孟秋赤,盧光玉,陳定雙,林亞秋,王瑞龍,鐘朝崧,王 永,劉 偉,王友利,李艷艷*,李志雄*

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,成都 610041;2.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部/四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610041)

隨著人們生活水平的提高,羊肉因其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富和低膽固醇的特點(diǎn)受到廣大消費(fèi)者的青睞,消費(fèi)者們對(duì)羊肉的需求量與日俱增[1]。簡(jiǎn)州大耳羊是由四川省簡(jiǎn)陽(yáng)市本地山羊與歐美的努比山羊雜交培育形成的我國(guó)新型肉用山羊品種,具有體格大、體型發(fā)育勻稱和早期生長(zhǎng)速度快等特點(diǎn)[2]。山羊的皮下脂肪與肌內(nèi)脂肪含量是評(píng)價(jià)肉類(lèi)鮮美程度的重要標(biāo)準(zhǔn)之一,其中肌內(nèi)脂肪的含量與肉類(lèi)口味風(fēng)味等呈正相關(guān),而報(bào)道顯示皮下脂肪組織中含有較高的脂肪酸,如果攝入過(guò)多的脂肪酸可能會(huì)增加動(dòng)脈硬化和冠心病等疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),因此如何利用分子育種來(lái)提升山羊肉質(zhì)和品質(zhì),讓消費(fèi)者吃的開(kāi)心、吃的放心成為當(dāng)前畜牧工作者的工作重點(diǎn)[3-5]。

G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)是一大類(lèi)膜蛋白受體家族的統(tǒng)稱,其成員有1 000多個(gè)[6]。據(jù)報(bào)道顯示,G蛋白偶聯(lián)受體只存在于真核生物中,G蛋白偶聯(lián)受體能結(jié)合細(xì)胞周?chē)h(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)(氣味、費(fèi)洛蒙、激素、神經(jīng)遞質(zhì)和趨化因子)并激活細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)通路,最終引起細(xì)胞狀態(tài)的改變,因此它廣泛的參與了生理與病理過(guò)程,從而一直是新藥發(fā)現(xiàn)及研究的最重要靶點(diǎn)[7-8]。GPR35是于1998年在人類(lèi)基因組DNA篩查中發(fā)現(xiàn)的孤兒受體[9](孤兒受體是指與其它已確認(rèn)的受體結(jié)構(gòu)上明顯相似,但其內(nèi)源配體還未發(fā)現(xiàn)的受體),近來(lái)有報(bào)道表明其配體可能是溶血磷脂酸(lysophosphatidic acids, LPA)、犬尿酸(kynurenic acid, KYN)和趨化因子17(chemokine ligand 17, CXCL17)[9-11]。其中CXCL17已經(jīng)被證明為GPR35的特異性配體,而CXCL17在多種不同類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞中表達(dá),尤其是在人結(jié)腸癌和乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)最為活躍[12-13]。有報(bào)道顯示,GPR35的表達(dá)與血管疾病、炎癥、免疫和腫瘤等疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[14-15]。鄭燕森等[16]利用最新基因敲除技術(shù)CRISPR/Cas9構(gòu)建GPR35全身性基因敲除小鼠,通過(guò)Western blot方法檢測(cè)了炎癥后小鼠腸組織的ERK、AKT信號(hào)通路,發(fā)現(xiàn)GPR35基因敲除型小鼠的組織磷酸化AKT信號(hào)更強(qiáng),這表明GPR35基因通過(guò)影響腸上皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)能夠促進(jìn)腸炎的發(fā)生發(fā)展。李一芷[17]利用免疫組化TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析等方法發(fā)現(xiàn),CXCL17和GPR35的表達(dá)與胃癌發(fā)生發(fā)展的多階段過(guò)程有關(guān),是潛在的胃癌監(jiān)測(cè)指標(biāo),并指出CXCL17-GPR35在功能上可能與CCL20有關(guān)。Schneditz等[18]的研究表明,GPR35可能會(huì)與鈉鉀泵結(jié)合促進(jìn)糖酵解,會(huì)增強(qiáng)致癌轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展幾率增加。

