陶 潔,李本強(qiáng),程靖華,石 迎,劉佩紅,劉惠莉*

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海 201106;2.上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201106;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部區(qū)域特色畜禽品種疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(部省共建),上海 201106)

我國肉鴿規(guī)模化養(yǎng)殖起步晚,上海市和廣東省分別于1976年和1980年引進(jìn)國外肉鴿品種,自此由南向北、由沿海到內(nèi)地迅速展開,逐步形成了中國的肉鴿養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)[1]。目前,我國肉鴿產(chǎn)業(yè)仍以傳統(tǒng)飼養(yǎng)模式為主,肉鴿生長和飼養(yǎng)管理研究數(shù)據(jù)缺乏[2]。近年來,隨著肉鴿消費(fèi)需求量的增加,肉鴿產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究逐步受到重視。

眾所周知,腸道微生物群落具有生物多樣性功能,與健康和疾病息息相關(guān),除了協(xié)助宿主營養(yǎng)吸收和能量攝取、調(diào)控新陳代謝,還可促進(jìn)腸道發(fā)育,參與免疫調(diào)控以增強(qiáng)抵抗力等[3]。影響動物腸道菌群變化的誘因很多,包括飼養(yǎng)管理水平、飼料營養(yǎng)配比、疾病以及動物機(jī)體發(fā)育程度等[4],特別是乳鴿,在斷乳后因各種外界因素引起菌群失調(diào),導(dǎo)致腹瀉[5]。

目前,宏基因組(metagenome)技術(shù)是微生物多樣性研究的主要手段,不僅能挖掘新基因及其代謝產(chǎn)物等,而且在酶的發(fā)現(xiàn)、新藥開發(fā)、抗生素耐藥組等方面具有廣闊應(yīng)用前景[6]。近年來,隨著抗生素的大量使用,抗生素耐藥問題已成為全球公共衛(wèi)生面臨的嚴(yán)峻威脅[7]。因此,本研究擬利用宏基因組技術(shù)對上海某肉鴿養(yǎng)殖場青年鴿和產(chǎn)鴿糞便樣品進(jìn)行微生物菌群差異分析,豐富肉鴿腸道微生物多樣性數(shù)據(jù),為疾病防控提供參考。同時(shí),深入挖掘分析肉鴿體內(nèi)抗生素耐藥基因譜,以期發(fā)揮預(yù)警功效,助力肉鴿健康養(yǎng)殖。

1 材料與方法

1.1 糞便樣品來源

從上海某肉鴿養(yǎng)殖場分別采集青年鴿(2～5月齡)和產(chǎn)鴿(5月齡以上樣品)糞便樣品各20份,分別命名為RP組和LP組。RP組包含2個測序樣品:JD-1和JD-2。LP組包含2個測序樣品:JD-3和JD-4。每個測序樣品中包含10份來自不同棚舍的鴿糞樣。

1.2 高通量測序與功能預(yù)測分析

基于Illumina NovaSeq/HiSeq高通量測序平臺,采用全基因組鳥槍法(Whole Genome Shotgun, WGS)策略,利用OMEGA Mag-Bind Soil DNA Kit(Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA)提取樣品基因組DNA,進(jìn)一步利用Illumina TruSeq Nano DNA LT Library Preparation Kit構(gòu)建文庫,并進(jìn)行雙端(Paired-end,PE)測序。對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行篩查和過濾,用Cutadapt(v1.2.1)[8]軟件去除3′端潛在接頭序列,以及小于50 bp和含有模糊堿基的序列;利用minimap2軟件比對質(zhì)控后的有效序列與宿主序列,舍棄與宿主有匹配的序列;最后利用Kraken2和Kaiju兩種方法進(jìn)行物種注釋[9]。采用MetaGeneMark軟件識別重疊群序列(contigs)中的開放閱讀框, 并預(yù)測編碼區(qū)域,獲得對應(yīng)基因和蛋白序列文件[10],按相似度95%,對齊區(qū)域覆蓋度90%進(jìn)行去冗余,獲得非冗余的蛋白序列集合,并與NCBI的nr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對, 設(shè)置靈敏度參數(shù)為5.7,lca-mode 為4[11]。將上述過濾處理后的蛋白序列集與常用蛋白數(shù)據(jù)庫比對,進(jìn)行KEGG、EggNOG和CAZy注釋分析[12]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用R軟件進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)、Venn分析、PLS-DA和LEfSe分析[13]。

