李廣興,陳 陽,陳凱婷,武夢林,張 迪,黃小丹*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,哈爾濱 150030;2.黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學(xué)重點實驗室,哈爾濱 150030)

鄰苯二甲酸二-2-乙基己酯[di(2-ethylhexyl)phthalate, DEHP]作為一種合成聚合物的增塑劑,已被廣泛應(yīng)用于紡織品、醫(yī)療器械、電子產(chǎn)品和個人護(hù)理用品等方面[1]。而增塑劑會在材料中遷移并隨著時間的推移從材料中滲出,最終進(jìn)入環(huán)境[2]。隨著DEHP的生產(chǎn)和使用量越來越大,其釋放在環(huán)境中的含量也呈逐年上升趨勢[3]。由于DEHP不斷地釋放到環(huán)境中,從而通過飲食,呼吸和皮膚接觸進(jìn)入人體,進(jìn)而危害人體健康,這引起了人們對其安全性及其對人體健康的潛在影響的一些擔(dān)憂[4]。廣泛的研究表明,DEHP對人和動物都有有害影響,可誘導(dǎo)生殖毒性、神經(jīng)毒性和心臟毒性,此外還有免疫毒性[5-8]。據(jù)報道,在哮喘小鼠模型中,DEHP增加了總IgE水平,此外,BALF中酸性粒細(xì)胞數(shù)量和肺中酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白(ECP)明顯增加[9]。研究人員發(fā)現(xiàn)DEHP可以改變骨髓中B細(xì)胞的成熟和分化[10]。此外,DEHP使小鼠巨噬細(xì)胞發(fā)生極化,M1極化降低,而M2極化增強(qiáng),提示DEHP可以影響巨噬細(xì)胞的體內(nèi)免疫反應(yīng),顯著降低其腫瘤預(yù)防能力[11]。DEHP持續(xù)灌胃45 d,會導(dǎo)致鵪鶉脾受損,組織病理學(xué)觀察脾組織中可見脾小體邊界和細(xì)胞間隙增大[12]。大量研究表明,DEHP等環(huán)境污染物造成的細(xì)胞損傷與氧化應(yīng)激有關(guān)[13-14]。值得注意的是,DEHP通過增加ROS的產(chǎn)生,從而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,增加Bax/cytochrome-c/Caspase-3的表達(dá)水平,抑制BCL-2的表達(dá),啟動大鼠顆粒細(xì)胞的線粒體凋亡途徑[15]。此外,氧化應(yīng)激損傷通過激活細(xì)胞程序性壞死途徑,增加壞死相關(guān)基因TNF-α、RIPK1、RIPK3、MLKL和JNK的表達(dá),介導(dǎo)雞腎細(xì)胞程序性壞死[16]。

PTEN/PI3K/AKT通路參與了細(xì)胞生長、凋亡以及與環(huán)境有關(guān)的多個細(xì)胞過程,并與氧化應(yīng)激的產(chǎn)生密切相關(guān)[17]。多項研究表明,當(dāng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時,會刺激ROS的過度產(chǎn)生,進(jìn)而激活PTEN的表達(dá),從而抑制PI3K/AKT表達(dá),這是導(dǎo)致細(xì)胞損傷的主要途徑[18-19]。PTEN/PI3K/AKT通路是細(xì)胞存活的保護(hù)通路,而氧化應(yīng)激也常常通過調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/AKT通路而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。抑制miR-21能上調(diào)卵巢癌細(xì)胞中PTEN表達(dá),阻斷PI3K/AKT通路的活性,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[20]。此外,不同劑量的CPF暴露草魚肝細(xì)胞,PTEN通過其脂質(zhì)磷酸酶活性作用于PI3K/AKT通路,阻斷該通路活性從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死[19]。腫瘤壞死因子(TNF)誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死是受到PI3K/AKT的抑制,結(jié)果發(fā)現(xiàn),RIP1、RIP3和MLKL的表達(dá)水平升高,表明抑制PI3K/AKT通路可激活細(xì)胞壞死通路,最終導(dǎo)致細(xì)胞程序性壞死[21]。值得注意的是,雙酚A(BPA)暴露通過上調(diào)Bax、caspase-3、caspase-9、RIP1、RIP3和MLKL的表達(dá),下調(diào)BCL-2表達(dá),加重了缺硒雞腎細(xì)胞凋亡和程序性壞死,PI3K/AKT的負(fù)調(diào)控在此過程中發(fā)揮著重要作用[22]。此外,硒減輕了鎘暴露通過抑制PI3K/AKT途徑導(dǎo)致的凋亡和程序性壞死,改善了鯉魚脾淋巴細(xì)胞的損傷[23]。