最近有研究表明,GPR35基因的表達(dá)可能與肥胖、糖尿病等身體代謝異常引發(fā)的疾病密切相關(guān),如Agudelo等[19]在小鼠上發(fā)現(xiàn)GPR35在KYN的作用下能提高脂肪組織能量利用率,作為KYN受體的GPR35能刺激脂肪組織中的脂質(zhì)代謝、產(chǎn)熱和抗炎基因表達(dá)。Shrimpton等[20]發(fā)現(xiàn),人的GPR35基因缺失會(huì)導(dǎo)致葡萄糖耐受不良和進(jìn)行性體重增加,并且對(duì)高脂飲食極為敏感,患者出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育異常,包括超重以及腹型肥胖等。上述研究表明,GPR35在動(dòng)物的脂肪合成以及代謝過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用。但其對(duì)山羊脂肪細(xì)胞分化的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以簡(jiǎn)州大耳羊?yàn)樵囼?yàn)對(duì)象,使用RT-PCR法獲得山羊GPR35基因序列,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,利用qRT-PCR檢測(cè)其在山羊不同組織和分化階段皮下脂肪細(xì)胞的表達(dá)情況,過(guò)表達(dá)或干擾GPR35探究該基因在山羊皮下脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的作用及可能的機(jī)制。本試驗(yàn)將為深入研究GPR35基因在山羊中的生物學(xué)功能提供參考,為山羊定向分子育種提供潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品采集 試驗(yàn)動(dòng)物選自四川天地羊生物工程有限責(zé)任公司的成年(1周歲)健康雄性簡(jiǎn)州大耳羊(n=4),清晨空腹時(shí)對(duì)其進(jìn)行屠宰并快速采集山羊心臟、臂三頭肌、脾臟、小腸、腎臟、背最長(zhǎng)肌、肝臟、股二頭肌、大腸、肺臟、皮下脂肪和肌間脂肪等組織,用DEPC水沖洗干凈后放入標(biāo)記好的2 mL凍存管中,迅速將其置于液氮中儲(chǔ)存。山羊皮下前體脂肪細(xì)胞在無(wú)菌條件下從7日齡的雄性簡(jiǎn)州大耳羊腹部皮下脂肪組織中分離獲得。具體分離步驟參照實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法[21]。

1.1.2 主要試劑與儀器 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(reverse transcription Kit)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;2×Taq PCR Master MixⅡ、質(zhì)粒小提試劑盒(plasmid small extraction kit)、膠回收試劑盒(glue recovery kit)、DNA Marker DL2000購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;感受態(tài)細(xì)胞、p Clone007 Versatile Simple Vector購(gòu)自擎科梓熙生物技術(shù)有限公司;氨芐青霉素鈉、卡那霉素購(gòu)自Biosharp 公司;2×SYBR Green Fast qPCR Mix購(gòu)自北京百邁客生物科技有限公司;青鏈霉素、胰蛋白酶、DEME/F12培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司;Trizol試劑、BCA試劑盒(BCA Kit)購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司;甘油三酯試劑盒(Triglyceride kit)購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司;Versa Doc 1000凝膠成像系統(tǒng)、Sub-Cell水平電泳槽購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;iQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、TC-96基因擴(kuò)增儀購(gòu)自杭州博日科技有限公司;H1650-W臺(tái)式微量高速離心機(jī)購(gòu)自湖南湘儀離心儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取與cDNA的合成 將約0.1 g的組織放入研缽,加入液氮后對(duì)其進(jìn)行充分研磨并轉(zhuǎn)入無(wú)酶的EP管中,按照Trizol法[22]提取RNA,每管加入1 mL trizol后使用渦旋儀震蕩使其充分裂解并迅速置于冰上靜置5 min,每管加入200 μL氯仿劇烈震蕩20 s,靜置2 min,在4 ℃下離心(12 000 r·min-1)15 min后將上清轉(zhuǎn)移至新的無(wú)酶EP管中,隨后加入0.5 mL異丙醇,混勻后靜置5 min,然后在4 ℃下離心(12 000 r·min-1)10 min后保留沉淀?xiàng)壢ド锨宀⒓尤? mL 75%無(wú)水乙醇洗滌沉淀,4 ℃下離心(12 000 r·min-1)5 min后棄去上清并置于工作臺(tái)干燥7 min,最后加入20 μL無(wú)酶水溶解RNA沉淀。測(cè)定RNA的濃度后并使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。將符合試驗(yàn)要求的RNA(OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0之間的RNA)取1 μg 根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(20 μL)為:RNA 1 μg,2×RT Buffer Mix 10 μL,20×Enzyme Mix 1 μL, ddH2O補(bǔ)充體系至20 μL,隨后在PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序;逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序?yàn)?2 ℃ 60 min,70 ℃ 5 min,4 ℃終止反應(yīng)。置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)和基因表達(dá)檢測(cè) 根據(jù)GenBank中牛的GPR35基因序列(登錄號(hào):XM_005 205 069.4),使用Primer premier 5軟件設(shè)計(jì)RT-PCR上下游引物以及用于檢測(cè)脂肪相關(guān)標(biāo)志基因的引物(表1),由上海生物工程股份有限公司合成。利用qRT-PCR檢測(cè)GPR35過(guò)表達(dá)和干擾效率以及脂肪相關(guān)標(biāo)志基因的表達(dá)。

