薛鴻雁,楊孟雨,楊 歡,董麗君,蔡霞清,趙澤民,王鮮忠

(西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,重慶 400715)

睪丸支持細(xì)胞(sertoli cells,SCs)為精子的生成提供了必需的營(yíng)養(yǎng)和結(jié)構(gòu)支持[1],睪丸支持細(xì)胞的數(shù)量決定了精子的數(shù)量[2]。脂質(zhì)代謝在睪丸支持細(xì)胞中發(fā)揮了重要作用[3]。SCs中氧化還原反應(yīng)失衡時(shí),可促使細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)和不飽和脂肪酸進(jìn)行氧化反應(yīng)形成大量的脂質(zhì)過(guò)氧化物[4]。熱應(yīng)激是影響?zhàn)B豬產(chǎn)業(yè)的重要因素,對(duì)公豬生精功能影響很大[5-6]。越來(lái)越多的證據(jù)表明,熱應(yīng)激促進(jìn)了脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生[7-8],而過(guò)量脂質(zhì)過(guò)氧化物的生成會(huì)影響細(xì)胞的存活[9]。在脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生過(guò)程中,花生四烯酸脂氧合酶(arachidonic acid lipoxygenase, ALOX)發(fā)揮了重要作用[10]。ALOX廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi),哺乳動(dòng)物體內(nèi)有包括花生四烯酸脂氧合酶15B(arachidonic acid lipoxygenase 15-lipoxygenase type B, ALOX15B)等6個(gè)類型,能夠?qū)?xì)胞中花生四烯酸等多不飽和脂肪酸進(jìn)行雙加氧反應(yīng), 產(chǎn)生8-HETE、15-HETE等脂質(zhì)過(guò)氧化物[11]。在脂質(zhì)過(guò)氧化物及其副產(chǎn)物MDA的共同作用下可誘發(fā)ROS的進(jìn)一步聚集[12],而大量的ROS也加速了細(xì)胞凋亡。但ALOX15B在熱應(yīng)激條件下是否誘發(fā)氧化應(yīng)激并影響睪丸支持細(xì)胞凋亡尚不清楚。

c-Jun氨基末端激酶(jun amino terminal kinase, JNK)是MAPK家族的成員之一[13],也是參與細(xì)胞凋亡的重要因子[14],在熱應(yīng)激條件下被激活[15]。抑制花生四烯酸脂氧合酶12可減少12-HETE的產(chǎn)生并抑制JNK依賴性凋亡[16]。p53作為腫瘤抑制因子,在睪丸組織高度表達(dá)并影響生精細(xì)胞的生存[17],在JNK信號(hào)通路下游受其調(diào)控進(jìn)而影響凋亡[18]。然而,在熱應(yīng)激條件下,ALOX15B通過(guò)JNK信號(hào)通路影響睪丸支持細(xì)胞凋亡的機(jī)制還需進(jìn)一步探究。膽囊收縮素引起的肝臟炎癥過(guò)程中,抑制JNK信號(hào)通路降低了12-LOX的表達(dá)與12-HETE的含量[19]。但在JNK信號(hào)通路參與熱應(yīng)激下ALOX15B調(diào)節(jié)支持細(xì)胞凋亡中是否存在反饋?zhàn)饔眠€需進(jìn)一步驗(yàn)證。