綜上所述,氧化應(yīng)激調(diào)控PTEN/PI3K/AKT通路,在細(xì)胞凋亡和壞死中發(fā)揮著重要作用。此外,DEHP是一種有害的環(huán)境污染物。有研究表明,DEHP可引起細(xì)胞氧化應(yīng)激和降低細(xì)胞中PI3K/AKT的表達(dá)水平,最終誘導(dǎo)細(xì)胞損傷[24-25]。然而,目前尚未有關(guān)于DEHP暴露通過ROS/PTEN/PI3K/AKT引起HD11細(xì)胞凋亡和程序性壞死的研究。因此,本試驗通過建立DEHP體外暴露模型,通過吖啶橙/澳化乙錠(AO/EB)染色法和流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡及壞死信號,氧化應(yīng)激試劑盒檢測氧化與抗氧化指標(biāo),qRT-PCR和Western blot檢測PTEN/PI3K/AKT信號通路,凋亡相關(guān)基因(Bax、Caspase-3、Caspase-9和BCL-2)以及壞死相關(guān)基因(RIPK1、RIPK3和MLKL),探討其在免疫毒性進(jìn)展中的具體機(jī)制。本試驗結(jié)果將為進(jìn)一步探索塑化劑的免疫毒性機(jī)制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DEHP(純度≥99.0%,MCE,美國)。CCK8試劑盒、BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司,上海,中國)。青霉素、鏈霉素、胰酶(Gibco,美國)。胎牛血清(BioInd,上海,中國)。辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔/鼠二抗(Abmart,上海,中國)。

1.2 HD11細(xì)胞培養(yǎng)

HD11細(xì)胞在RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 IU·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素)中,于37 ℃、飽和濕度條件下,含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長狀況,每1 d傳代1次。將HD11細(xì)胞接種到每孔細(xì)胞密度為2×106的96孔板中。每孔加入細(xì)胞懸液100 μL,待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時進(jìn)行DEHP處理。DEHP暴露濃度分別為0、30、60、90、120、150、180、210、240 μmol·L-1DEHP進(jìn)行處理。DEHP暴露24 h后,每孔加入10 μL CCK8,隨后在溫箱中繼續(xù)孵育2 h,用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。按照說明書的公式計算不同濃度DEHP處理細(xì)胞后的細(xì)胞活力,并以折線圖的形式呈現(xiàn)不同濃度DEHP暴露HD11細(xì)胞后的細(xì)胞活力。使用軟件SPSS分析半數(shù)抑制濃度(IC50)和95%置信區(qū)間。

1.3 HD11細(xì)胞分組

根據(jù)DEHP暴露對HD11細(xì)胞24 h的IC50,應(yīng)用細(xì)胞存活率為≥80%的30 μmol·L-1DEHP為最低劑量,最終在DEHP致HD11細(xì)胞凋亡和程序性壞死及氧化應(yīng)激作用的研究中,本試驗用不同濃度的DEHP (0、30、60、90 μmol·L-1)處理HD11細(xì)胞24 h分別命名為對照組(C組)、低劑量組(L組)、中劑量組(M組)和高劑量組(H組)。

1.4 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的測定

按照南京建成試劑盒說明書對LMH細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理。用酶標(biāo)儀在525 nm/532 nm/520 nm/550 nm/412 nm波長下測定ROS/MDA/T-SOD/T-AOC/GSH-PX的吸光度。