1.2.3 山羊GPR35基因克隆及測(cè)序 以山羊的脾組織cDNA為模板,利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到山羊GPR35基因序列。RT-PCR反應(yīng)總體系(25 μL)為:2×Super Pfx Master Mix 酶12.5 μL,上游、下游引物各1 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR 擴(kuò)增程序:98 ℃預(yù)變性3 min;98 ℃變性1 min,57 ℃退火15 s,72 ℃延伸20 s,循環(huán)數(shù)為35次,72 ℃延伸 5 min,4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè),擴(kuò)增結(jié)果顯示出預(yù)期大小的條帶后,按照膠回收試劑盒的說(shuō)明書(shū)對(duì)克隆出的目的基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化,將純化產(chǎn)物與p Clone007 Versatile Simple Vector載體在25 ℃金屬浴中連接5 min,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,后將感受態(tài)細(xì)胞均勻接種到含有氨芐西林(AMP+)抗生素的LB固體培養(yǎng)基上,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。挑取平板上肉眼可見(jiàn)的單一菌落于干凈的離心管中,加入含有氨芐西林(AMP+)抗生素的LB液體培養(yǎng)基置于搖床恒溫培養(yǎng) 4～6 h,進(jìn)行菌液PCR和10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,將鑒定結(jié)果呈陽(yáng)性的菌液送至成都擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序并提取質(zhì)粒。

1.2.4GPR35基因序列分析 對(duì)克隆得到的山羊GPR35序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,分析的項(xiàng)目及使用的工具見(jiàn)表2。

1.2.5GPR35基因組織表達(dá)差異性分析 根據(jù)克隆得到的山羊GPR35基因完整的CDS區(qū)設(shè)計(jì)上下游引物,以TBP作為內(nèi)參基因用來(lái)矯正基因的相對(duì)表達(dá)水平[23],以前面提取的組織cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR,qRT-PCR反應(yīng)體系:10 μmol·L-1上、下游引物各 0.5 μL,SYBR Premix Ex TaqTM(2×)5 μL,cDNA 0.5 μL,ddH2O 3.5 μL。qRT-PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性(95 ℃ 3 min) ;變性(95 ℃ 10 s),退火(60 ℃ 10 s),延伸(72 ℃ 15 s),共 38 個(gè)循環(huán)。