本試驗(yàn)利用體外培養(yǎng)的仔豬睪丸支持細(xì)胞的熱應(yīng)激模型研究ALOX15B對(duì)氧化應(yīng)激以及細(xì)胞凋亡的影響,及JNK在ALOX15B誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用,進(jìn)一步探尋JNK對(duì)ALOX15B和8-HETE、15-HETE與氧化應(yīng)激是否存在反饋?zhàn)饔谩Ｉ钊肜斫鉄釕?yīng)激下JNK在ALOX15B影響支持細(xì)胞凋亡調(diào)控中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 睪丸組織采自重慶北碚某豬場(chǎng)3周齡的三元仔豬,取睪丸組織置于含有5%青霉素與鏈霉素的PBS中,使用4 ℃冰盒進(jìn)行運(yùn)輸,在2 h之內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室,以便后續(xù)細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 胎牛血清(FBS)、DMEM/F12培養(yǎng)基、青鏈霉素(Gibco公司);磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline, PBS)粉末(武漢賽維爾生物科技有限公司);Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司);Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);RIPA裂解液(Thermo Scientific公司);ECL化學(xué)發(fā)光液(Millipore公司);BCA試劑盒、活性氧檢測(cè)試劑盒、山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗(上海碧云天生物技術(shù)公司);β-actin一抗(北京博奧森生物技術(shù)公司);ALOX15B一抗、p53一抗(武漢三鷹生物技術(shù)公司);JNK一抗、磷酸化JNK一抗(Santa Cruz公司);豬8-HETE ELISA檢測(cè)試劑盒、豬15-HETE ELISA檢測(cè)試劑盒(上海凡科維生物公司);丙二醛檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司);SP600125(Sigma公司)。黃芩素(上海陶素生化科技有限公司);磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑(MCE公司)。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析試劑。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與處理 睪丸支持細(xì)胞的分離按照本實(shí)驗(yàn)室前期方法進(jìn)行操作[20],當(dāng)細(xì)胞純度鑒定為90%,即可用于后續(xù)試驗(yàn)。睪丸支持細(xì)胞置于含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中,在含有5%CO2的32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。把睪丸支持細(xì)胞接種于6孔板,培養(yǎng)48 h后,棄去培養(yǎng)基,每孔加入1 mL的PBS洗滌后,用不同抑制劑或者轉(zhuǎn)染相應(yīng)時(shí)間,在44 ℃恒溫培養(yǎng)箱中熱處理30 min后進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。

1.2.2 ALOX15B的siRNA轉(zhuǎn)染 ALOX15B的兩對(duì)siRNA序列如表1所示。將分離后的睪丸支持細(xì)胞(1×106個(gè)·mL-1)接種于6孔板,培養(yǎng)24 h,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%～80%時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h,去除完全培養(yǎng)基,加入無(wú)血清培養(yǎng)基使細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)利于后續(xù)轉(zhuǎn)染。首先,按照每孔7 μL的siRNA與250 μL的Opiti-MEM培養(yǎng)基混合、每孔5 μL的siRNA和250 μL的Opiti-MEM培養(yǎng)基混合,在37 ℃下孵育5 min后,將含有siRNA和Lipofectamine 2000的Opiti-MEM培養(yǎng)基混合,在37 ℃下再繼續(xù)孵育20 min,然后分別將500 μL的混合液體加入到每個(gè)孔中。轉(zhuǎn)染8 h后更換培養(yǎng)基,然后繼續(xù)培養(yǎng)56 h后,在44 ℃恒溫培養(yǎng)箱中熱處理30 min(熱應(yīng)激模型)后對(duì)相應(yīng)物質(zhì)進(jìn)行分析。

1.2.3 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 睪丸支持細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后,用0.25%胰酶消化細(xì)胞2 min,300 g離心5 min,棄上清。然后用1 mL的Binding Buffer重懸細(xì)胞沉淀,300 g離心10 min。用1 mL的Binding Buffer緩沖液輕輕重懸細(xì)胞沉淀。然后,取100 μL以上液體(細(xì)胞數(shù)達(dá)1×106個(gè)·mL-1)混合5 μL的V-FITC,25 ℃孵育20 min,在檢測(cè)之前,樣本輕輕混合5 μL的PI溶液,25 ℃孵育5 min。再加入400 μL的PBS溶液充分混勻,用流式細(xì)胞儀1 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 蛋白表達(dá)的檢測(cè) 用含有1%磷酸酶抑制劑與1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取睪丸支持細(xì)胞的蛋白,用BCA試劑盒測(cè)定總的蛋白濃度,在8%～12%SDS-PAGE聚丙酰胺凝膠電泳后分離蛋白,將蛋白轉(zhuǎn)移PVDF膜。用5%脫脂牛奶或5%牛血清白蛋白孵育膜2 h,然后用一抗在4 ℃孵育過(guò)夜。與山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗25 ℃孵育2 h后,使用ECL發(fā)光液在凝膠成像系統(tǒng)中顯影。