2 結(jié) 果

2.1 測序數(shù)據(jù)整理和評估

對4個肉鴿糞便樣品進(jìn)行宏基因鳥槍法測序,得到309 617 334個原始序列共46.75 GB的原始數(shù)據(jù)。質(zhì)控分析顯示,這4個樣品的有效序列比例均高于98.5%,N50長度為1 698～2 321 bp(表1)。

表1 具體測序信息Table 1 Sequencing informations

2.2 腸道菌群組成結(jié)構(gòu)特征

基于OTUs分類結(jié)果,共注釋到細(xì)菌10門27綱57目117科323屬1 053種。如圖1A,兩組樣品中相對豐度最高的3個菌門均為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌(Proteobacteria)和放線菌(Actinobacteria)。其中厚壁菌(LP 40.34%,RP 57.49%)和變形菌(LP 54.63%,RP 34.68%)相對豐度之和超過90%,是肉鴿糞便樣品中的優(yōu)勢菌。放線菌為第3豐度菌門,在青年鴿和產(chǎn)鴿樣品中分布比例相似(LP 5.02%,RP 7.82%)。

圖1 青年鴿和產(chǎn)鴿腸道菌群在門水平(A)和屬水平(B)的相對豐度Fig.1 Relative abundance of intestinal microbiota of young pigeons (RP) and older pigeons (LP) at phylum (A) and genus (B) levels

在屬水平上,LP組相對豐度最高的5個菌屬是:埃希氏桿菌屬(48.19%)、腸球菌屬(13.00%)、乳桿菌屬(8.31%)、氣球菌屬(9.55%)、葡萄球菌屬(4.55%);RP組相對豐度最高的5個菌屬是:腸球菌屬(26.56%)、埃希氏桿菌屬(22.11%)、乳桿菌屬(12.14%)、氣球菌屬(10.27%)、嗜冷桿菌屬(8.92%)(圖1B)。

2.3 肉鴿腸道菌群差異物種

在屬水平分析青年鴿和產(chǎn)鴿體內(nèi)差異物種,Venn圖顯示,LP和RP組共有700種相同菌種,137和216種差異菌種(圖2A)。PLS-DA分析顯示,RP和LP組具有分離現(xiàn)象(圖2B)?；贛EGAN的多樣本分類等級樹圖顯示(圖2C),腸球菌屬(Enterococcus)中,僅3個物種是LP組占高比例,其余均為RP組占高比例,其中解糖腸球菌(Enterococcussaccharolyticus)幾乎為RP組特有。RP組中雙歧桿菌(Bifidobacterium)、棒狀桿菌(Corynebacteriun)、嗜冷桿菌(Psychrobacter)、鏈球菌屬(Streptococcus)含量顯著高于LP組。而LP組金黃色葡萄球菌屬(Staphyloccus)、短狀桿菌屬(Brachybacterium)、庫特氏菌屬(Kurthia)和埃希氏菌屬(Escherichia)含量顯著高于RP組。

A. 韋恩圖; B. PLS-DA分析; C. MEGAN分類等級樹A. Venn diagram; B. PLS-DA analysis; C. MEGAN classification rank tree圖2 青年鴿和產(chǎn)鴿體內(nèi)差異物種分析Fig.2 Species difference analysis of gut microbiota in young pigeons and older pigeons

2.4 肉鴿腸道微生物宏基因組的代謝特征

eggNOG分析顯示未知功能基因數(shù)量最高,已知功能基因中復(fù)制、重組和修復(fù)相關(guān)基因占比最高(圖3A)。KEGG分析顯示(圖3B),代謝組(Metabolism)豐度最高,其中碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)和氨基酸代謝(Amino acid metabolism)是最豐富的功能門類,分別占總Reads的16.87%和9.97%。比對碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(CAZy),共預(yù)測有118 642種CAZy,在六大類酶分子中糖苷水解酶(Glycoside Hydrolases, GHs)和糖苷轉(zhuǎn)移酶(Glycosyl Transferases, GTs)占比最高,分別為45.17%和32.88%(圖3C)。進(jìn)一步利用LEfSe對青年鴿和產(chǎn)鴿腸道微生物菌群功能差異分析發(fā)現(xiàn),差異表達(dá)基因主要富集于5個KEGG通路(圖3D):生物合成(Biosynthesis)代謝通路、硫辛酸代謝(Lipod acid metabolism)通路、氧化磷酸化(Oxidative phosphorlation)通路和p53信號通路和阿米巴病通路。

A. eggNOG分析; B. KEGG分析; C. LEfSe分析A. eggnog analysis; B. KEGG analysis; C. LEfSe analysis圖3 肉鴿腸道微生物菌群代謝功能差異分析Fig.3 Metabolic function differential analysis of gut microbiota in pigeons