1.2.6 山羊皮下脂肪細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及誘導(dǎo)分化 將實(shí)驗(yàn)室前期保存的皮下前體脂肪細(xì)胞復(fù)蘇后在 CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)(90% DMEM/F-12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基,10%胎牛血清,1%青霉素-鏈霉素),當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到 80%時(shí)進(jìn)行傳代。至F3代時(shí)將山羊皮下前體脂肪細(xì)胞以8×104個(gè)·孔-1接種在6孔板中,24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染,每孔轉(zhuǎn)染體系為:2 μg質(zhì)粒,6 μL轉(zhuǎn)染試劑,400 μL的無(wú)血清培養(yǎng)基,混勻后在室溫孵育15 min后加入6孔板中。轉(zhuǎn)染12 h更換50 μmol·L-1油酸誘導(dǎo)液,培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。

1.2.7GPR35基因在山羊皮下脂肪細(xì)胞不同分化階段的表達(dá)差異分析 細(xì)胞接種到12孔板,當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到 80%時(shí)用油酸(50 μmol·L-1)誘導(dǎo)液誘導(dǎo)分化,分別收集0、24、48、72、96和120 h 的細(xì)胞并提取RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用qRT-PCR 檢測(cè)GPR35基因在不同分化階段皮下脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平,內(nèi)參基因?yàn)閁XT[24],qRT-PCR 體系建立及運(yùn)行程序與組織定量相同。

1.2.8 過(guò)表達(dá)載體pEGFP-N1-GPR35的構(gòu)建和干擾序列合成 根據(jù)克隆的GPR35基因CDS區(qū)序列和pEGFP-N1載體的多克隆位點(diǎn),選擇EcoR Ⅰ和KpnⅠ為上下游酶切位點(diǎn)并設(shè)計(jì)出亞克隆引物(表2),以上述測(cè)序成功的菌液提取的質(zhì)粒為模板進(jìn)行亞克隆,PCR體系與程序同上。將亞克隆產(chǎn)物與pEGFP-N1 載體分別進(jìn)行雙酶切并回收純化,使用T4連接酶將目的基因片段與載體16 ℃過(guò)夜連接后轉(zhuǎn)化,挑取陽(yáng)性菌落并以菌液為模板進(jìn)行PCR鑒定后測(cè)序,對(duì)鑒定結(jié)果正確的菌液提取質(zhì)粒。si-GPR35序列(5′→3′)為Sense:AAGGGAGUCU-UGCUCACCUTT和Anti-Sense:AGGUGAGCA-AGACUCCCUUTT,由吉瑪基因公司合成。

1.2.9 Bodipy染色、油紅O染色及半定量分析 用于染色的細(xì)胞以8×103個(gè)·孔-1接種在48孔板中,轉(zhuǎn)染體系為:0.25 μg質(zhì)粒,1 μL轉(zhuǎn)染試劑,50 μL的無(wú)血清培養(yǎng)基,其余處理同“1.2.6”。誘導(dǎo)分化48 h后用PBS洗滌細(xì)胞2～3次,用4%甲醛固定15 min后用PBS洗滌2～3次。然后在室溫下用油紅O或Bodipy工作液染色30 min。用PBS洗滌后,用光學(xué)顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察和拍照。對(duì)Bodipy染色的熒光面積使用ImageJ軟件進(jìn)行量化。對(duì)油紅O結(jié)果進(jìn)行半定量分析,向每個(gè)孔中加入1 mL 100%異丙醇以提取染料,取200 μL提取液加入96孔板中,在490 nm處測(cè)定其吸光度。

1.2.10 甘油三酯含量測(cè)定 用于甘油三酯含量測(cè)定的細(xì)胞處理同“1.2.8”所述,收集細(xì)胞后按照甘油三酯含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。細(xì)胞裂解后取10 μL上清與190 μL工作液在96孔板中混勻,隨后在550 nm處測(cè)定其吸光度。余下的裂解液用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度,以每毫克蛋白濃度校正樣本甘油三酯的含量。

