趙斐，謝旭芳，吳成斯，梁慧婷

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006

癲癇是由于腦的興奮性和抑制性之間的不平衡而引起的反復(fù)發(fā)作的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病［1］。目前癲癇的治療主要通過抗癲癇藥物控制其發(fā)作，僅有60%的癲癇患者能有效緩解癥狀，且部分患者可能罹患認(rèn)知、情緒障礙等合并癥［2］。因此，確定引起癲癇的原因和機制，尋找新的、針對性強的靶向藥物十分必要。卡馬西平是目前治療癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要藥物，若能夠有效地將卡馬西平輸送至大腦對于治療癲癇非常重要［3］。研究［4］表明，當(dāng)藥物與葡萄糖（glucose，GLU）的6 碳結(jié)合時，嵌于細胞膜上的GLU 轉(zhuǎn)運體GLUT1 識別能力最強，說明GLU 修飾的藥物分子具有良好的靶向性。因此，本研究以海馬神經(jīng)元細胞膜上的GLUT1 為靶標(biāo)，并基于海馬神經(jīng)細胞中線粒體內(nèi)氧化應(yīng)激機制，探究GLU-甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（GLU-PEG2000-DSPE）修飾卡馬西平納米系統(tǒng)腦靶向效果，對于臨床開發(fā)研究新型靶向治療癲癇藥物具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雄性斯波累格·多雷（Sprague Dawley，SD）大鼠60 只，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，生產(chǎn)許可證號：生產(chǎn)許可SCXK（滬）2022-0004，體重240 g 左右，所有SD 大鼠均置于SPF 級實驗動物房中飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為22 ℃左右，均自由攝食及飲水。所有動物實驗均已經(jīng)過南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 藥物與儀器

GLU-PEG2000-DSPE（上海炎怡生物科技有限公司），卡馬西平原料藥（常州亞邦制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20053419），超速冷凍離心機（美國貝克曼公司），透射電子顯微鏡（JEOL JEM-1220，Japan），酶標(biāo)儀（BioTeK CytationTM5，UK），勻漿器（IKA T10B，Germany），高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)（美國Agilent 公司），超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 GLU-PEG2000-DSPE 修飾卡馬西平納米系統(tǒng)制備

薄膜分散法制備GLU-PEG2000-DSPE 修飾卡馬西平脂質(zhì)體，將蛋黃卵磷脂、膽固醇、GLU-PEG2000-DSPE、卡馬西平按照摩爾比為95∶20∶5∶6.35（質(zhì)量比為3.907∶1.02∶1∶0.5）用氯仿溶解于圓底燒瓶中。減壓條件下蒸發(fā)該混合物形成薄的脂質(zhì)膜，生理鹽水超聲水化形成脂質(zhì)體溶液，并通過100 nm聚碳酸酯膜擠出，過G50 葡聚糖凝膠柱除去未包裹卡馬西平，于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 電鏡觀察納米粒子的表征

使用透射電子顯微鏡觀察納米粒子的表面形態(tài)。取制備好的脂質(zhì)體溶液用超純水稀釋10 倍，取1 滴滴加在230 目銅網(wǎng)上，再滴加0.5%磷鎢酸溶液，晾干后使用透射顯微鏡觀察并拍攝。負(fù)載熒光染料DiR 的納米粒子的制備方法同上。

1.5 細胞培養(yǎng)

隨機選取10 只SD 大鼠取其完整的海馬組織，經(jīng)PBS 漂洗后將海馬組織剪成小塊，并放入培養(yǎng)液中。將小塊海馬組織離心后去除上清液，加入20%FBS 懸浮中和，再次離心，去除神經(jīng)和血管組織，收集沉淀（底部沉淀為大鼠海馬神經(jīng)元細胞）。

1.6 細胞毒性實驗

取96 孔板，每孔鋪大鼠神經(jīng)元細胞5 000 個，過夜，隨機均分為兩組，將制備好的納米粒子和單純的卡馬西平按15、30、45、80、100、200、400 μg/mL濃度梯度分別給藥每孔細胞中，孵育48 h后，加10 μM 濃度為5 mg/mL 的MTT 溶液。培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO 溶液，酶標(biāo)儀振板10 min，490 nm 檢測OD 值，計算各濃度下各制劑的48 h 細胞存活率。

