姜文艷, 徐佳鈺, 崔艷美, 王 娟

(北京工業(yè)大學(xué) 環(huán)境與生命學(xué)部,北京 100124)

自噬是一種高度保守的細(xì)胞降解過(guò)程[1].在自噬過(guò)程中,細(xì)胞質(zhì)成分被隔離在稱(chēng)為自噬體的雙膜囊泡中,并被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體或液泡中進(jìn)行降解[2].自噬可以以非選擇性和選擇性的方式發(fā)生[3],選擇性自噬包括細(xì)胞質(zhì)到液泡靶向途徑(cytoplasmic to vacuolar targeting pathway,CVT)、過(guò)氧化物酶體自噬、線(xiàn)粒體自噬等.酵母中的遺傳篩選鑒定自噬相關(guān)基因揭示了自噬過(guò)程的分子機(jī)制.迄今已鑒定出40多種自噬相關(guān)蛋白(autophagy-related protein,Atg),有19種直接參與了饑餓誘導(dǎo)的自噬體的生物發(fā)生.自噬對(duì)于維持能量平衡和保護(hù)細(xì)胞免受壓力至關(guān)重要,在發(fā)育和傳染病、神經(jīng)變性和癌癥等疾病中起著重要作用[4-5].

Hrr25是釀酒酵母中I型酪蛋白激酶家族成員,具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性.Hrr25蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域可分為N-端激酶結(jié)構(gòu)域(氨基酸1～290)和“中心域”(氨基酸290～394),以及C-端脯氨酸/富含谷氨酰胺的結(jié)構(gòu)域[6].其可以定位于細(xì)胞核、內(nèi)吞部位、芽頸、紡錘體和高爾基體等[7-11].最初研究發(fā)現(xiàn) Hrr25可以參與DNA修復(fù)及影響細(xì)胞分裂,隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)Hrr25通過(guò)與多種蛋白的相互作用參與自噬[12-18]、囊泡運(yùn)輸[19]、鈣離子調(diào)節(jié)[20]、弱有機(jī)酸脅迫途徑[21]、核糖體生物發(fā)生[22-26]、微管組裝[27]等多個(gè)細(xì)胞過(guò)程,對(duì)于釀酒酵母維系自身穩(wěn)態(tài)、應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力至關(guān)重要.在選擇性自噬過(guò)程中,Hrr25可以磷酸化選擇性受體Atg19,Atg34和Atg36影響與支架蛋白Atg11的相互作用,從而調(diào)控選擇性自噬的發(fā)生.而在饑餓誘導(dǎo)的非選擇性自噬過(guò)程過(guò)程中,Hrr25可以磷酸化COPⅡ衣被蛋白Sec24,而調(diào)節(jié)自噬體的數(shù)量以及與Atg9 C端的相互作用[28-29].雖然現(xiàn)在關(guān)于Hrr25在自噬中的作用和作用機(jī)制的研究已有一些重要進(jìn)展,但Hrr25在自噬過(guò)程中還有哪些尚未鑒定的新底物參與仍有待研究.本研究通過(guò)質(zhì)譜篩選釀酒酵母中Hrr25在自噬中新的相互作用蛋白,為解析Hrr25調(diào)控自噬的分子機(jī)制,準(zhǔn)確認(rèn)識(shí)Hrr25與自噬的關(guān)系,深入了解自噬調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供新信息.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 釀酒酵母菌株

MATaura3-1-his3-i1,15trp1-1-1lev2-3,112ade2-1can1-100

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

Phanta Max Super-fidelity DNA Polymerase(南京諾唯贊生物股份科技有限公司),FastDigest XhoⅠ,FastDigestBamHⅠ,FastDigestNcoI(Thermo Fisher Scientific),Clon Express One Step Cloning Kit(南京諾唯贊生物科技公司),DH-5α感受態(tài)細(xì)胞(北京天根生物科技有限公司),T3 Super PCR Mix(北京擎科生物科技有限公司),瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、快速質(zhì)粒小提試劑盒(北京天根生物科技有限公司).引物序列由北京擎科生物科技有限公司合成,其引物序列如表1.