1.2.11 統(tǒng)計(jì)及分析 qRT-PCR數(shù)據(jù)采用 2-ΔΔCt進(jìn)行分析[25]。顯著性檢驗(yàn)通過(guò)SPSS 17 軟件中One-way ANOVA 分析的 Games-Howell 檢驗(yàn),利用GraphPad Prism 9.0 繪制山羊GPR35基因的組織表達(dá)譜。參照One-way ANOVA法分析結(jié)果,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性標(biāo)記,*表示差異顯著 (P<0.05) ;**表示差異極顯著(P<0.01);所有樣本均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)樣本重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié) 果

2.1 GPR35基因克隆與序列分析

以山羊的脾組織cDNA為模板,用RT-PCR法體外擴(kuò)增山羊GPR35基因序列。結(jié)果顯示克隆得到山羊GPR35基因序列1 167 bp(圖1A),包括CDS區(qū)906 bp,其終止密碼子為T(mén)AG,編碼301個(gè)氨基酸殘基(圖1B)。通過(guò)DNAMAN軟件將測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行對(duì)比后發(fā)現(xiàn),共有6個(gè)堿基發(fā)生突變,分別為第80位G>C,第222位A>G,第225位G>C,第234位A>G,第244位C>T,第459位G>A(圖1C),其對(duì)應(yīng)的氨基酸共有5個(gè)發(fā)生了突變,分別為第74位R>G,第75位E>Q,第78位K>E,第81位F>L,第153位G>S,將測(cè)序序列上傳到GenBank,獲得基因登錄號(hào)為ON930035。

A. 山羊GPR35基因克隆結(jié)果(M.DL2000 DNA Marker; 1.GPR35 基因);B. 山羊GPR35核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列(三角形(▲)為絲氨酸磷酸化位點(diǎn),五角星(★)為蘇氨酸磷酸化位點(diǎn),菱形(◆)為酪氨酸磷酸化位點(diǎn),ATG為起始密碼子,TAG為終止密碼子);C. 山羊GPR35突變位點(diǎn)(GPR35克隆序列與NCBI中 GPR35基因標(biāo)準(zhǔn)序列(XM_018040014.1)對(duì)比,↓標(biāo)記處的堿基為突變位點(diǎn))A. Cloning results of goat GPR35 gene (M.DL2000 DNA Marker; 1.GPR35 gene); B. The nucleotide sequence and encoded amino acid sequence of goat GPR35 (triangle (▲) is serine phosphorylation sites, pentagram (★) is threonine phosphorylation sites, diamond (◆) is tyrosine phosphorylation sites, ATG is the start codon, TAG is the stop codon); C. Goat GPR35 mutation sites (GPR35 clone sequence is compared with the GPR35 gene standard sequence in NCBI (XM_018040014.1), the base at the ↓ mark is the mutation site)圖1 GPR35基因克隆、ORF及ORF編碼的氨基酸序列、差異性對(duì)比結(jié)果Fig.1 GPR35 gene cloning, ORF and ORF encoded amino acid sequence, difference comparison results

2.2 GPR35蛋白親疏水性、磷酸化位點(diǎn)、信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

通過(guò)ProtScale在線工具對(duì)GPR35蛋白進(jìn)行親疏水性驗(yàn)證,結(jié)果如圖2A所示,GPR35蛋白中的第200位氨基酸為最低分值(-2.300),故其親水性最強(qiáng),第223位氨基酸為最高分值(為3.344),故其疏水性最強(qiáng)。經(jīng)分析可知該蛋白為疏水性蛋白。

A. 山羊GPR35蛋白親疏水性預(yù)測(cè);B. 山羊GPR35蛋白磷酸位點(diǎn)預(yù)測(cè);C. 山羊GPR35信號(hào)肽序列預(yù)測(cè);D. 山羊GPR35蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(紫色矩形為跨膜螺旋結(jié)構(gòu),藍(lán)色線段是位于膜內(nèi)結(jié)構(gòu),黃色線段是位于膜外結(jié)構(gòu))A. Prediction of hydrophilicity and hydrophobicity of goat GPR35 protein; B. Phosphoric acid site prediction of goat GPR35 protein; C. Prediction of GPR35 signal peptide sequence of goat; D. Prediction of the transmembrane structure of goat GPR35 protein(the violet rectangles are the transmembrane helix structure, the blue line segments are the structure inside the membrane, and the yellow line segments are the structure outside the membrane)圖2 GPR35親疏水性、磷酸化位點(diǎn)、信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of GPR35 hydrophilicity and hydrophobicity, phosphorylation site, signal peptide and transmembrane structure