1.7 分組與造模

將剩余50 只SD 大鼠隨機分為四組，一組為正常組（n=10），其余三組進行造模，分別為模型組（n=10）、卡馬西平組（n=15）、納米組（n=15）。所有SD 大鼠按照分組分籠飼養(yǎng)于SPF 級動物房，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進行實驗。根據(jù)氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)法構(gòu)建癲癇大鼠模型，觀察大鼠的行為學(xué)變化并根據(jù)Racine 評級標(biāo)準(zhǔn)判斷癲癇模型是否制備成功，若大鼠出現(xiàn)Ⅳ級以上的持續(xù)癲癇狀態(tài)，表明模型制備成功。本研究癲癇模型40只大鼠均構(gòu)建成功。

1.8 檢測癲癇大鼠腦組織中卡馬西平含量

隨機從卡馬西平組、納米組各選取5 只大鼠，分別給卡馬西平組大鼠注射單純的卡馬西平溶液，納米組注射GLU-PEG2000-DSPE 修飾的卡馬西平納米粒子溶液，各組溶液濃度根據(jù)細胞毒性實驗結(jié)果注射。藥物干預(yù)2 h 處死兩組大鼠，收集其腦組織，沖洗后稱重，并制備10%的勻漿液。勻漿液與1 mL乙酸乙酯充分混合、離心后，取上層有機相，重復(fù)3 次萃取過程，然后用濾頭過濾，用200 μL 流動相復(fù)溶殘余物，最后取20 μL 用HPLC 系統(tǒng)分析。

1.9 檢測各組大鼠的海馬組織病理學(xué)變化及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)

卡馬西平組、納米組各10 只大鼠，經(jīng)藥物干預(yù)24 h 后處死各組大鼠，取部分海馬組織經(jīng)HE 染色后，在顯微鏡下觀察并記錄其病理變化。另取部分海馬組織制備海馬組織勻漿，吸取上清液，按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書進行操作，通過化學(xué)比色法檢測大鼠海馬組織中氧化應(yīng)激因子SOD、GSH-Px、MDA 的含量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 納米粒子的表征及粒徑

不擔(dān)載卡馬西平藥物的聚合物納米粒子粒徑最低為40 nm，最高為60 nm，呈分散均勻的球形，而擔(dān)載抗癲癇藥物卡馬西平的聚合物納米粒子粒徑最低為70 nm，最高為90 nm，表面形態(tài)也為球形，無明顯改變，但粒徑明顯增加（P＜0.05）。見圖1。

圖1 電鏡觀察納米粒子的表征（×100）

2.2 不同濃度的卡馬西平納米粒子對神經(jīng)元細胞的毒性

80 μg/mL 及以上單純的卡馬西平對神經(jīng)元細胞產(chǎn)生明顯的毒性作用，而各濃度下卡馬西平納米粒子均對神經(jīng)元細胞無明顯毒性作用。在80 μg/mL 及以上時，卡馬西平納米粒子溶液中神經(jīng)元細胞存活率明顯高于單純的卡馬西平。在100 μg/mL 時，卡馬西平納米粒子對細胞的毒性最低，與單純的卡馬西平相比具有明顯差異。見圖2。

圖2 不同濃度的卡馬西平納米粒子對神經(jīng)元細胞的毒性

2.3 卡馬西平在癲癇大鼠腦部藥物定量分析

根據(jù)細胞毒性實驗，卡馬西平組、納米組大鼠注射的卡馬西平濃度均為15 μg/mL。通過藥物定量分析顯示，納米組大鼠海馬組織中卡馬西平含量（1.69±0.17）μg/mL 明顯高于卡馬西平組（1.02±0.10）μg/mL（P＜0.05）。見圖3。

圖3 癲癇大鼠腦組織中卡馬西平含量

2.4 各組大鼠海馬組織神經(jīng)元病理形態(tài)結(jié)果

根據(jù)細胞毒性實驗，在100 μg/mL 時，卡馬西平納米粒子對細胞毒性最低，在15 μg/mL 時，單純的卡馬西平對細胞毒性最低，基于此，檢測卡馬西平對癲癇大鼠海馬組織神經(jīng)元病理形態(tài)的影響。正常組大鼠腦皮質(zhì)、顆粒細胞等結(jié)構(gòu)輪廓完整，核仁清晰，染色質(zhì)均勻；模型組大鼠海馬組織神經(jīng)元細胞排列紊亂，細胞發(fā)生膨脹、破裂，細胞間距加大；卡馬西平組大鼠海馬組織神經(jīng)元排列稍有改善，細胞水腫明顯；納米組大鼠海馬組織神經(jīng)元細胞排列較為整齊，細胞無明顯水腫，細胞間距變小，見圖4。