1.5 AO/EB染色和流式細(xì)胞術(shù)

1.5.1 AO/EB染色 每100 μL細(xì)胞懸液加入4 μL AO/EB混合液(AO∶EB=1∶1),在室溫避光培養(yǎng)5 min后,將其放入熒光顯微鏡觀察形態(tài)學(xué)改變,然后拍照記錄。根據(jù)以下的公式計算細(xì)胞凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/(正?；罴?xì)胞數(shù)+凋亡細(xì)胞數(shù)+壞死細(xì)胞數(shù))×100%。壞死指數(shù)=壞死細(xì)胞數(shù)/(正?；罴?xì)胞數(shù)+凋亡細(xì)胞數(shù)+壞死細(xì)胞數(shù))×100%。

1.5.2 流式細(xì)胞術(shù) 加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞,再避光加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL碘化丙啶,混勻,避光于室溫下溫育20 min。轉(zhuǎn)移至新的流式玻璃管中,加入1×binding buffer 400 μL,輕彈混勻。用流式細(xì)胞術(shù)(NovoCyte,Aceabio,USA)和FlowJo7.6.1軟件檢測細(xì)胞凋亡率和壞死率。

1.6 總RNA分離及實時熒光定量PCR分析

使用總RNA試劑盒II(天根生物技術(shù)有限公司,北京,中國)中提取HD11細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以β-actin為內(nèi)參基因。qRT-PCR在LightCycler@480系統(tǒng)(羅氏,瑞士)上進(jìn)行。引物序列分別見表1。熒光定量PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性15 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s,共45個循環(huán);以GAPDH的Ct值為內(nèi)參,采用相對定量分析2-ΔΔCt對得到的Ct值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 雞 qRT-PCR 的基因序列Table 1 Gene-special primers used for qRT-PCR in chicken

1.7 Western blot檢測

采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。將電泳后分離的蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上,5%脫脂奶37 ℃封閉2 h,隨后,將纖維膜在4 ℃的一抗中孵育過夜。用TTBS洗滌3次,每次15 min,接著在室溫下進(jìn)行二抗孵育時長為2 h,然后用TTBS洗滌3次,每次15 min。ECL發(fā)光壓片顯色,以GAPDH作為內(nèi)參,掃描并分析圖像,并計算相對表達(dá)量。本研究使用的抗體如下:PTEN(1∶1 000,萬類,沈陽),PI3K(1∶1 000,萬類,沈陽),AKT(1∶1 000,萬類,沈陽),BCL-2(1∶1 000,萬類,沈陽),Bax(1∶1 000,萬類,沈陽),Caspase3(1∶1 000,萬類,沈陽),Caspase9(1∶1 000,萬類,沈陽),RIPK1 (1∶1 000,Abmart,上海),RIPK3(1∶1 000,Abmart,上海),MLKL(1∶1 000,Abmart,上海),GADPH(1∶1 000,Abmart,上海),HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000,ZSGB-B)。

1.8 統(tǒng)計分析

采用SPSS(17版; SPSS,Chicago,IL,USA)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)顯著性分析。用GraphPad(版本7.0,GraphPad Software inc. ,San Diego,CA,USA)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。在每種情況下至少進(jìn)行3個獨立的試驗,并以平均值(SEM)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 DEHP暴露對HD11細(xì)胞活力的影響

為了明確DEHP對HD11的半數(shù)抑制濃度,用0、30、60、90、120、150、180、210、240 μmol·L-1DEHP處理HD11細(xì)胞24 h,隨后進(jìn)行CCK-8檢測細(xì)胞活力,如圖1所示,結(jié)果表明,隨著DEHP濃度的升高,細(xì)胞活力呈濃度依賴式下降,DEHP顯著抑制了HD11細(xì)胞的細(xì)胞活力。DEHP對HD11細(xì)胞24 h的IC50為180.644 μmol·L-1(95%置信區(qū)間:160.725～208.598 μmol·L-1)。

圖1 DEHP暴露對HD11細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of DEHP exposure on HD11 cell viability

2.2 DEHP暴露對HD11細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

為了評估DEHP暴露對HD11細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響,因此,本試驗檢測了相關(guān)的氧化應(yīng)激指標(biāo)。結(jié)果如圖2所示,與對照組相比,DEHP處理組的ROS與MDA表達(dá)水平顯著升高,并且與DEHP濃度成正比(P<0.01)。此外,與對照組相比,T-AOC表達(dá)水平顯著降低,抗氧化物酶T-SOD,GSH-PX活性顯著降低(P<0.01),結(jié)果表明,DEHP可誘導(dǎo)HD11細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激,從而導(dǎo)致HD11細(xì)胞損傷。