2.5 抗生素耐藥基因挖掘與分析

挖掘肉鴿體內(nèi)抗生素耐藥基因(Antibiotic resistance genes, ARGs)種類和組成,結(jié)果顯示,青年鴿和產(chǎn)鴿體內(nèi)ARGs組成均一度和相似度較高,共11大類198種ARGs,占比順序?yàn)?多重耐藥類>大環(huán)內(nèi)脂類>磺胺類>β-內(nèi)酰胺類>四環(huán)素類>萬古霉素類>喹諾酮類>氨基糖苷類>elfamycin>氯霉素類>其他ARGs。其中多重耐藥類ARGs占40%以上(圖4A)。

A. ARGs分類和占比分析; B. ARGs預(yù)測分析A. ARGs classification and proportion analysis; B. ARGs prediction 圖4 肉鴿抗生素耐藥基因譜分析Fig.4 Analysis of antibiotic resistance gene profile in pigeons

青年鴿體內(nèi)rpoC、Isa、YybT、gshF、gyrB、ileS、A1067、Erm、rpsA等ARGs豐富最高,產(chǎn)鴿體內(nèi)mshA、gyrB、A1067、tetA、gyrA、fusA、YybT等ARGs豐富最高(圖4B),主要源自大環(huán)內(nèi)酯類、多重耐藥類、喹諾酮類、氨基糖苷類和磺胺類抗生素。

3 討 論

腸道菌群構(gòu)成腸道微生態(tài)系統(tǒng),通過與宿主間相互作用維持相對穩(wěn)定狀態(tài),與機(jī)體健康狀態(tài)密切相關(guān)[14]。但目前肉鴿腸道微生物菌群方面研究甚少,阻礙了肉鴿產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

本研究利用宏基因組學(xué)技術(shù)對肉鴿糞便中微生物菌群多樣性進(jìn)行高通量分析,明確肉鴿腸道優(yōu)勢菌門為厚壁菌、變形菌和放線菌。這與肉雞腸道菌群分布類似,肉雞十二指腸、空腸和回腸部位厚壁菌門占比最高(>60%)[15],符合肉鴿具有強(qiáng)大消化吸收功能的特性。本研究通過分析青年鴿和產(chǎn)鴿糞便中微生物多樣性差異,發(fā)現(xiàn)兩者之間存在一定差異,青年鴿體內(nèi)有益菌如雙歧桿菌含量顯著高于產(chǎn)鴿,而產(chǎn)鴿體內(nèi)埃希氏菌屬含量顯著高于青年鴿。值得注意的是,青年鴿糞便中多種腸球菌含量都高于產(chǎn)鴿。腸球菌屬于乳酸菌(LAB),益生腸球菌可有效抑制腸道病原菌,維護(hù)宿主腸道健康[16]。目前,屎腸球菌和糞腸球菌是最常用的益生腸球菌,屬于飼料級微生物菌種[17]。本研究中青年鴿中屎腸球菌含量顯著高于產(chǎn)鴿,提示隨著日齡增加,產(chǎn)鴿體內(nèi)有益菌群下降,病原菌數(shù)量增加。

抗生素耐藥基因遞增是各大養(yǎng)殖群體中普遍存在的難題[18],導(dǎo)致臨床用藥效果不理想,嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)健康發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)肉鴿體內(nèi)ARGs多樣性豐富,多重耐藥類ARGs呈現(xiàn)高流行率。除了高豐度的β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類等ARGs,肉鴿體內(nèi)萬古霉素和利福平等耐藥基因流行率也較高。已報(bào)道結(jié)核分枝桿菌rpoA、rpoB、rpoC和rpoD位點(diǎn)突變可影響金黃色葡萄球菌等對利福平的敏感性[19]。而poA、rpoB和rpoC在青年鴿和產(chǎn)鴿體內(nèi)具有顯著的高流行率。肉鴿是一種在短期內(nèi)即上市售賣的禽類產(chǎn)品,抗生素問題尤需注意,過度使用抗生素不僅造成抗生素殘留,而且會導(dǎo)致抗生素耐藥性問題。因此,在肉鴿養(yǎng)殖管理中,不僅要加強(qiáng)驅(qū)蟲和消毒,保持環(huán)境衛(wèi)生,而且特別要重視用藥管理。

4 結(jié) 論

本研究系統(tǒng)分析了不同日齡肉鴿的腸道菌群差異和抗生素耐藥基因,可為鴿場生物安全防控和飼料營養(yǎng)改善等提供數(shù)據(jù)參考。