圖4 卡馬西平對癲癇大鼠海馬組織病理改變的影響（HE染色，×400）

2.5 各組大鼠海馬組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)水平

與正常組相比，模型組大鼠海馬組織中SOD、GSH-Px 含量明顯下降，MDA 含量明顯上升（P＜0.05）。與模型組相比，卡馬西平組、納米組大鼠海馬組織中SOD、GSH-Px 含量明顯上升，MDA 含量明顯下降（P＜0.05）。與卡馬西平組相比，納米組大鼠海馬組織中SOD、GSH-Px 含量明顯上升，MDA 含量明顯下降（P＜0.05）。見圖5。

圖5 大鼠海馬組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)

3 討論

癲癇發(fā)作時腦組織產(chǎn)生大量活性氧，對線粒體產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)受損、能量代謝功能障礙［5］。正常情況下腦細胞主要依靠GLU 的有氧氧化獲得能量，而腦部攝取GLU 主要通過葡萄糖轉(zhuǎn)運體家族（GLUTs）轉(zhuǎn)運來實現(xiàn)［6］。研究顯示，將抗腫瘤藥物與葡萄糖連接起來形成綴合物可實現(xiàn)靶向輸送藥物、提高抗腫瘤效果，其作用機制與細胞通過GLUT 1 受體攝取GLU 綴合物有關(guān)［7］。納米粒子的大小在粒子的生物分布、消除和傳遞中起著重要作用。本研究結(jié)果顯示，擔(dān)載卡馬西平的聚合物納米粒子表面形態(tài)呈分散均勻的球形，粒徑明顯大于不擔(dān)載卡馬西平藥物的聚合物納米粒子。

細胞毒性實驗顯示，卡馬西平納米粒子在各濃度下均對細胞無明顯毒性作用，在80 μg/mL 及以上時，其細胞存活率明顯高于單純的卡馬西平。表明GLU-PEG2000-DSPE 對正常細胞的存活率無明顯影響，并且在擔(dān)載卡馬西平后，卡馬西平對細胞的毒性作用可以顯著減輕。研究表明，PEG2000-DSPE 修飾鹽酸表阿霉素脂質(zhì)體后顯著降低藥物毒性［8］，與本研究結(jié)果一致?？R西平穿過血腦屏障能力較低，而納米粒子藥物蓄積和遞送能力更強，將有利于藥物的定向傳送和藥效的發(fā)揮。本研究結(jié)果顯示，納米組大鼠海馬組織中CBZ 含量明顯高于卡馬西平組。有研究［9］顯示，通過RVG29-PEG-PLGA 納米粒子可以更多地積累在腦組織中，可以有效保護缺血性腦卒中大鼠的神經(jīng)功能。本研究探索卡馬西平納米粒子對癲癇大鼠的治療作用，結(jié)果顯示，卡馬西平組、納米組大鼠海馬組織病理形態(tài)相較于模型組均有所改善，且納米組大鼠改善效果更佳。表明GLU-PEG2000-DSPE 修飾卡馬西平納米系統(tǒng)能有效改善癲癇大鼠的病理狀態(tài)。

研究［10］表明，氧化應(yīng)激是癲癇發(fā)病的重要病理機制。大腦幾乎是單一通過線粒體呼吸鏈的有氧代謝獲取能量，且抗氧化能力弱，非常容易受氧化應(yīng)激損傷，目前機體對抗氧自由基主要依賴自身的抗氧化酶系統(tǒng)，其中SOD 和GSH-Px 是機體主要的抗氧化酶［11-12］。MDA 是細胞脂質(zhì)過氧化的直接產(chǎn)物，其含量可反映機體氧化應(yīng)激損傷程度［13］。本研究結(jié)果顯示，與模型組和卡馬西平組相比，納米組大鼠海馬組織中SOD、GSH-Px 含量明顯上升，MDA 含量明顯下降。表明GLU-PEG2000-DSPE 修飾卡馬西平納米粒子可以有效緩解癲癇大鼠海馬組織中的氧化應(yīng)激作用。

綜上所述，GLU-PEG2000-DSPE 修飾卡馬西平納米粒子可以有效改善癲癇大鼠海馬組織的病理狀態(tài)，緩解其氧化應(yīng)激損傷。