2.3 AO/EB染色和流式細(xì)胞術(shù)分析

為了證實DEHP暴露可誘導(dǎo)HD11細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡和程序性壞死,用AO/EB染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測了不同暴露劑量下HD11細(xì)胞的細(xì)胞凋亡和程序性壞死比例。如圖3A所示,AO/EB染色后,熒光顯微鏡可區(qū)分出4種細(xì)胞形態(tài):活細(xì)胞,核染色質(zhì)著綠色并呈正常結(jié)構(gòu);早期凋亡細(xì)胞,核染色質(zhì)著綠色呈固縮狀或圓珠狀;晚期凋亡細(xì)胞,核染色質(zhì)為橘紅色并呈固縮狀或圓珠狀;非凋亡的死亡細(xì)胞,核染色質(zhì)著橘紅色并呈正常結(jié)構(gòu)。在熒光圖像中,隨著DEHP暴露劑量的升高,L組、M組和H組的凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞比例逐漸增加。此外,Annexin VFITC-PI熒光標(biāo)記法探究細(xì)胞凋亡和壞死的具體數(shù)量。如圖3C所示,流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)顯示,壞死細(xì)胞比例5.1%增加到16.2%(第一象限),第二、三象限顯示,凋亡細(xì)胞比例5.8%增加到19.8%,AO/EB和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果共同表明,DEHP以濃度依賴性的方式增加了凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的比例。

A. AO/EB染色(比例尺,100 μm);B. Image J 熒光定量強(qiáng)度分析;C.流式細(xì)胞術(shù)分析;D.流式細(xì)胞術(shù)定量分析。與對照組(0 μmol·L-1)相比,**. P<0.01A. The AO/EB fluorescence staining (scalebar, 100 μm); B. The AO/EB fluorescence intensity quantitative analysis by ImageJ; C. The results of flowcytometry analysis; D. The quantitative results of flowcytometry. Compared with C group (0 μmol·L-1),**. P<0.01圖3 HD11細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果Fig.3 Cell apoptosis assay results for HD11 cells

2.4 DEHP暴露對HD11細(xì)胞PTEN/PI3K/AKT通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

為了探索DEHP誘導(dǎo)的HD11損傷過程是否與PTEN/PI3K/AKT通路有關(guān),本試驗檢測了DEHP暴露24 h后,HD11細(xì)胞中PTEN/PI3K/AKT信號通路相關(guān)基因的表達(dá)情況。如圖4所示,與對照組相比,DEHP暴露組PTEN的mRNA和蛋白水平顯著升高。DEHP暴露組PI3K和AKT mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)。結(jié)果表明,DEHP能增強(qiáng)HD11細(xì)胞中PTEN的表達(dá),進(jìn)而抑制PI3K和AKT的表達(dá),且這種作用隨著DEHP劑量的增加而加強(qiáng),提示DEHP能有效調(diào)控HD11細(xì)胞內(nèi)PTEN/PI3K/AKT通路的活性。

與對照組(0 μmol·L-1)相比,**. P<0.01Compared with C group (0 μmol·L-1),**. P<0.01圖4 PTEN/PI3K/AKT通路相關(guān)基因mRNA及蛋白表達(dá)變化Fig.4 Changes of mRNA and protein expression of PTEN/PI3K/AKT pathway related genes

2.5 DEHP暴露對HD11細(xì)胞線粒體凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

為了研究DEHP對HD11細(xì)胞凋亡的影響,進(jìn)一步檢測了凋亡通路相關(guān)因子Caspase 9、Caspase 3、BCL-2和Bax的mRNA和蛋白表達(dá)。如圖5所示,與對照組相比,DEHP暴露組抗凋亡基因BCL-2的mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低,而Caspase 9、Caspase 3和Bax的mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.01)。結(jié)果表明DEHP暴露誘導(dǎo)HD11細(xì)胞發(fā)生線粒體凋亡。

與對照組(0 μmol·L-1)相比,**. P<0.01Compared with C group (0 μmol·L-1),**. P<0.01圖5 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA及蛋白表達(dá)變化Fig.5 Changes of mRNA and protein expression of apoptosis related genes

