丘富安 王 濤 廖維連 陳仕雄 秦 韜*

(1 福州中科基因技術(shù)有限公司，福建福州 350000；2 福建農(nóng)林大學(xué)，福建福州 350000；3 將樂縣動物疫病預(yù)防控制中心，福建三明 353300）

偽狂犬病病毒在世界多國豬場都有廣泛的感染，早在1902年匈牙利微生物學(xué)家就關(guān)注并描述了該病。偽狂犬病是由皰疹病毒科的偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的仔豬神經(jīng)癥狀，成年豬呼吸道癥狀以及種母豬咳嗽、發(fā)燒、流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎、產(chǎn)死胎等繁殖障礙，種公豬睪丸腫脹和種用性能降低等癥狀。由于偽狂犬病病毒對我國的生豬養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生了巨大的影響[1]，早在2012年原農(nóng)業(yè)部印發(fā)的關(guān)于《2012年國家動物疫病監(jiān)測計(jì)劃》通知中對偽狂犬病凈化做出指導(dǎo)，也對畜牧業(yè)的生物安全和防疫意識方面帶來促進(jìn)和變革[2]。偽狂犬病病毒會通過鼻液、唾液、乳汁、陰道分泌液、血液及實(shí)質(zhì)性器官等進(jìn)行排毒傳播，所以消毒是養(yǎng)豬場做到偽狂犬病凈化的關(guān)鍵措施之一，最常用的消毒方法有生物、化學(xué)和物理消毒法?；瘜W(xué)消毒法具有獲取簡單、經(jīng)濟(jì)方便、作用速度快、殺菌譜廣等優(yōu)勢被豬場應(yīng)用在防控和飼養(yǎng)管理的各個(gè)環(huán)節(jié)中。目前，化學(xué)消毒劑（含氯類、過氧化物類、醛類、醇類、含碘類、酚類、雙胍類和季銨鹽類消毒劑等）市場種類較多，各類消毒劑理化性質(zhì)不一，實(shí)際消毒現(xiàn)場環(huán)境干擾因素繁多[3,4]。

在疫病日常監(jiān)測中，采用的熒光PCR 法具有方便、快捷、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)被廣大養(yǎng)殖戶所應(yīng)用[5]，也是臨床檢測偽狂犬病病毒最為常用的方法之一，所以應(yīng)用熒光PCR 法檢測消毒后的核酸殘留能夠大量、快速且多維度去評價(jià)消毒劑的效果。本試驗(yàn)使用偽狂犬病病毒作為研究對象，采用熒光PCR 檢測技術(shù)，探索有效消毒產(chǎn)品在不同的消毒劑濃度、消毒時(shí)間、消毒溫度以及模擬不同的消毒場景下對病毒核酸降解效果，為養(yǎng)殖場的疫病凈化和防疫消毒提供了科學(xué)理論基礎(chǔ)。

1 材料及儀器

1.1 試驗(yàn)材料

次氯酸消毒液，有效含量：500 ppm，購自江蘇某生物科技有限公司。豬偽狂犬病病毒陽性組織研磨液（福州中科基因技術(shù)有限公司檢測Ct 值為26.31）。注射器、偽狂犬病病毒核酸熒光PCR 檢測試劑盒由廣州維伯鑫生物科技有限公司生產(chǎn)。核酸提取試劑盒由濟(jì)凡生物科技(常州)有限公司生產(chǎn)。PBS 緩沖液、5 mL 離心管、50 mL 離心管、棉簽由北京蘭杰柯科技有限公司生產(chǎn)。20 cm×27 cm×4.8 cm 不銹鋼方盤由佛山市金駿寶不銹鋼有限公司生產(chǎn)。各種消毒劑，均購于國內(nèi)知名廠家，合格產(chǎn)品，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 試驗(yàn)儀器

熒光定量PCR 儀購自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司，全自動核酸提取儀購自濟(jì)凡生物科技(常州)有限公司，離心機(jī)購自湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 不同消毒方式對偽狂犬病病毒核酸降解作用

將豬偽狂犬病病毒組織研磨液涂抹于潔凈的不銹鋼方盤內(nèi)，涂抹面積為10 cm×10 cm（如圖1）。待表面風(fēng)干后，分別加入75%酒精、3% NaOH、6% NaOH、3%碘伏、0.5%過硫酸氫鉀、10%二氯異氰尿酸鈉、3%過氧化氫、3%二氧化氯、0.05%苯扎溴銨、60 ppm 次氯酸、2%戊二醛、1%過氧乙酸消毒液（均為說明書建議現(xiàn)場消毒常用濃度）倒入不銹鋼方盤內(nèi)，然后于室溫下靜置反應(yīng)30 min。同時(shí)設(shè)置用涂抹豬偽狂犬病病毒陽性組織研磨液的不銹鋼方盤在臭氧、高溫高壓（70℃、90℃、120℃、150℃），以及紫外燈照射消毒環(huán)境下，消毒時(shí)間均為30 min（紫外燈照射設(shè)置30 min 和2 h），另設(shè)純凈水組作為對照。消毒結(jié)束后，使用棉簽對不銹鋼方盤底部采樣并用1 mL 無菌生理鹽水對棉簽浸泡，最后對收集的洗脫液進(jìn)行偽狂犬病病毒核酸檢測，比較常用的消毒方式之間的消毒效果。

