高章會(huì)，華 蓉，孫達(dá)鋒，劉紹雄，岳萬(wàn)松，張曉華，余鎖姝，李建英**

（1.中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2.云南省食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，云南 昆明 650221；3.保山市科學(xué)技術(shù)情報(bào)研究所，云南 保山 678099）

羊肚菌（Morchella spp.） 隸屬于羊肚菌科（Morchellaceae） 羊肚菌屬（Morchella），是一類味道鮮美、脂肪含量低、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的食用菌。羊肚菌富含蛋白質(zhì)、多種礦物質(zhì)、維生素、多糖、甾醇、多酚、蛋白水解物等，具有降血脂、抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫力、抗氧化、保肝護(hù)肝、降血糖等作用[1-3]。野生羊肚菌在我國(guó)分布廣泛，在云南、河南、西藏、山西、四川、陜西、甘肅、新疆等地均有分布，但野生資源數(shù)量稀少，因此需開(kāi)展人工栽培以滿足市場(chǎng)需求。羊肚菌主要采用大棚栽培，但在栽培過(guò)程中仍容易受外界環(huán)境和人為栽培技術(shù)等因素的影響，且栽培時(shí)需要在土壤廂面擺放一定量的營(yíng)養(yǎng)袋以提供其生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)，但這樣也為其他病原菌的生長(zhǎng)和繁殖提供了有利的條件[4-5]，導(dǎo)致羊肚菌病害問(wèn)題日益凸顯。

近年來(lái)，關(guān)于羊肚菌病害的研究報(bào)道較多。比如，劉偉等[6]研究了羊肚菌軟腐病和紅體病細(xì)菌性病害及蛛網(wǎng)病等真菌性病害，并給出了防控這些病害的方法。GUO 等[7]研究了梯棱羊肚菌（Morchella importuna） 的柄腐爛病的引起原因和防治措施。余苗等[8]研究了羊肚菌白腐病，發(fā)現(xiàn)是由曲霉屬（Aspergillus） 真菌引起的。HE 等[9]報(bào)道了羊肚菌白霉病是由長(zhǎng)毛擬青霉（Paecilomyces penicillatus） 引起的。白霉病和蛛網(wǎng)病是羊肚菌栽培中較為常見(jiàn)且危害較大的2 種病害。白霉病表現(xiàn)為子實(shí)體菌柄、菌蓋或整體感染白色絨毛狀菌絲。蛛網(wǎng)病先是在子實(shí)體基部菌柄長(zhǎng)出絨毛狀的菌絲，然后向菌蓋蔓延，菌絲逐漸呈棉絮狀。目前關(guān)于羊肚菌白霉病的研究報(bào)道較多，但羊肚菌蛛網(wǎng)病的研究相對(duì)較少。本次，針對(duì)中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所晉寧基地和瀘水市老窩鎮(zhèn)羊肚菌栽培基地，開(kāi)展白霉病和蛛網(wǎng)病的病害調(diào)查和病原菌研究，分析病害發(fā)生的規(guī)律和原因，并進(jìn)行了病原菌的鑒定等研究，對(duì)后期針對(duì)性地進(jìn)行病害防治具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 采樣點(diǎn)概況及樣品采集

1.1.1 采樣點(diǎn)概況

以中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所羊肚菌栽培基地（102°34′11.27″E，24°33′42.35″N，海拔1 961.6 m） 以及瀘水市老窩鎮(zhèn)羊肚菌栽培基地（99°4′2.56″E，25°53′2.62″N，海拔1 856.2 m），作為羊肚菌病害調(diào)查及病原菌的采集樣點(diǎn)。

1.1.2 樣品采集

采樣時(shí)間為2023 年1 月至2 月，調(diào)查并記錄羊肚菌發(fā)病時(shí)間、規(guī)律、特征及防治措施等信息，同時(shí)采集發(fā)生病害的羊肚菌子實(shí)體，將采集的標(biāo)本進(jìn)行編號(hào)后裝入9 號(hào)自封袋，帶回實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 病原菌分離、純化與鑒定方法

1.2.1 病原菌分離與純化方法

在超凈操作臺(tái)上，用經(jīng)酒精燈燒過(guò)冷卻后的無(wú)菌接種針，在羊肚菌子實(shí)體病害處挑取病原菌組織放在PDA 培養(yǎng)基平板（60 mm） 上，置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～7 d。之后挑取菌落的尖端菌絲放在PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，以此方法純化3～6 次。最后將純化好的單菌落轉(zhuǎn)入斜面試管，待試管長(zhǎng)滿后，再置于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌形態(tài)鑒定方法

在無(wú)菌條件下，將純化后的病原菌接種于PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)。每隔2 d 觀測(cè)記錄菌絲生長(zhǎng)速度、菌落顏色、大小及形態(tài)變化等特征，培養(yǎng)7 d后挑取菌落并制成臨時(shí)玻片，在電子顯微鏡下觀測(cè)其菌絲形態(tài)、分生孢子梗、分生孢子形狀、大小等性狀，并進(jìn)行拍照記錄。