2.6 DEHP暴露對HD11細(xì)胞程序性壞死相關(guān)基因表達(dá)的影響

為了驗證DEHP暴露24 h后細(xì)胞內(nèi)的壞死通路被激活,分析了程序性壞死信號通路相關(guān)基因RIPK1、RIPK3和MLKL的mRNA和蛋白表達(dá),由圖6所知,當(dāng)DEHP暴露時,與對照組相比,RIPK1、RIPK3和MLKL的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)。表明DEHP暴露誘導(dǎo)HD11細(xì)胞發(fā)生程序性細(xì)胞壞死。

與對照組(0 μmol·L-1)相比,**. P<0.01Compared with C group (0 μmol·L-1),**. P<0.01圖6 程序性壞死相關(guān)基因mRNA及蛋白表達(dá)Fig.6 Changes of mRNA and protein expression of necroptosis related genes

2.7 主成分分析和相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步探究DEHP暴露引起的HD11細(xì)胞凋亡和程序性壞死與PTEN/PI3K/AKT通路是否有關(guān),利用PCA對上述指標(biāo)進(jìn)行了分析,由圖7A所知,所有檢測基因均位于三維結(jié)構(gòu)中,PC1、PC2、PC3分別代表不同的3個組成部分,占比為94.6%、3.7%和0.8%。通過Pearson檢驗各基因之間的相關(guān)性。從結(jié)果中發(fā)現(xiàn)PTEN、PI3K、AKT通路以及凋亡和程序性壞死相關(guān)基因主要集中在PC1,且PI3K、AKT、BCL-2之間呈正相關(guān),與其他因子呈負(fù)相關(guān),相關(guān)分析結(jié)果如圖7B所示,顯示相關(guān)分析的結(jié)果與PCA基本一致。提示PTEN負(fù)調(diào)控PI3K/AKT通路進(jìn)而促進(jìn)DEHP誘導(dǎo)的HD11細(xì)胞凋亡和程序性壞死。

圖7 主成分分析(A)及相關(guān)性分析(B)Fig.7 Principal component analysis (A) and correlation analysis (B)

3 討 論

DEHP作為無處不在的存在于食品和自然環(huán)境中的污染物,可誘發(fā)免疫系統(tǒng)損傷和氧化應(yīng)激損傷[26-27]。研究人員發(fā)現(xiàn)暴露于不同劑量的DEHP,會產(chǎn)生大量ROS,最終導(dǎo)致大鼠卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)生線粒體凋亡[15]。此外,PTEN/PI3K/AKT通路與毒性作用機(jī)制密切相關(guān),參與了細(xì)胞凋亡和程序性壞死通路的激活[19]。本研究探討了DEHP是否誘導(dǎo)雞巨噬細(xì)胞凋亡和程序性壞死及其可能機(jī)制,本試驗研究了DEHP調(diào)控ROS/PTEN/PI3K/AKT通路在DEHP誘導(dǎo)雞巨噬細(xì)胞凋亡和程序性壞死中的作用,結(jié)果表明,DEHP暴露引起了HD11細(xì)胞程序性壞死和細(xì)胞凋亡,發(fā)生了氧化損傷。此外,PTEN/PI3K/AKT通路被激活,并存在劑量效應(yīng)關(guān)系。誘導(dǎo)雞巨噬細(xì)胞凋亡和程序性壞死。本研究為比較醫(yī)學(xué)研究提供理論基礎(chǔ)。