表1 引物序列Tab.1 Primer Sequence

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

使用pRS305-Hrr25(+145～+1482)正向及pRS305-Hrr25(+145～+1482)反向引物以及酵母基因組為模板調(diào)取目的基因片段,同時(shí)使用XhoⅠ和BamHⅠ酶切載體.將PCR調(diào)取的核酸片段及酶切后的載體進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳及核酸片段回收.核酸片段回收后進(jìn)行同源重組,并將同源重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH-5α感受態(tài)細(xì)胞中,待單克隆在含有抗性的培養(yǎng)基中長(zhǎng)出,挑取單克隆,進(jìn)行PCR驗(yàn)證.驗(yàn)證出陽(yáng)性菌株后提取質(zhì)粒并送測(cè)序.

1.2.2 菌株的構(gòu)建

將構(gòu)建好的pRS305-Hrr25-13MYC質(zhì)粒使用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI線(xiàn)性化處理,將線(xiàn)性化后的核酸片段通過(guò)酵母轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入到酵母菌株中.將轉(zhuǎn)化處理后的菌株涂在篩選培養(yǎng)板SC-Leu上,待單克隆長(zhǎng)出后進(jìn)行菌落PCR和Western Blot驗(yàn)證.

1.2.3 質(zhì)譜樣品制備

收集生長(zhǎng)期的菌株100 OD(光密度,optical density,OD),在SD-N培養(yǎng)基中饑餓處理4 h.對(duì)應(yīng)的收集生長(zhǎng)期的菌株100 OD不做饑餓處理.然后再次收集菌株并用蝸牛酶處理菌株獲得原生質(zhì)體.將原生質(zhì)體重新懸浮在1 000 μL的裂解緩沖液(25 mmol/L tris-HCl,pH 7.4,150 mmol/L NaCl,1 % triton X-100,1 mmol/L EDTA,5 %甘油,蛋白酶抑制劑)中,冰上孵育10 min設(shè)置條件為12 000 r/min,4 ℃離心10 min.取上清到新的離心管中,即獲得蛋白樣品.將獲得的蛋白樣品先與Myc抗體在室溫孵育1 h,然后再與磁珠室溫孵育1 h.用TBST清洗磁珠4～5次后加入2×SDS-PAGE Loading Buffer,100 ℃金屬浴煮10 min.然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,待樣品跑到分離膠1 cm處,停止電泳.用考馬斯亮藍(lán)對(duì)膠塊染色1 h,脫色液脫色.膠塊寄送北京蛋白質(zhì)組研究中心進(jìn)行LC-MS/MS分析.樣品使用Orbitrap Fusion質(zhì)譜儀搭載easy-nLC 1000 nanoflow高效液相色譜系統(tǒng),設(shè)置質(zhì)譜參數(shù)如下:Orbitrap 掃描的自動(dòng)獲得控制目標(biāo)(automatic gain control target,AGC target)為5×105,最大注入時(shí)間50 ms,MS/MS二級(jí)掃描AGC target為5×103,最大注入時(shí)間35 ms,動(dòng)態(tài)排除設(shè)定18 s.

1.2.4 與Hrr25相互作用蛋白篩選

將不同條件下質(zhì)譜篩選出的蛋白輸入韋恩圖制作軟件Venny 2.1,得出在誘導(dǎo)自噬條件下特異與Hrr25相互作用的蛋白.

1.2.5 基因本體論(GO)功能分析和京都基因和基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集分析

將所得到的誘導(dǎo)自噬特異性表達(dá)基因?qū)隓avid數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)進(jìn)行GO的生物過(guò)程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、細(xì)胞組分(cell component,CC)及KEGG通路富集分析,并將結(jié)果可視化.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