1.2.3 病原菌分子鑒定方法

采用rDNA ITS 序列分析[10-11]，采用磁珠法基因組DNA 提取試劑盒（武漢納磁生物科技有限公司）提取菌絲的基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳法和生物分光光度計(jì)法檢測(cè)DNA 的純度和濃度。使用ITS通用引物ITS4、ITS5 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 完成后，加（6×） 上樣緩沖液（6×） 5 μL 混勻，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。檢測(cè)合格后，進(jìn)行測(cè)序。將獲得的ITS 序列，使用BLAST 軟件在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)，同時(shí)，使用MEGA 7 軟件構(gòu)建NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，使用默認(rèn)參數(shù)，Bootstrap 檢驗(yàn)為1 000 次，以此來(lái)確定病原菌的系統(tǒng)發(fā)育地位。

所設(shè)計(jì)的進(jìn)水流道水力損失測(cè)試裝置為一立式循環(huán)系統(tǒng)，如圖3所示。由1臺(tái)200mm口徑的慣流管道泵供水，供水能力滿足試驗(yàn)流量范圍的要求，通過(guò)調(diào)節(jié)閘閥的開(kāi)度改變?cè)囼?yàn)流量，采用電磁流量計(jì)測(cè)試流量。兼顧減小比尺效應(yīng)和減少試驗(yàn)費(fèi)用這兩個(gè)方面的要求，模型進(jìn)水流道的進(jìn)口內(nèi)徑定為200mm。進(jìn)水流道模型與原型保持幾何相似，進(jìn)水流道模型采用有機(jī)玻璃制作，進(jìn)水池整體采用鋼板制作，在與進(jìn)水流道連接處兩側(cè)也采用透明有機(jī)玻璃制作觀察窗口，以便觀察和攝錄流態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌2 種病害發(fā)病癥狀及規(guī)律

羊肚菌白霉病和蛛網(wǎng)病2 種病害發(fā)病癥狀見(jiàn)圖1。

圖1 病害癥狀Fig.1 Disease symptoms

如圖1A 所示，羊肚菌白霉病病害癥狀為菌蓋和菌柄區(qū)域性感染，菌蓋發(fā)病較多，呈白色霉?fàn)?，蔓延速度較快[12]。若羊肚菌幼菇被感染，白色菌絲會(huì)快速蔓延至整個(gè)子實(shí)體，導(dǎo)致其無(wú)法生長(zhǎng)。白霉病發(fā)生規(guī)律為，在棚內(nèi)溫度高、通風(fēng)不暢、高溫高濕的情況下易發(fā)生。

如圖1B 所示，蛛網(wǎng)病病害癥狀表現(xiàn)為外源營(yíng)養(yǎng)袋周圍發(fā)病較多，地面呈現(xiàn)大面積白色霉層，菌絲呈蜘蛛網(wǎng)狀。從菌柄基部開(kāi)始逐漸向菌蓋感染，直至包裹整個(gè)子實(shí)體，其蔓延速度較快，特別是羊肚菌幼菇被感染后，菌絲會(huì)快速蔓延至整個(gè)子實(shí)體，導(dǎo)致羊肚菌子實(shí)體停止生長(zhǎng)，甚至倒伏死亡。蛛網(wǎng)病發(fā)生規(guī)律為，在采取保溫措施后棚內(nèi)未及時(shí)通風(fēng)或揭膜較晚而導(dǎo)致棚內(nèi)通風(fēng)不夠時(shí)，以及在高溫高濕的情況下容易發(fā)生。

2.2 病原菌形態(tài)鑒定

對(duì)白霉病病原菌進(jìn)行分離純化，得到病原菌菌株YDJB-02，其形態(tài)特征見(jiàn)圖2。

圖2 病原菌菌株YDJB-02 的形態(tài)特征Fig. 2 Morphological characteristics of pathogenic strain of YDJB-02

由圖2 所示，菌株YDJB-02 菌落為圓形，氣生菌絲白色、生長(zhǎng)旺盛，生長(zhǎng)速度較慢，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中7～10 d 長(zhǎng)滿PDA 平板（直徑60 mm）。菌絲體有膨大結(jié)構(gòu)，分生孢子梗呈側(cè)生，分生孢子為鏈?zhǔn)健㈨敹酥?，圓形，光滑，有間隔。符合《真菌鑒定手冊(cè)》[13]的擬青霉屬（Paecilomyces） 描述的形態(tài)特征，所以初步鑒定分離得到的菌株為擬青霉屬（Paecilomyces）。

對(duì)蛛網(wǎng)病病原菌進(jìn)行分離純化，得到病原菌菌株YDJB-03 其形態(tài)特征見(jiàn)圖3。

圖3 病原菌菌株YDJB-03 的形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics of pathogenic strain of YDJB-03

由圖3 所示，該菌株菌落為圓形，氣生菌絲為絮狀，生長(zhǎng)旺盛，菌落正面為白色，背面為淺黃色，生長(zhǎng)速度較快，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中3～5 d 長(zhǎng)滿PDA平板（直徑60 mm）。分生孢子梗呈帚狀或輪枝狀分枝，分生孢子單生或聚生，分生孢子卵圓形，無(wú)色，0～1 個(gè)隔，符合葡枝霉屬（Cladobotryum) 真菌[菌寄生屬（Hypomyces） 真菌的無(wú)性階段] 的形態(tài)特征[14-15]。