1.2.5 ROS水平檢測(cè) 用96孔板培養(yǎng)細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞按照試驗(yàn)要求進(jìn)行處理后,用冷的PBS溶液清洗細(xì)胞3次。按照制造商說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,以ROS熒光探針:無(wú)血清培養(yǎng)基=1∶1 500的比例進(jìn)行稀釋熒光探針,每個(gè)孔加入100 μL的含ROS熒光探針的培養(yǎng)基,在37 ℃避光孵育2 h。棄去原有培養(yǎng)基,加入100 μL新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)基。用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)525 nm處測(cè)量熒光值。

1.2.6 MDA水平檢測(cè) 當(dāng)細(xì)胞按照試驗(yàn)要求進(jìn)行處理后,用冷的PBS溶液清洗細(xì)胞3次。按照制造商說(shuō)明書(shū),每個(gè)培養(yǎng)皿加入100 μL的MDA裂解液,用超聲波破碎儀將細(xì)胞完全破碎。設(shè)置空白組、標(biāo)準(zhǔn)品組和試驗(yàn)組。再向各個(gè)管子中加入1 mL的MDA工作液。在95 ℃水浴中煮沸40 min。3 000×g離心10 min,取上清200 μL加入96孔酶標(biāo)管中,在酶標(biāo)儀的532 nm處檢測(cè)吸光度。

1.2.7 脂質(zhì)過(guò)氧化物檢測(cè) 細(xì)胞(細(xì)胞計(jì)數(shù)為1×106個(gè)·mL-1)裂解于200 μL的PBS中,超聲破碎獲得上清液,7 260×g離心10 min。50 μL的標(biāo)準(zhǔn)樣品加入標(biāo)準(zhǔn)孔。10 μL的上清液溶于40 μL樣品稀釋液中。每孔用100 μL酶標(biāo)試劑,37 ℃孵育60 min。每孔清洗5次后,加入顯色劑A、B各50 μL,37 ℃孵育15 min。每孔中加入50 μL的終止液,在15 min內(nèi)用酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)樣品的吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用GraphPad Prism和SPSS25進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。單因素方差分析用于分析3個(gè)組以上的數(shù)據(jù)。采用Tukey試驗(yàn)多重比較各組間的差異。所有數(shù)據(jù)均以“平均值±SEM”表示。P<0.05被認(rèn)為是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義即差異顯著,P<0.01被認(rèn)為是差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 黃芩素對(duì)熱應(yīng)激條件下脂質(zhì)過(guò)氧化物、氧化應(yīng)激水平與細(xì)胞凋亡的影響

熱應(yīng)激后睪丸支持細(xì)胞中8-HETE和15-HETE的水平上升,與對(duì)照組相比,分別升高了53.37%(P<0.01)、42.25%(P<0.01);與熱應(yīng)激組相比,黃芩素與熱應(yīng)激共同作用下8-HETE和15-HETE的水平分別下降了15.13%(P<0.01)、62.10%(P<0.01)(圖1A、1B)。從圖1C、1D可以看出,熱應(yīng)激提高了睪丸支持細(xì)胞中MDA與ROS水平,與對(duì)照組相比,分別升高了32.32%(P<0.01)、422.82%(P<0.01);與熱應(yīng)激組相比,在黃芩素與熱應(yīng)激共同作用下MDA、ROS的水平分別下降了65.31%(P<0.01)、43.60%(P<0.01)。圖1E結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,熱應(yīng)激組的細(xì)胞凋亡率顯著提高了475.77%(P<0.01); 黃芩素與熱應(yīng)激共同作用于睪丸支持細(xì)胞后凋亡率發(fā)生了顯著的下降,相比于熱應(yīng)激組,降低了318.97%(P<0.01)。