構(gòu)建pRS305-HRR25-13MYC質(zhì)粒,HRR25選擇的基因片段為+145～+1 482.用合成的引物pRS305～Hrr25(+145～+1 482)-Forward及pRS305-Hrr25(+145～+1 482)-Reverse以酵母基因組為模板進(jìn)行PCR,調(diào)取所需核酸片段.如圖1a核酸片段從酵母全基因組上調(diào)取出來(lái),大小為1 391 bp.然后利用同源重組的方法將調(diào)取的核酸片段與載體結(jié)合,并熱激轉(zhuǎn)化到DH5α細(xì)胞.利用菌落PCR和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)單克隆菌株確定陽(yáng)性菌株,質(zhì)粒的陽(yáng)性菌株P(guān)CR結(jié)果預(yù)計(jì)陽(yáng)性大小1 391 bp,如圖1b獲得陽(yáng)性菌株,陽(yáng)性結(jié)果條帶大小與預(yù)計(jì)大小一致.進(jìn)一步將陽(yáng)性單克隆菌株提取質(zhì)粒并進(jìn)行DNA測(cè)序確定質(zhì)粒構(gòu)建成功.

a.調(diào)取HRR25基因核酸片段,核酸片段大小為1 391 bp;b.pRS305-HRR25-13MYC-ADH1 terminator質(zhì)粒構(gòu)建驗(yàn)證,PCR陽(yáng)性結(jié)果1 391 bp.圖1 質(zhì)粒構(gòu)建Fig.1 Plasmid Construction

2.2 酵母菌株構(gòu)建

以W303菌株為模式菌株,制備可以表達(dá) Hrr25-13Myc蛋白的釀酒酵母菌株.首先用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI線(xiàn)性化pRS305-Hrr25(+145～+1 482)-13MYC-ADH1 terminator質(zhì)粒,并通過(guò)酵母轉(zhuǎn)化將線(xiàn)性化的pRS305-HRR25(+145～+1 482)-13MYC-ADH1 terminator核酸片段轉(zhuǎn)入到酵母菌株中.由于pRS305質(zhì)粒上所帶的篩選標(biāo)記為L(zhǎng)EU2,所以將轉(zhuǎn)化好的酵母菌株涂布在SC-Leu營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆.待單克隆在篩選培養(yǎng)基SC-Leu中長(zhǎng)出,挑取單克隆在分子水平和蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證.在分子水平使用引物Hrr25-+62正向引物和pRS305-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證,陽(yáng)性菌株P(guān)CR大小為1 444 bp.如圖2a所示,驗(yàn)證出陽(yáng)性菌株.驗(yàn)證出的陽(yáng)性菌株,再對(duì)加入標(biāo)簽后的目的基因序列進(jìn)行酵母PCR并送測(cè)序,確認(rèn)標(biāo)簽正確加到目的基因位置.在蛋白水平上,將PCR驗(yàn)出的陽(yáng)性菌株在SC-Leu液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),并提取蛋白質(zhì)進(jìn)行Western Blot驗(yàn)證,用Myc抗體進(jìn)行孵育.如圖2b所示,結(jié)果與陰性對(duì)照對(duì)比Myc標(biāo)簽融合蛋白基因已成功整合到菌株基因組并成功表達(dá),即表達(dá)Hrr25-13Myc蛋白的菌株構(gòu)建成功.

圖2 表達(dá)Hrr25-13Myc菌株分子(a)和蛋白水平驗(yàn)證(b)Fig.2 Molecular(a)and Protein(b)Level Validation of Hrr25-13Myc Strain