生物體內(nèi)活性氧(ROS)生成量是一個動態(tài)變化過程,與許多內(nèi)外因素有關(guān),它直接決定是否發(fā)生氧化應(yīng)激,而這也決定了細(xì)胞存活和死亡的不同調(diào)節(jié)[28]。在正常生理條件下,ROS主要被細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)清除,從而使其維持在較低的水平參與細(xì)胞信號調(diào)節(jié)。然而,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)被抑制或者抗氧化系統(tǒng)與ROS的產(chǎn)生之間失去平衡時,氧化應(yīng)激就會產(chǎn)生,當(dāng)ROS過度產(chǎn)生便會導(dǎo)致氧化損傷[29]。研究顯示,環(huán)境中的許多化學(xué)物質(zhì)均可誘導(dǎo)細(xì)胞及器官產(chǎn)生氧化應(yīng)激[30-32]。不同濃度的H2O2作用于HepG2細(xì)胞時,ROS水平顯著增加并與H2O2呈劑量效應(yīng)關(guān)系[33]。此外,維生素E和姜黃素單獨作用均能有效減弱鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)引起的脾氧化應(yīng)激損傷[34]。DEHP被證明可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞和器官產(chǎn)生氧化應(yīng)激,如斑馬魚肝細(xì)胞、人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞以及大口黑鱸幼魚的肝和脾[35-38]。與以往研究相似,本研究結(jié)果顯示,隨著DEHP暴露水平的增加,ROS和MDA水平顯著升高,T-SOD、GSH-PX活性顯著降低。此外,暴露于DEHP的HD11細(xì)胞中T-AOC水平顯著降低。結(jié)果提示,DEHP暴露后,HD11細(xì)胞內(nèi)ROS的過量生成和細(xì)胞抗氧化能力的降低,導(dǎo)致抗氧化酶系統(tǒng)的破壞,導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激。

DEHP暴露可誘導(dǎo)細(xì)胞毒性損傷,這與PTEN/PI3K/AKT信號通路的激活密切相關(guān)。例如,研究發(fā)現(xiàn)DEHP通過上調(diào)PTEN的表達(dá),進(jìn)而下調(diào)AKT的表達(dá),從而抑制人胚胎干細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞周期停滯,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[39]。DEHP暴露通過抑制PI3K/AKT信號通路,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞毒性[40]。還有研究發(fā)現(xiàn)DEHP可通過激活氧化應(yīng)激和下調(diào)PI3K/AKT信號通路誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞凋亡和程序性壞死[41]。與以往研究相似,本試驗結(jié)果顯示,DEHP暴露后,HD11細(xì)胞發(fā)生氧化損傷,DEHP處理組PTEN基因的mRNA和蛋白表達(dá)相應(yīng)升高,PI3K和AKT表達(dá)降低。值得注意的是,BCL-2和RIPK1是PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要下游靶點,通過抑制PI3K/AKT表達(dá),進(jìn)而使BCL-2低表達(dá)和RIPK1高表達(dá)來實現(xiàn)凋亡和壞死[42-43]。研究人員發(fā)現(xiàn),用50和500 mg·(kg·d)-1DEHP處理小鼠35 d,會使BCL-2蛋白低表達(dá),使Bax蛋白高表達(dá),進(jìn)而Bax與BCL-2形成異二聚體從而啟動信號通路,導(dǎo)致線粒體損傷,最終誘導(dǎo)小鼠睪丸啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)生殖細(xì)胞凋亡[44]。此外,500 μmol·L-1DEHP可以上調(diào)RIPK1、RIPK3和MLKL表達(dá)水平,最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生程序性壞死[45]。與以往研究相似,本研究發(fā)現(xiàn),不同濃度DEHP暴露于HD11細(xì)胞導(dǎo)致BCL-2的表達(dá)水平顯著降低,Bax、Caspase-3、Caspase-9表達(dá)顯著增強(qiáng),啟動了細(xì)胞線粒體凋亡途徑;同樣,RIPK1、RIPK3和MLKL的表達(dá)顯著升高,說明細(xì)胞程序性壞死通路也被激活(圖8)。

圖8 圖形摘要Fig.8 Graphical abstract

4 結(jié) 論

本研究首次提供了DEHP暴露引起HD11細(xì)胞凋亡和程序性壞死證據(jù)。發(fā)現(xiàn)DEHP可抑制HD11細(xì)胞活力,導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng),進(jìn)而激活了PTEN/PI3K/AKT信號通路,促進(jìn)了HD11細(xì)胞凋亡和程序性壞死,并且HD11細(xì)胞的損傷程度與DEHP濃度成劑量依賴性。這些發(fā)現(xiàn)為闡明DEHP對禽類中毒的分子機(jī)制提供了研究基礎(chǔ),為尋找切實有效地治療DEHP所致的HD11細(xì)胞損傷藥物提供了思路。本研究對DEHP的毒理學(xué)研究、生態(tài)環(huán)境保護(hù)及動物和人類健康具有重要意義。