圖1 豬偽狂犬病病毒陽性組織研磨液涂抹方法和用于試驗(yàn)的不銹鋼方盤

2.2 不同溫度、不同時(shí)間、不同濃度次氯酸消毒液對偽狂犬病病毒核酸降解作用

常溫（21℃左右）條件下，將等量的豬偽狂犬病病毒陽性組織研磨液均勻涂抹于潔凈的不銹鋼方盤內(nèi)，涂抹面積為10 cm×10 cm。待表面風(fēng)干后，分別取50 mL 的7.5、15、30、60 ppm 次氯酸消毒液倒入不銹鋼方盤內(nèi)，然后于室溫下靜置10、15、30、45 min（詳見表1），計(jì)時(shí)結(jié)束立即加入10 g/L 的硫代硫酸鈉溶液50 mL，終止反應(yīng)1 min 后，倒去不銹鋼方盤內(nèi)液體并豎立晾干，使用棉簽對不銹鋼方盤底部采樣并用1 mL無菌生理鹽水對棉簽浸泡，最后對收集的洗脫液進(jìn)行偽狂犬病病毒核酸檢測。低溫（4℃左右）條件下的試驗(yàn)方法與常溫條件下的方法一致。

表1 不同消毒方式對偽狂犬病病毒核酸降解作用

2.3 消毒方式作用試驗(yàn)

2.3.1 浸泡組

將等量的豬偽狂犬病病毒陽性組織研磨液均勻涂抹于潔凈的不銹鋼方盤內(nèi)，涂抹面積為10 cm×10 cm。待表面風(fēng)干后，分別取50 mL 的60 ppm 次氯酸消毒液倒入不銹鋼方盤內(nèi)，然后于室溫下靜置10、15、30、45 min，計(jì)時(shí)結(jié)束立即加入10 g/L 的硫代硫酸鈉溶液50 mL 終止反應(yīng)，1 min 后倒去不銹鋼方盤內(nèi)液體并豎立晾干，使用棉簽對不銹鋼方盤底部采樣并用1 mL 無菌生理鹽水對棉簽浸泡，最后對收集的洗脫液進(jìn)行偽狂犬病病毒核酸檢測。

2.3.2 噴霧組

將等量的豬偽狂犬病病毒陽性組織研磨液均勻涂抹于潔凈的不銹鋼方盤內(nèi)，涂抹面積為10 cm×10 cm。待表面風(fēng)干后，使用噴壺裝置60 ppm 次氯酸消毒液噴灑于不銹鋼方盤內(nèi)，噴霧至霧滴形成單層致密排列即可。然后于室溫下靜置10、15、30、45 min，計(jì)時(shí)結(jié)束立即加入10g/L 的硫代硫酸鈉溶液50 mL，終止反應(yīng)1 min 后倒去不銹鋼方盤內(nèi)液體并豎立晾干，使用棉簽對不銹鋼方盤底部采樣并用1mL 無菌生理鹽水對棉簽浸泡，最后對收集的洗脫液進(jìn)行偽狂犬病病毒核酸檢測。

2.3.3 擦拭組

將等量的豬偽狂犬病病毒陽性組織研磨液均勻涂抹于潔凈的不銹鋼方盤內(nèi)，涂抹面積為10 cm×10 cm。待表面風(fēng)干后，使用60 ppm 次氯酸消毒液浸濕的紗布來回重壓擦拭不銹鋼方盤2、5、20、50 次。使用棉簽對不銹鋼方盤底部采樣并用1 mL 無菌生理鹽水對棉簽浸泡，最后對收集的洗脫液進(jìn)行偽狂犬病病毒核酸檢測。

2.3.4 高壓沖洗組

將等量的豬偽狂犬病病毒陽性組織研磨液均勻涂抹于潔凈的不銹鋼方盤內(nèi)，涂抹面積為10 cm×10 cm。待表面風(fēng)干后，使用沖牙器裝置60 ppm 次氯酸消毒液連續(xù)沖洗不銹鋼方盤內(nèi)部，沖洗時(shí)間為1、2、5、10 min，計(jì)時(shí)結(jié)束立即加入10 g/L 的硫代硫酸鈉溶液50 mL 終止反應(yīng)1 min 后倒去不銹鋼方盤內(nèi)液體并豎立晾干，使用棉簽對不銹鋼方盤底部采樣并用1 mL 無菌生理鹽水對棉簽浸泡，最后對收集的洗脫液進(jìn)行偽狂犬病病毒核酸檢測。