2.3 免疫沉淀聯(lián)合質(zhì)譜篩選和鑒定與Hrr25相互作用蛋白

圖3 Hrr25相互作用蛋白韋恩圖Fig.3 Venny Diagram of Hrr25 Interacting Protein

為了找出與Hrr25相互作用影響自噬的蛋白,以成功表達(dá)Hrr25-13Myc蛋白的菌株為模式生物進(jìn)行實(shí)驗(yàn).首先對(duì)表達(dá)Hrr25-13Myc蛋白的菌株進(jìn)行不同的處理,一組菌株進(jìn)行饑餓處理誘導(dǎo)自噬,對(duì)應(yīng)的另一組菌株不進(jìn)行饑餓處理.然后利用免疫沉淀的方法,用Myc抗體以Hrr25-13Myc為靶蛋白進(jìn)行免疫沉淀,分別從饑餓和非饑餓處理后菌株中將Hrr25及其相互作用的蛋白沉淀下來(lái).蛋白樣本制備完成后,先用蛋白免疫印記實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證確認(rèn)Hrr25-13Myc靶蛋白沉淀下來(lái),然后再將免疫沉淀的樣品進(jìn)行SDS-PAGE并用考馬斯亮藍(lán)染色后送質(zhì)譜檢測(cè).質(zhì)譜結(jié)果去除置信度較低的一批蛋白后,在非饑餓條件下鑒定出1 869種候選蛋白,在饑餓條件下鑒定出1 838種候選蛋白.將2種狀態(tài)下與Hrr25相互作用的蛋白,運(yùn)用Venny 2.1繪制韋恩圖.如圖3所示,只在非誘導(dǎo)自噬條件下與Hrr25相互作用的候選蛋白有352種,只在誘導(dǎo)自噬條件下與Hrr25相互作用的候選蛋白有321種,在2種狀態(tài)下都與Hrr25相互作用的候選蛋白有1 518種.

2.4 Hrr25的互作蛋白功能分析

對(duì)在自噬誘導(dǎo)條件下特異與Hrr25相互作用的321種蛋白進(jìn)行分析.通過(guò)David數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這321種蛋白進(jìn)行GO和KEGG富集分析.GO分析可以通過(guò)將差異基因或蛋白進(jìn)行富集分析后統(tǒng)計(jì)顯著富集的區(qū)域,對(duì)321種蛋白進(jìn)行GO分析可顯示其在分子功能、生物過(guò)程和細(xì)胞組成中的分類(lèi).根據(jù)P<0.05,GO富集共得到23項(xiàng)生物過(guò)程(biological process,BP),主要涉及CVT途徑、高爾基囊泡內(nèi)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄、糖異生負(fù)調(diào)控蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn),自噬前體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)定位等.16項(xiàng)細(xì)胞組成(cellular component,CC)相關(guān)主要涉及高爾基膜,高爾基轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體,過(guò)氧化物酶體,自噬前體結(jié)構(gòu),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡等.21項(xiàng)分子功能(molecular function,MF)主要涉及蛋白質(zhì)異二聚活性、氧化還原酶活性、DNA結(jié)合、蛋白質(zhì)復(fù)合物支架等.如圖4所示,選擇P值排名前10的生物過(guò)程、細(xì)胞組成、分子功能進(jìn)行可視化.在富集的生物過(guò)程中,CVT途徑排名最靠前,富集到11種候選蛋白其中包括自噬相關(guān)蛋白:Atg9,Atg27,Atg3,Atg4,Atg11,保守寡聚高爾基體(conserved oligomeric golgi,COG)復(fù)合物亞基:Cog1,Cog5,Cog6,Cog7,Cog8,SNARE(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)蛋白Vam7.

圖4 GO富集分析結(jié)果Fig.4 Analysis Results of GO Enrichment

對(duì)321種蛋白進(jìn)行KEGG富集分析.根據(jù)P<0.05,KEGG富集共得到14條通路.如圖5所示,其中主要包括自噬、過(guò)氧化物酶體、碳代謝、檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))、不匹配修復(fù)、抗壞血酸和醛酸代謝、基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子、氨基酸代謝等.

圖5 KEGG富集分析結(jié)果Fig.5 Analysis Results of KEGG Enrichment

3 討 論

自噬是細(xì)胞中一種進(jìn)化保守的生物學(xué)過(guò)程,可以通過(guò)降解受損的細(xì)胞器和多余的蛋白質(zhì)使細(xì)胞在應(yīng)激損傷時(shí)能夠維持正常的平衡.Hrr25作為壓力應(yīng)對(duì)型激酶在自噬過(guò)程中發(fā)揮多種作用.為了篩選Hrr25在自噬中的相互作用蛋白,首先構(gòu)建了可以整合到酵母基因組上的pRS305-Hrr25-(+145～+1482)-13Myc質(zhì)粒,并使用構(gòu)建好的質(zhì)粒構(gòu)建出表達(dá)Hrr25-13Myc蛋白的酵母菌株;待構(gòu)建好的酵母菌株培養(yǎng)到生長(zhǎng)期,分成2組,一組進(jìn)行饑餓誘導(dǎo)自噬,另一組正常培養(yǎng);用Myc抗體以Hrr25-13Myc為靶蛋白進(jìn)行免疫沉淀,將免疫沉淀的樣品進(jìn)行SDS-PAGE,并用考馬斯亮藍(lán)染色后送質(zhì)譜檢測(cè).