通過(guò)在線軟件Netphos對(duì)GPR35蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè),結(jié)果如圖1B和2B所示,山羊的GPR35氨基酸序列共有30個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn),其中絲氨酸有17個(gè)位點(diǎn),蘇氨酸有12個(gè)位點(diǎn),酪氨酸有1個(gè)位點(diǎn)。

利用在線工具signaIP 4.1進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè),結(jié)果顯示GPR35蛋白S平均值為0.211,低于0.5,表示山羊 GPR35蛋白沒(méi)有信號(hào)肽,屬于非分泌蛋白(圖2C)。通過(guò)TMHMM 2.0在線工具對(duì)山羊GPR35蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析,結(jié)果顯示該蛋白存在6個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)(圖2D)。

2.3 GPR35蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、氨基酸組成及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析

利用SWISS-MODEL對(duì)GPR35氨基酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),結(jié)果顯示其可能會(huì)形成α-螺旋結(jié)構(gòu)的氨基酸有148個(gè)(49.17%),可能會(huì)形成無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的氨基酸有86個(gè)(28.57%),可能會(huì)形成延伸鏈結(jié)構(gòu)的氨基酸有65個(gè)(21.59%),可能會(huì)形成β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的氨基酸有2個(gè)(0.66%)(圖3A)。山羊GPR35蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果如圖3B所示。

通過(guò)在線工具ExPASy對(duì)山羊的氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析,結(jié)果表明GPR35由301個(gè)氨基酸組成,各種氨基酸占比如圖3C所示,其攜帶負(fù)電荷的天冬氨酸和谷氨酸殘基15個(gè),而攜帶正電荷的精氨酸和賴氨酸殘基有27個(gè),故山羊GPR35蛋白攜帶正電。

使用Psort Ⅱ在線工具對(duì)GPR35氨基酸序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè),結(jié)果顯示其主要分布在細(xì)胞膜占52.2%,其次是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)占21.7%、液泡占13.0%、細(xì)胞核占4.3%、高爾基體占4.3%、線粒體占4.3%(圖3D)。

2.4 氨基酸序列相似性對(duì)比及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

通過(guò)NCBI查詢不同物種GPR35基因編碼的氨基酸序列并進(jìn)行氨基酸相似性對(duì)比,結(jié)果發(fā)現(xiàn)簡(jiǎn)州大耳羊的氨基酸序列與綿羊(登錄號(hào):XP_027822798.1)、白長(zhǎng)角羚(登錄號(hào):XP_040087940.1)、馬鹿(登錄號(hào):XP_043734443.1)、牛(登錄號(hào):XP_002686637.1)、水牛(XP_019813588.1)、鼠海豚(登陸號(hào):XP_032492598.1)、人(登錄號(hào):AAI17454.2)的氨基酸序列相似性分別達(dá)到98.34%、95.68%、86.36%、86.75%、87.40%、77.91%、68.68%(圖4A)。表明山羊GPR35與綿羊、白長(zhǎng)角羚同源性最高,該蛋白在這兩個(gè)物種間有較高保守性。

使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),結(jié)果如圖4B所示,山羊GPR35與綿羊的親緣關(guān)系最為接近,而牛、長(zhǎng)白角羚與羊類(lèi)都為反芻動(dòng)物,故處于進(jìn)化樹(shù)同一分支上,與人的親緣關(guān)系最遠(yuǎn),說(shuō)明GPR35在反芻動(dòng)物中具有較高的保守性,符合物種的進(jìn)化規(guī)律。

