王亞偉 薛強(qiáng) 熊海容

摘要：以來(lái)源于嗜熱放線菌（Thermobifida fusca）的甘露聚糖酶基因（KJ806638）為研究對(duì)象，利用易錯(cuò)PCR方法對(duì)其進(jìn)行改造，獲得了耐熱性進(jìn)一步提高的甘露聚糖酶。篩選獲得的N16I突變株，其最適反應(yīng)溫度從72.5 ℃提升到77.5 ℃。差示掃描熒光定量（DSF）檢測(cè)結(jié)果顯示，酶蛋白質(zhì)的表觀解鏈溫度Tm從61.9 ℃提升到 63.2 ℃。

關(guān)鍵詞：甘露聚糖酶；易錯(cuò)PCR；熱穩(wěn)定性

中圖分類號(hào)：Q55? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2023）12-0151-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.12.027 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Improving the thermotolerance of mannanase through molecular improvement

WANG Ya-wei1，XUE Qiang2，XIONG Hai-rong2

（1.School of Life Science and Technology，Wuhan Polytechnic University，Wuhan? 430048，China；

2. College of Life Sciences， South-Central Minzu University， Wuhan? 430074，China）

Abstract：The mannanase gene （KJ806638） from Thermobifida fusca was used as the research object， and it was modified by the error-prone PCR method， and the heat resistance of mannanase was further improved. The optimum reaction temperature of N16I mutant was increased from 72.5 ℃ to 77.5 ℃. Differential scanning fluorometry （DSF） testing results showed that the apparent decomposition temperature Tm of the enzyme protein increased from 61.9 ℃ to 63.2 ℃.

Key words： mannanase； error-prone PCR； thermostabilty

甘露聚糖酶是一種半纖維素酶類［1］，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于飼料、造紙、洗滌劑、食品和石油開(kāi)采及生物質(zhì)能源等領(lǐng)域，尤其在功能性低聚糖制備和添加劑等方面應(yīng)用前景十分廣闊。在飼料行業(yè)，甘露聚糖是飼料中主要抗?fàn)I養(yǎng)因子之一，會(huì)增加食糜在畜禽消化道內(nèi)的黏度，導(dǎo)致畜禽對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收受到影響，致使飼料的消化利用率降低［2］。在石油方面，甘露聚糖酶常被用作壓裂液的破膠劑，可以增強(qiáng)壓裂液的導(dǎo)流能力，減少破壞性物質(zhì)的殘留，從而提高產(chǎn)油量［3］。在造紙過(guò)程中，甘露聚糖酶可用作處理紙漿的漂白劑，可以有效促進(jìn)木質(zhì)素的降解而保留纖維素［4］。

工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，往往存在高溫等極端環(huán)境，高溫環(huán)境能加快酶促反應(yīng)速度，提高液體物料的流動(dòng)性能，防止有害微生物在過(guò)程中的生長(zhǎng)繁殖等［5，6］。普通中溫甘露聚糖酶在高溫下會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，從而大幅度地喪失活性。來(lái)源于嗜熱放線菌（Thermobifida fusca）的耐熱甘露聚糖酶［7］進(jìn)行水解，能從根本上解決高溫環(huán)境使加入的酶很快失活的問(wèn)題。

易錯(cuò)PCR技術(shù)［8］是在正常PCR技術(shù)上演變而來(lái)的，它是一種使DNA在復(fù)制擴(kuò)增過(guò)程中更容易出現(xiàn)錯(cuò)誤配對(duì)的PCR技術(shù)，因此又稱為錯(cuò)配PCR或傾向錯(cuò)誤PCR。易錯(cuò)PCR通常是利用低保真度的Taq DNA聚合酶和改變一些PCR反應(yīng)體系等手段，來(lái)降低PCR過(guò)程中DNA復(fù)制的保真度，使錯(cuò)配率升高，從而得到與原來(lái)不同的DNA序列或基因。將該酶基因序列通過(guò)易錯(cuò)PCR突變后，通過(guò)表達(dá)和酶特性鑒定后篩選，獲得的更高耐熱性的甘露聚糖酶突變體4號(hào)，在飼料添加劑、保健食品、造紙、洗滌、釀造、紡織和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 菌株質(zhì)粒和試劑