LC-MS/MS結(jié)果去除置信度較低的一批蛋白后,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在非饑餓條件處理菌株中鑒定出1 869種蛋白與Hrr25-13Myc存在相互作用,在饑餓條件處理菌株中鑒定出1 838種蛋白與Hrr25-13Myc存在相互作用.利用韋恩圖找出差異性蛋白321種.對(duì)321種差異蛋白質(zhì)進(jìn)行GO分析,在生物過(guò)程中主要涉及CVT途徑、高爾基囊泡內(nèi)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄、糖異生負(fù)調(diào)控蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn),自噬前體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)定位等.其中在CVT途徑中,富集到11種候選蛋白Atg9,Atg27,Atg3,Atg4,Atg11,Cog1,Cog5,Cog6,Cog7,Cog8,Vam7.并且通過(guò)KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)相互作用的蛋白在自噬通路中發(fā)揮作用.

在自噬過(guò)程中,Atg9是核心Atg蛋白中唯一的跨膜蛋白,可以定位于前自噬結(jié)構(gòu)(pre-autophagosomal structure,PAS)和線(xiàn)粒體附近的外圍結(jié)構(gòu),以循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)方式在自噬體的形成過(guò)程中對(duì)隔離膜的擴(kuò)張起著關(guān)鍵作用[30],在饑餓時(shí),Atg9可以結(jié)合到高爾基復(fù)合體和線(xiàn)粒體網(wǎng)近端的外圍結(jié)構(gòu)的一個(gè)稱(chēng)為Atg9囊泡的囊泡中,并且在Atg11,Atg23,Atg27和Atg41的幫助下,Atg9囊泡從外圍結(jié)構(gòu)招募到PAS,作為隔離膜的初始膜源[31].保守寡聚高爾基體(conserved oligomeric Golgi,COG)復(fù)合物是一種含有螺旋桿的拴留復(fù)合物[32].在饑餓誘導(dǎo)自噬過(guò)程中,cog突變體中Atg9在PAS的定位明顯減少,Atg9循環(huán)受到影響[33].并且在營(yíng)養(yǎng)豐富條件下,Cog8可以與激活的Arl3和Arl1相互作用,調(diào)節(jié)Atg9囊泡從反式高爾基轉(zhuǎn)移至PAS而參與CVT過(guò)程[34].

Atg8脂質(zhì)化在自噬體的形成中發(fā)揮重要作用.Atg8蛋白的C端首先被Atg4家族蛋白酶蛋白水解切割,暴露甘氨酸殘基.Atg8隨后在ATP消耗下轉(zhuǎn)移到E1樣酶Atg7中的半胱氨酸殘基.從那里,Atg8被轉(zhuǎn)移到E2樣酶的Atg3,Atg3通過(guò)其C端甘氨酸介導(dǎo)Atg8與磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine,PE)的頭基的連接形成Atg8-PE[35].Atg8-PE參與自噬體形成的多個(gè)步驟,包括隔離膜擴(kuò)張和閉合.此外,Atg8-PE可以被Atg4裂解將Atg8從膜中釋放出來(lái)以供重復(fù)使用,并且該反應(yīng)還可以調(diào)節(jié)自噬體的形成.以上篩選出的蛋白說(shuō)明Hrr25可能通過(guò)與多種參與自噬的蛋白相互作用而影響自噬的發(fā)生.但這些篩選出的候選蛋白是否與Hrr25相互作用影響自噬的發(fā)生有待進(jìn)一步研究.綜上所述,本研究的結(jié)果為進(jìn)一步探究Hrr25在自噬中的調(diào)控機(jī)制提供新的方向.