A.黃芩素對(duì)熱應(yīng)激條件下8-HETE含量的影響;B.黃芩素對(duì)熱應(yīng)激條件下15-HETE含量的影響;C.黃芩素對(duì)熱應(yīng)激條件下MDA的影響;D.黃芩素對(duì)熱應(yīng)激條件下ROS的影響;E.黃芩素對(duì)熱應(yīng)激條件下睪丸支持細(xì)胞凋亡的影響。*. P<0.05;**. P<0.01;無(wú)標(biāo)注表示P>0.05,下同A.Effects of baicalein on the content of 8-HETE under heat stress; B. Effects of baicalein on the content of 15-HETE under heat stress; C.Effect of baicalein on MDA under heat stress; D.Effects of baicalein on ROS under heat stress; E. Effects of baicalein on apoptosis of sertoli cells under heat stress. *. P<0.05;**. P<0.01; Unlabeled indicates no significant difference (P>0.05), the same as below圖1 黃芩素對(duì)熱應(yīng)激條件下脂質(zhì)過(guò)氧化物、氧化應(yīng)激水平與細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effects of baicalein on lipid peroxides, oxidative stress levels and cell apoptosis under heat stress

2.2 黃芩素和 ALOX15B的siRNA對(duì)熱應(yīng)激條件下JNK激活的影響

從圖2A可以看出,熱處理顯著提高了磷酸化JNK的蛋白水平。與對(duì)照組相比,磷酸化JNK提高了30.15%(P<0.01)。與單獨(dú)熱處理組相比,50 μM的黃芩素使熱處理?xiàng)l件下支持細(xì)胞中磷酸化JNK的蛋白水平降低了34.11%(P<0.01)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證ALOX15B對(duì)熱處理?xiàng)l件下JNK激活的影響,通過(guò)siRNA抑制ALOX15B表達(dá),圖2B結(jié)果發(fā)現(xiàn),ALOX15B的siRNA1和siRNA2也有類似的效果,與熱處理組相比,二者使磷酸化JNK的蛋白水平分別下降了59.72%(P<0.01)、33.46%(P<0.01)。

A.黃芩素對(duì)熱應(yīng)激條件下支持細(xì)胞中JNK和磷酸化JNK的蛋白水平的影響;B.ALOX15B的siRNA對(duì)熱應(yīng)激條件下支持細(xì)胞中JNK和磷酸化JNK的蛋白水平的影響A.Effects of baicalein on JNK and phosphorylated JNK protein levels in sertoli cells under heat stress; B.Effects of ALOX15B siRNA on levels of JNK and phosphorylated JNK proteins in sertoli cells under heat stress圖2 黃芩素與ALOX15B siRNA對(duì)熱應(yīng)激條件下JNK激活的影響Fig.2 Effects of baicalein and ALOX15B siRNA on JNK activation under heat stress

2.3 JNK抑制劑SP600125對(duì)熱應(yīng)激條件下JNK激活、p53和細(xì)胞凋亡的影響

從圖3A可以看出,與對(duì)照組相比,SP600125降低了磷酸化JNK的蛋白水平,降低了57.33%(P<0.01)。SP600125與熱應(yīng)激的共同作用也減少了磷酸化JNK的蛋白水平,與單獨(dú)熱應(yīng)激組相比,降低了46.72%(P<0.01);熱應(yīng)激提高了p53的蛋白水平,與對(duì)照組相比,上升了89.16%(P<0.01)。與熱應(yīng)激組相比,p53的蛋白水平在SP600125和熱應(yīng)激的共同作用下,降低了16.97%(P<0.01)。從圖3B可以看出,與對(duì)照組相比,熱應(yīng)激組的細(xì)胞的凋亡率顯著提高了475.77%(P<0.01)。與單獨(dú)熱應(yīng)激組相比,SP600125和熱應(yīng)激的共同作用下的細(xì)胞凋亡率顯著降低了133.17%(P<0.01)。

A.SP600125對(duì)熱應(yīng)激條件下睪丸支持細(xì)胞中JNK、磷酸化JNK和p53蛋白水平的影響;B.SP600125對(duì)熱應(yīng)激條件下睪丸支持細(xì)胞凋亡率的統(tǒng)計(jì)圖A.Effects of SP600125 on JNK, phosphorylated JNK and p53 protein levels in sertoli cells under heat stress; B.Statistical graph of the apoptosis rate of sertoli cells by SP600125 protein levels under heat stress圖3 SP600125對(duì)熱應(yīng)激條件下睪丸支持細(xì)胞中JNK激活、p53和細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effects of SP600125 on JNK activation, p53 and apoptosis in Sertoli cells under heat stress