2.3 病原菌系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)過(guò)DNA 提取、擴(kuò)增、測(cè)序和雙向序列校對(duì)，YDJB-02 的ITS 序列與登記號(hào)為EU553300.1、KY490042.1、AY624194.1 的長(zhǎng)毛擬青霉（P. penicillatus） 序列的相似度分別達(dá)99.42%、99.63%、100.00%。用根霉屬（Rhizopus） 作為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖4。

圖4 基于ITS 序列的擬青霉屬Paecilomyces 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of Paecilomyces based on ITS sequence

由圖4 可知，根霉屬（Rhizopus） 與擬青霉屬（Paecilomyces） 分為2 個(gè)大的進(jìn)化枝；病原菌菌株與長(zhǎng)毛擬青霉聚在同一支系。結(jié)合菌落形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)和分子系統(tǒng)學(xué)分析，將分離純化出的病原菌YDJB-02 菌株鑒定為長(zhǎng)毛擬青霉（P. penicillatus）。

經(jīng)過(guò)DNA 提取、擴(kuò)增、測(cè)序和雙向序列校對(duì)，病原菌YDJB-03 的ITS 序列與已發(fā)表金黃菌寄生（Hypomyces aurantius） [無(wú)性型為異形枝葡霉（Cladobotryum varium）] MH858568.1、MH855045.1、MH864222.1 的相似度分別達(dá)99.67%、99.82%、99.47%。用擬青霉屬（Paecilomyces） 作為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖5。

圖5 基于ITS 序列的菌寄生屬Hypomyces 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of Hypomyces based on ITS sequence

由圖5 可知，菌寄生屬（Hypomyces） 與擬青霉屬（Paecilomyces） 分為2 個(gè)大的進(jìn)化枝；病原菌菌株與金黃菌寄生聚在同一支系。結(jié)合菌落形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)和分子系統(tǒng)學(xué)分析，將分離純化出的病原菌鑒定為金黃菌寄生（Hypomyces aurantius） 無(wú)性型為異形枝葡霉（Cladobotryum varium）。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)對(duì)羊肚菌白霉病病原菌進(jìn)行分離純化，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子鑒定結(jié)果，表明引起羊肚菌白霉病的病原菌為長(zhǎng)毛擬青霉（P. penicillatus）。有研究人員針對(duì)羊肚菌白霉病病害進(jìn)行調(diào)查和研究，通過(guò)科赫氏驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其病原菌為長(zhǎng)毛擬青霉（P.penicillatus）[16-18]。這與本試驗(yàn)的結(jié)果一致，這為下一步羊肚菌的病害防治奠定了基礎(chǔ)。有研究表明枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis） 制劑和多菌靈對(duì)長(zhǎng)毛擬青霉菌絲生長(zhǎng)有較好的抑制效果，其中，枯草芽孢桿菌制劑為生物類藥劑，不會(huì)使其菌株產(chǎn)生抗藥性，且綠色環(huán)保。因此，在羊肚菌栽培中，如果發(fā)生白霉病，可斟酌使用枯草芽孢桿菌制劑和多菌靈。

通過(guò)對(duì)蛛網(wǎng)病病病原菌進(jìn)行分離純化，結(jié)合形態(tài)特征及分子鑒定，結(jié)果表明引起羊肚菌蛛網(wǎng)病的病原菌為異形枝葡霉（C. varium），有性型為金黃菌寄生（H. aurantius），該病原菌于1860 年在多孔菌（Polyporus varius Pers.: Fr.） 上發(fā)現(xiàn)并被首次報(bào)道[14]。研究表明引起蛛網(wǎng)病的病原菌主要為凸出枝葡霉（Cladobotryum protrusum）、異型葡枝霉（Cladobotryum varium）、嗜菌葡枝霉（Cladobotryum mycophilum） 和樹(shù)狀枝葡霉（Cladobotryum dendroides） 等[19-20]，且在金針菇（Flammulina filiformis）[21-22]、斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus）[23-24]、刺芹側(cè)耳（Pleurotus eryngii var. tuoliensis）[25]等食用菌中發(fā)現(xiàn)引起蛛網(wǎng)病的病原真菌為異形枝葡霉，與本試驗(yàn)中引起羊肚菌蛛網(wǎng)病的病原菌結(jié)果一致，但異形枝葡霉引起羊肚菌蛛網(wǎng)病還是首次報(bào)道。本試驗(yàn)利用分子生物學(xué)手段對(duì)羊肚菌蛛網(wǎng)病病原菌進(jìn)行了鑒定，明確了其病原菌為異形枝葡霉，為該病害的防治奠定了理論基礎(chǔ)。關(guān)于羊肚菌蛛網(wǎng)病病原菌異形枝葡霉的生物學(xué)特性、發(fā)生特點(diǎn)和防控技術(shù)還有待于進(jìn)一步研究。