻漿時(shí)間。

圖3 勻漿時(shí)間的影響Fig.3 Effects of homogenate time on the yield of genistin and sophoricoside

3.4 勻漿速率的影響

在其他條件不變下，選擇勻漿速率分別為19 000，21 000，22 000，22 600 和23 400 r·min-1進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4 所示，隨著勻漿速率的增大，兩個(gè)目標(biāo)產(chǎn)物的得率逐漸增大，因?yàn)閯驖{速率越大，物料的粉碎越快，粉碎程度越好。當(dāng)速率超過(guò)22 000 r·min-1，得率幾乎不再有明顯變化，因此選擇22 000 r·min-1作為最佳勻漿速率。

圖4 勻漿速率的影響Fig.4 Effects of homogenate speed on the yield of genistin and sophoricoside

3.5 超聲時(shí)間的影響

為考察超聲時(shí)間對(duì)提取效率的影響，選擇超聲時(shí)間分別為20，25，30，35 和40 min，其他提取參數(shù)不變，進(jìn)行勻漿-超聲協(xié)同提取單因素試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖五能夠看出，在20—35 min 時(shí)，染料木苷與槐角苷得率迅速升高，當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)35 min 時(shí)，得率基本持平，說(shuō)明超聲波促進(jìn)了目標(biāo)產(chǎn)物在溶劑中的釋放和溶解，但當(dāng)釋放達(dá)到一定的峰值時(shí)，超聲時(shí)間再延長(zhǎng)也不會(huì)對(duì)提取效率產(chǎn)生明顯影響。因此選擇35 min 作為最佳超聲時(shí)間。

圖5 超聲時(shí)間的影響Fig.5 Effects of ultrasonic time on the yield of genistin and sophoricoside

3.6 超聲功率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，液料比20 mL·g-1，勻漿時(shí)間3 min，勻漿速率22 000 r·min-1，超聲時(shí)間35 min，超聲空化時(shí)間2 s，超聲間隔時(shí)間2 s 的條件下，選擇超聲功率分別為200，250，300，350 和400 W 進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。從圖六能夠看出，兩個(gè)目標(biāo)產(chǎn)物的得率隨著超聲功率的增大而逐漸增加，當(dāng)功率達(dá)到350 w 后，得率達(dá)到最大，之后功率繼續(xù)增大，得率則趨于穩(wěn)定，所以選擇350 W作為最佳超聲功率。

圖6 超聲功率的影響Fig.6 Effects of ultrasonic power on the yield of genistin and sophoricoside

3.7 空化時(shí)間和緩沖時(shí)間的影響

在其他條件如3.6 中一樣時(shí)，控制不同的超聲空化時(shí)間(1.0—3.0 s)和超聲緩沖時(shí)間(0.5—2.5 s)，不同超聲空化時(shí)間的產(chǎn)物得率的影響如圖7 所示，兩個(gè)目標(biāo)產(chǎn)物隨著超聲空化時(shí)間的增加，其得率逐漸增加，推測(cè)是因?yàn)榭栈瘯r(shí)間越長(zhǎng)，有效超聲的時(shí)間則越長(zhǎng)，目標(biāo)產(chǎn)物的溶解和擴(kuò)散越快。當(dāng)超聲空化時(shí)間超過(guò)2.5 s 時(shí)，得率不再有明顯變化，考慮到能耗的因素，因此選擇2.5 s 作為最佳超聲空化時(shí)間。

圖7 空化時(shí)間的影響Fig.7 Effects of cavitation time on the yield of genistin and sophoricoside

圖8 顯示了不同緩沖時(shí)間的染料木苷和槐角苷得率的影響，從圖8 能夠看出，緩沖時(shí)間從0.5 s 增長(zhǎng)到1.5 s 時(shí)，兩種槐角異黃酮苷的得率相似，之后緩沖時(shí)間再增長(zhǎng)，得率開(kāi)始下降，由于不間斷長(zhǎng)時(shí)間工作容易形成空載，使儀器壽命縮短。所以從保護(hù)儀器，減少能耗的角度考慮，選擇1.5 s 為最佳超聲緩沖時(shí)間。

圖8 超聲間隔時(shí)間的影響Fig.8 Effects of buffer time on the yield of genistin and sophoricoside

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)選用乙醇作為提取溶劑，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)得到勻漿-超聲協(xié)同提取染料木苷與槐角苷的最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，液料比20 mL·g-1，勻漿時(shí)間3 min，勻漿速率22 000 r·min-1，超聲時(shí)間35 min，超聲功率350 W，超聲空化時(shí)間2.5 s，超聲緩沖時(shí)間1.5 s。此工藝下染料木苷和槐角苷的得率分別為33.70 mg·g-1和95.02 mg·g-1。勻漿-超聲協(xié)同提取法具有環(huán)保、穩(wěn)定和高效的優(yōu)勢(shì)，具有較好的應(yīng)用前景。