2.4 不同物資消毒效果

將豬偽狂犬病病毒陽性組織研磨液均勻涂抹于常見的豬場物資如不銹鋼、塑料瓶、塑料袋、編織袋、疫苗瓶、水泥地、瓷磚、報(bào)紙、衣服、雞蛋殼、泡面、青菜、輪胎、木板等表面。待表面風(fēng)干后，取足夠的60 ppm次氯酸消毒液浸泡20 min，計(jì)時(shí)結(jié)束立即加入10 g/L 的硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)1 min 后使用棉簽對不銹鋼方盤底部采樣并用1 mL 無菌生理鹽水對棉簽浸泡，最后對收集的洗脫液進(jìn)行偽狂犬病病毒核酸檢測。

2.5 結(jié)果判定

試驗(yàn)成立條件：陰性對照無Ct 值，無明顯指數(shù)增長期和平臺期。陽性對照FAM 通道Ct 值≤30，有明顯指數(shù)增長，呈典型的“S 形”曲線。

判定標(biāo)準(zhǔn)：樣品檢測Ct 值小于40 判定為陽性，呈典型的“S 形”曲線。

3 結(jié)果和分析

3.1 不同消毒方式對偽狂犬病病毒核酸降解作用

對75%酒精、3% NaOH、6% NaOH、3%碘伏、0.5%過硫酸氫鉀、10%二氯異氰尿酸鈉、3%過氧化氫、3%二氧化氯、0.05%苯扎溴銨、60 ppm 次氯酸、2%戊二醛、1%過氧乙酸消毒液和臭氧、高溫高壓、紫外光進(jìn)行偽狂犬病毒核酸降解作用試驗(yàn)，結(jié)果可知（見表1），60 ppm 次氯酸組和紫外光2 h 組為陰性。說明在30 min 消毒時(shí)間內(nèi)，測試組中只有60 ppm 的次氯酸消毒液具很好地降解偽狂犬病病毒核酸的作用。此外，紫外光照射30 min 未能完全降解豬偽狂犬病病毒陽性組織研磨液內(nèi)的核酸，至少需要2 h 才可完成核酸降解。

3.2 常溫下不同時(shí)間、不同濃度的次氯酸消毒液對偽狂犬病病毒核酸降解作用

由結(jié)果可知（見表2），所有≥30 ppm 組和15 ppm、45 min 組結(jié)果為陰性。說明在常溫環(huán)境下，消毒時(shí)間、消毒濃度與核酸的降解效果呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)，并且次氯酸消毒劑濃度≥30 ppm 和消毒時(shí)間≥10 min，對豬偽狂犬病病毒陽性組織研磨液內(nèi)的核酸均有很好的降解作用。此外，濃度為15 ppm 次氯酸消毒劑在消毒時(shí)間≥45 min 時(shí)也能完全降解豬偽狂犬病病毒核酸。

表2 常溫下不同時(shí)間、不同濃度的次氯酸消毒液對偽狂犬病病毒核酸降解作用

3.3 低溫下不同時(shí)間、不同濃度的次氯酸消毒液對偽狂犬病病毒核酸降解作用

由結(jié)果可知（見表3），所有≥30 ppm 組結(jié)果均為陰性。說明在4℃環(huán)境下，消毒時(shí)間、消毒濃度與核酸的降解效果呈明顯的正相關(guān)，并且次氯酸消毒劑濃度≥30 ppm 和消毒時(shí)間≥10 min，對豬偽狂犬病病毒陽性組織研磨液內(nèi)的核酸均有很好的降解作用。且低溫環(huán)境下，相同時(shí)間，相同濃度的實(shí)驗(yàn)組Ct 值都會比常溫下的Ct 值低。說明低溫對次氯酸消毒劑有一定抑制影響。

表3 低溫下不同時(shí)間、不同濃度的次氯酸消毒液對偽狂犬病病毒核酸降解作用

3.4 消毒方式作用試驗(yàn)

由表4 可知，所有浸泡組、高壓組、噴霧45 min組、擦拭20 次組、擦拭50 次組均為陰性，說明消毒方式采用浸泡和高壓沖洗且消毒時(shí)間≥10 min，對豬偽狂犬病病毒陽性組織研磨液內(nèi)的核酸均有很好的降解作用。來回重壓擦拭≥20 次或噴霧消毒超過45 min 也能夠降解偽狂犬病病毒核酸。