大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）、質(zhì)粒pET-22b（+）均為實(shí)驗(yàn)室保藏，質(zhì)粒pAOhr-ManB來(lái)源于武漢擎科生物科技有限公司合成。限制性內(nèi)切酶、Taq酶、Pyrobest DNA聚合酶、T4 DNA連接酶等工具酶購(gòu)自TaKaRa公司；DNA純化試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司。IPTG、X-Gal、SDS及角豆膠購(gòu)自Sigma公司，TEMED、過(guò)硫酸銨、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺為國(guó)藥試劑。

50 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液：取7.10 g磷酸氫二鈉溶解于800 mL去離子水中，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH為4.0～7.5范圍內(nèi)任一值后，定容至1 L。50 mmol/L Tris-HCl緩沖液：取6.06 g Tris溶解于800 mL去離子水中，用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至7.5～9.0，定容至1 L。50 mmol/L 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液：取7.50 g甘氨酸溶解于800 mL去離子水中，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至9.0～11.0，定容至1 L。

1.2 易錯(cuò)PCR突變和表達(dá)

將實(shí)驗(yàn)室保藏的菌株Escherichia coli DH5α-pAOhr-ManB擴(kuò)大化培養(yǎng)，使用試劑盒提取質(zhì)粒pAOhr-ManB作為模板，擴(kuò)增甘露聚糖酶的基因，以回收的片段為模板，進(jìn)行易錯(cuò)PCR。所用的引物序列見(jiàn)表1。

易錯(cuò)PCR通過(guò)改變體系中錳離子濃度和4種脫氧核糖核苷酸的濃度比例，使甘露聚糖酶的堿基序列發(fā)生隨機(jī)突變，從而得到多個(gè)甘露聚糖酶ManB的突變基因序列。易錯(cuò)PCR的操作體系見(jiàn)表2?；驍U(kuò)增、大腸桿菌表達(dá)和蛋白質(zhì)提純方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［9，10］。

1.3 酶學(xué)性質(zhì)檢測(cè)

原酶及突變酶最適溫度測(cè)定［11］：采用3，5-二硝基水楊酸方法（簡(jiǎn)稱DNS法）對(duì)原酶及突變酶的最適溫度進(jìn)行測(cè)定，以0.5%角豆膠為底物，在pH 7.0反應(yīng)條件下，分別測(cè)定不同溫度梯度（50～85 ℃）下的酶活力，酶活力最高點(diǎn)為最適反應(yīng)溫度，以測(cè)得的最大酶活值為100%，計(jì)算不同溫度下的相對(duì)酶活力，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)平行。

差示掃描熒光定量（Differential scanning fluorometry， DSF）測(cè)定［12］：檢測(cè)不同重組酶蛋白的表觀解鏈溫度即Tm。DSF試驗(yàn)只需要少量純化的蛋白質(zhì)（10～25 μL），其最低蛋白質(zhì)濃度為0.1～0.3 mg/mL，將蛋白質(zhì)和熒光染料均勻混合加入96孔板中，再放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中，可以在較短時(shí)間內(nèi)完成測(cè)量過(guò)程，這些特點(diǎn)使DSF方法可以快速測(cè)量蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。將20 μL純化后的不同酶蛋白質(zhì)與5 μL的100×SYPRO Orange染料混合離心，設(shè)置實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)中以0.1 ℃的增幅從30 ℃到99 ℃加熱樣品，并同時(shí)測(cè)得其熒光值，根據(jù)熒光值的變化來(lái)測(cè)定重組酶的Tm。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘露聚糖酶突變株基因的獲得和表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)室保藏的甘露聚糖酶（PDB：1BQC）基因來(lái)源于Thermobifida fusca，在不改變氨基酸序列的情況下，對(duì)該酶基因序列進(jìn)行序列重排與密碼子優(yōu)化。為了便于對(duì)該基因進(jìn)行分子操作，消除了基因序列中的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，合成了一個(gè)新基因ManB（KJ806638）。同時(shí)在甘露聚糖酶ManB基因的兩端分別設(shè)計(jì)添加酶切位點(diǎn)Nco I和Xho I，交由武漢擎科生物科技有限公司完成全基因合成，獲得重組載體pAOhr-ManB。以pAOhr-ManB質(zhì)粒作為模板，設(shè)計(jì)引物，通過(guò)使用Taq酶和改變PCR體系中的Mn2+濃度和4種脫氧核糖核苷酸的濃度比例，使甘露聚糖酶的堿基序列發(fā)生隨機(jī)突變，從而得到多個(gè)甘露聚糖酶ManB的突變基因序列。本研究篩選獲得的突變酶氨基酸序列信息如下（突變位點(diǎn)為N16I）：