2.4 JNK抑制劑SP600125對(duì)熱應(yīng)激條件下ALOX15B蛋白表達(dá)與脂質(zhì)過(guò)氧化物8-HETE、15-HETE的影響

從圖4A可以看出,熱應(yīng)激提高了ALOX15B的蛋白水平,與對(duì)照組相比,上升了103.10%(P<0.01);SP600125與熱應(yīng)激共同作用下睪丸支持細(xì)胞中ALOX15B的蛋白水平發(fā)生了顯著的下降,與熱應(yīng)激組相比,ALOX15B的蛋白水平降低了45.89%(P<0.01)。從圖4B、4C可以看出,熱應(yīng)激提高了細(xì)胞中脂質(zhì)過(guò)氧化物8-HETE、15-HETE的含量,與對(duì)照組相比,分別提升了37.89%(P<0.01)、13.86%(P<0.05);與熱應(yīng)激組相比,SP600125和熱應(yīng)激的共同作用下,ALOX15B的脂質(zhì)過(guò)氧化物8-HETE、15-HETE的含量分別降低了16.48%(P<0.01)、13.47%(P<0.05)。

A.SP600125對(duì)熱應(yīng)激條件下睪丸支持細(xì)胞中ALOX15B蛋白水平的影響;B.SP600125對(duì)熱應(yīng)激條件下睪丸支持細(xì)胞中8-HETE含量的影響;C.SP600125對(duì)熱應(yīng)激條件下睪丸支持細(xì)胞中15-HETE含量的影響A.Effects of SP600125 on ALOX15B protein levels in sertoli cells under heat stress; B.Effects of SP600125 on the content of 8-HETE in sertoli cells under heat stress; C.Effects of SP600125 on the content of 15-HETE in sertoli cells under heat stress圖4 SP600125對(duì)熱應(yīng)激條件下睪丸支持細(xì)胞中ALOX15B蛋白水平、8-HETE與15-HETE的影響Fig.4 Effects of SP600125 on ALOX15B protein levels, 8-HETE and 15-HETE in sertoli cells under heat stress

2.5 JNK抑制劑SP600125對(duì)熱應(yīng)激條件下MDA、ROS的影響

從圖5A、5B可以看出,與熱應(yīng)激組相比,SP600125和熱應(yīng)激的共同作用下細(xì)胞中MDA和ROS都發(fā)生了顯著的下降,MDA水平降低了21.15%(P<0.01),ROS的水平降低了205.35%(P<0.01)。

A.SP600125對(duì)熱應(yīng)激條件下睪丸支持細(xì)胞中MDA的影響;B.SP600125對(duì)熱應(yīng)激條件下睪丸支持細(xì)胞中ROS的影響A.The effect of SP600125 on MDA in sertoli cells under heat stress; B.Effects of SP600125 on ROS in sertoli cells under heat stress圖5 SP600125對(duì)熱應(yīng)激條件下睪丸支持細(xì)胞中MDA、ROS的影響Fig.5 Effects of SP600125 on MDA and ROS in sertoli cells under heat stress

3 討 論

ALOX15B是睪丸支持細(xì)胞中形成脂質(zhì)過(guò)氧化物的主要酶。豬ALOX15B基因與人和小鼠的ALOX15B基因高度同源,主要形成8-HETE、15-HETE等過(guò)氧化物[21-22]。ALOX15B產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化物15-HETE可誘導(dǎo)K-562細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激,進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡[23]。在本試驗(yàn)中,熱應(yīng)激增強(qiáng)了睪丸支持細(xì)胞中ALOX15B的表達(dá),同時(shí)增加了8-HETE與15-HETE水平,進(jìn)而誘發(fā)了氧化應(yīng)激,促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。在熱應(yīng)激條件下,抑制睪丸支持細(xì)胞中ALOX15B的表達(dá)不僅降低了8-HETE、15-HETE、MDA和ROS的產(chǎn)生,而且減少了細(xì)胞凋亡。出現(xiàn)這一現(xiàn)象可能是因?yàn)橹|(zhì)過(guò)氧化物一方面能夠促進(jìn)ROS的進(jìn)一步產(chǎn)生[24-25];另一方面它們的降解會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生大量的丙二醛,從而誘發(fā)氧化應(yīng)激[26],進(jìn)而加速細(xì)胞凋亡[27-29]。因此,ALOX15B通過(guò)其過(guò)氧化產(chǎn)物在細(xì)胞中加速氧化應(yīng)激的發(fā)生,進(jìn)而在熱應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要作用。