表4 消毒方式作用試驗(yàn)

3.5 不同物資表面消毒效果

針對涂抹了豬偽狂犬病病毒陽性組織研磨液的豬場常見物資如不銹鋼、塑料瓶、塑料袋、編織袋、疫苗瓶、水泥地、瓷磚、報(bào)紙、衣服、雞蛋殼、泡面、青菜、輪胎、木板等采用次氯酸消毒，結(jié)果顯示，每個(gè)試驗(yàn)組的豬偽狂犬病病毒核酸檢測均為陰性，說明60 ppm 次氯酸消毒液消毒20 min 能有效降解這些物資表面的豬偽狂犬病病毒核酸。

4 討論

豬偽狂犬病危害整個(gè)養(yǎng)豬業(yè)，在2011年偽狂犬病病毒的變異毒株席卷全國，其蔓延速度和危害都令人畏懼，給整個(gè)國家的相關(guān)產(chǎn)業(yè)、貿(mào)易以及社會就業(yè)、人民收入、肉食品供應(yīng)和食品安全等諸多方面帶來嚴(yán)重影響[6,7]。

在偽狂犬病的凈化道路上，國內(nèi)外眾多學(xué)者前赴后繼總結(jié)出很多凈化的方案，熒光PCR 法成為最常用的豬偽狂犬病病毒的監(jiān)測手段之一。檢測和消毒在偽狂犬病病毒的凈化中均扮演著十分重要的角色，消毒是生物安全的重要組成部分，影響消毒效果的主要因素有消毒劑的濃度、消毒劑使用的時(shí)間、消毒劑的溫度、環(huán)境中有機(jī)物的存在以及微生物的敏感性等[8,9]。為了能夠有效地指導(dǎo)養(yǎng)殖者消毒，本試驗(yàn)用豬場常用的各類消毒劑按說明書配置消毒濃度，使用的消毒劑有75%酒精、3% NaOH、6% NaOH、3%碘伏、0.5%過硫酸氫鉀、10%二氯異氰尿酸鈉、3%過氧化氫、3%二氧化氯、0.05%苯扎溴銨、60 ppm 次氯酸、2%戊二醛、1%過氧乙酸消毒液等，并使用豬場常用的其他消毒手段如臭氧、高溫高壓、紫外光進(jìn)行研究，試驗(yàn)采用豬偽狂犬病病毒作為被消毒對象，消毒時(shí)間為30 min，因?yàn)樵谌粘Ｏ竟ぷ髦?，沒有過多的消毒等待時(shí)間，所以能在短時(shí)間降解核酸的消毒方式才更加能夠受到養(yǎng)殖者的青睞。本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說明次氯酸消毒劑降解核酸能力較突出。此外，試驗(yàn)?zāi)M了不同消毒時(shí)間、消毒濃度、消毒方式和不同物資表面進(jìn)行消毒效果評價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，常溫環(huán)境，次氯酸消毒劑濃度≥30 ppm 和消毒時(shí)間≥10 min均能有效降解豬偽狂犬病毒核酸。但是4℃環(huán)境相比常溫環(huán)境，相同消毒時(shí)間，相同次氯酸濃度的試驗(yàn)組Ct 值都會比常溫下的Ct 值低，說明低溫對次氯酸消毒劑有一定抑制影響。養(yǎng)殖場在冬季應(yīng)謹(jǐn)慎使用，消毒時(shí)可選在中午溫度高于4℃且提高消毒濃度和消毒時(shí)間則可保證消毒效果。周德剛[10]建議了養(yǎng)殖場選擇消毒劑和如何使用次氯酸消毒劑，為養(yǎng)殖場科學(xué)消毒奠定理論基礎(chǔ)。根據(jù)在消毒方式和不同物資表面的消毒試驗(yàn)，建議養(yǎng)殖者在消毒時(shí)采用浸泡和高壓沖洗有利于病毒核酸降解，且次氯酸對核酸降解效果適用于常見的物資表面。

在偽狂犬病凈化政策推動中，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將對偽狂犬病的凈化工作做出進(jìn)一步的指導(dǎo)，對消毒等生物安全措施都有提及。未來，動物疫病的防控仍然很嚴(yán)峻，動物疫病的凈化之路也會是漫長的。次氯酸消毒劑對嚴(yán)重困擾養(yǎng)殖業(yè)的非洲豬瘟病毒（同為含囊膜的DNA 病毒）消殺效果值得學(xué)者們關(guān)注，此外，豬繁殖與呼吸綜合征、流行性腹瀉病和寄生蟲病等比較常見且難解決的動物疫病敏感性也需要進(jìn)一步驗(yàn)證，讓養(yǎng)殖者能夠提高防疫能力，確保場內(nèi)生物安全。