MATGLHVKNGRLYEAIGQEFIIRGVSHPHNWYPQHTQAFADIKSHGANTVRVVLSNGVRWSKNGPSDVANVISLCKQNRLICMLEVHDTTGYGEQSGASTLDQAVDYWIELKSVLQGEEDYVLINIGNEPYGNDSATVAAWATDTSAAIQRLRAAGFEHTLVVDAPNWGQDWTNTMRNNADQVYASDPTGNTVFSIHMYGVYSQASTITSYLEHFVNAGLPLIIGEFGHDHSDGNPDEDTIMAEAERLKLGYIGWSWSGNGGGVEYLDMVYNFDGDNLSPWGERIFYGPNGIASTAKEAVIFGLEHHHH

HH

采用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I完成甘露聚糖酶突變株N16I的基因和分泌型表達(dá)載體pET-22b（+）雙酶切，再使用T4連接酶將兩者連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。將該重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，以PCR驗(yàn)證法篩選出陽(yáng)性克隆菌株，并測(cè)序驗(yàn)證。驗(yàn)證正確后發(fā)酵產(chǎn)酶，純化得到酶蛋白。目標(biāo)甘露聚糖酶ManB的三維結(jié)構(gòu)如圖1所示。

2.2 甘露聚糖酶的性質(zhì)分析

2.2.1 甘露聚糖酶最適溫度的測(cè)定 由圖2可知，以0.5%角豆膠為底物，在pH 7.0和反應(yīng)時(shí)間10 min的條件下，原甘露聚糖酶ManB的最適反應(yīng)溫度在72.5 ℃左右，而同樣條件下突變體酶的最適反應(yīng)溫度為77.5 ℃，顯示出突變酶的最適反應(yīng)溫度明顯提高。

2.2.2 甘露聚糖酶的熱穩(wěn)定性分析 由圖3可知，甘露聚糖酶ManB和其突變體均具有較好的耐熱性，在65 ℃處理30 min后仍無(wú)滅活現(xiàn)象。突變酶在70 ℃條件下處理后的殘余酶活力高于原酶，顯示出突變酶的耐熱性能明顯提高。

2.2.3 甘露聚糖酶Tm的測(cè)定 根據(jù)熒光值的變化來(lái)測(cè)定原酶和突變酶的Tm如圖4所示。由圖4可知，酶蛋白質(zhì)的表觀解鏈溫度Tm從原酶的61.9 ℃提升到突變酶的 63.2 ℃。測(cè)定結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了突變酶的耐熱性提高。

3 小結(jié)

本研究將Thermobifida fusca來(lái)源的β-甘露聚糖酶ManB在大腸桿菌BL21中進(jìn)行了異源表達(dá)，并通過(guò)易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)該酶的基因序列進(jìn)行了兩輪易錯(cuò)PCR，得到突變體文庫(kù)。通過(guò)篩選獲得了一株性能較好的突變甘露聚糖酶N16I，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析，其耐熱性得到了提升［13-15］。本研究為甘露聚糖酶的分子改造和生產(chǎn)提供了一定的依據(jù)和基礎(chǔ)。

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