熱應(yīng)激可激活小腸上皮細(xì)胞中的JNK信號(hào)通路[30]。本試驗(yàn)結(jié)果證明,在熱應(yīng)激條件下,睪丸支持細(xì)胞中的JNK磷酸化蛋白水平升高。Mitra等[31]的試驗(yàn)結(jié)果證明,JNK信號(hào)通路參與了由雷公藤甲素誘導(dǎo)的小鼠睪丸支持細(xì)胞凋亡。有研究結(jié)果也表明,ALOX5、ALOX12、ALOX15及其產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化物5-HETE、12-HETE、15-HETE均可激活JNK信號(hào)通路[32-33]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在熱應(yīng)激條件下,通過(guò)黃芩素或ALOX15B的siRNA抑制ALOX15B的表達(dá)后,均可降低JNK磷酸化水平,并抑制細(xì)胞凋亡,這表明在熱應(yīng)激條件下睪丸支持細(xì)胞中ALOX15B可調(diào)控JNK的激活,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。p53是著名的腫瘤因子[34],多種不利因素誘導(dǎo)可引發(fā)p53水平增加[35-36],影響著細(xì)胞的存活[37],而磷酸化的JNK能夠激p53[38]。在PC-12細(xì)胞,JNK-p53參與了粘菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[39]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在熱應(yīng)激條件下仔豬睪丸支持細(xì)胞中p53表達(dá)增加,JNK抑制劑則可以抑制熱應(yīng)激條件下p53的表達(dá)和仔豬睪丸支持細(xì)胞的凋亡,這表明,在熱應(yīng)激下,ALOX15B通過(guò)JNK-p53調(diào)節(jié)熱應(yīng)激條件下支持細(xì)胞凋亡。

本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),當(dāng)JNK抑制劑抑制熱應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡時(shí),JNK能夠反饋抑制ALOX15B的表達(dá),降低8-HETE、15-HETE的含量,減少脂質(zhì)過(guò)氧化的副產(chǎn)物丙二醛和細(xì)胞中ROS的水平,改變細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平,進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡,這表明,JNK可能通過(guò)反饋ALOX15B的表達(dá)負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡,這與銀松素誘導(dǎo)脂多糖預(yù)處理后的白細(xì)胞凋亡中JNK抑制劑可抑制ALOX15的表達(dá)并減少白細(xì)胞凋亡的結(jié)果一致[40]。這暗示,在本試驗(yàn)的熱應(yīng)激條件下,JNK信號(hào)通路一方面能促進(jìn)細(xì)胞凋亡,另一方面能通過(guò)負(fù)反饋?zhàn)饔谜{(diào)節(jié)細(xì)胞中的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài),從而將凋亡控制在一定水平,以防止細(xì)胞的過(guò)度凋亡,本課題組前期研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn),撤除熱應(yīng)激后細(xì)胞的活力能逐漸恢復(fù)也證明了這一點(diǎn)。

4 結(jié) 論

熱應(yīng)激條件下,ALOX15B的表達(dá)促進(jìn)了睪丸支持細(xì)胞中脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生,并增加MDA和ROS的產(chǎn)生,誘導(dǎo)細(xì)胞的氧化應(yīng)激,進(jìn)而激活JNK-p53通路并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;JNK信號(hào)通路可反饋抑制ALOX15B的表達(dá)及脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生,改變細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài),進(jìn)而對(duì)細(xì)胞凋亡起到負(fù)反饋?zhàn)饔谩?/p>