2.5 組織表達(dá)結(jié)果分析

為探究GPR35基因在不同組織中的表達(dá)水平,利用qRT-PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)該基因在山羊內(nèi)臟組織(心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、瘤胃、大腸、小腸),肌肉組織(背最長(zhǎng)肌、股二頭肌、臂三頭肌、咬肌)以及脂肪組織(內(nèi)臟脂肪、皮下脂肪、肌間脂肪、腸系膜脂肪、心包膜脂肪)的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,在山羊各組織中均檢測(cè)到GPR35基因的表達(dá),其在背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)顯著高于山羊的其它肌肉組織(P<0.01,圖5A);在皮下脂肪中的表達(dá)顯著高于山羊的其它脂肪組織(P<0.01,圖5B);在脾臟中的表達(dá)顯著高于山羊的其它內(nèi)臟組織(P<0.01,圖5C)。

2.6 時(shí)序表達(dá)結(jié)果分析

因山羊GPR35基因在皮下脂肪組織中表達(dá)量較高,故采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)其在山羊皮下脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)。結(jié)果如圖6所示,與誘導(dǎo)分化前相比(0 h),山羊GPR35基因的相對(duì)表達(dá)量均呈上調(diào)趨勢(shì),其中48、72、120 h極顯著上調(diào)(P<0.01),推測(cè)GPR35可能參與調(diào)控山羊皮下前體脂肪細(xì)胞分化。

圖6 GPR35基因時(shí)序表達(dá)圖譜Fig.6 Time series expression results of goat GPR35 gene

2.7 過(guò)表達(dá)GPR35抑制山羊皮下前體脂肪細(xì)胞分化

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)(OE)組GPR35基因的表達(dá)量上調(diào)約為對(duì)照(NC)組的104倍(圖7A)。油紅O染色和Bodipy染色結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)GPR35后OE組的皮下脂肪細(xì)胞脂滴含量和聚集程度明顯下降(圖7B,圖7C),油紅O染色量化結(jié)果顯示OE組的490 nm吸光值顯著極降低(圖7D),Bodipy染色量化結(jié)果顯示OE組的相對(duì)熒光面積極顯著降低(圖7E),甘油三酯含量檢測(cè)結(jié)果顯示OE組的甘油三酯相對(duì)含量極顯著降低(圖7F)。過(guò)表達(dá)GPR35后標(biāo)志基因檢測(cè)結(jié)果顯示,甘油三酯合成標(biāo)志基因AP2、SREBP1表達(dá)極顯著下調(diào)(圖7G),甘油三酯分解代謝標(biāo)志基因HSL表達(dá)極顯著上調(diào)(圖7H),脂肪分化標(biāo)志基因C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ表達(dá)極顯著下調(diào)(圖7I)。綜上所述,過(guò)表達(dá)GPR35抑制山羊皮下前體脂肪細(xì)胞分化。

A.GPR35過(guò)表達(dá)效率檢測(cè);B. 油紅O染色結(jié)果(100×);C. Bodipy染色結(jié)果(100×);D. 油紅量化OD值;E. Bodipy相對(duì)熒光面積;F. 甘油三酯相對(duì)含量;G.甘油三酯合成標(biāo)志基因的表達(dá);H.甘油三酯分解代謝標(biāo)志基因的表達(dá);I.脂肪分化標(biāo)志基因的表達(dá)A. GPR35 overexpression efficiency detection; B. Oil Red O staining results (100×); C. Bodipy staining (100×); D. OD value quantified by Oil Red; E. Relative fluorescence area of Bodipy; F. Relative triglyceride content; G. The expression of marker genes for triglyceride synthesis; H. The expression of marker genes for triglyceride catabolism; I. The expression of marker genes for adipose differentiation圖7 過(guò)表達(dá)GPR35對(duì)皮下脂肪細(xì)胞分化的影響Fig.7 The influence of overexpression of GPR35 on subcutaneous adipocytes differentiation

2.8 干擾GPR35促進(jìn)山羊皮下前體脂肪細(xì)胞分化

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染Si-GPR35組的細(xì)胞干擾效率約為47%(圖8A)。油紅O染色和Bodipy染色結(jié)果顯示干擾GPR35后Si-GPR35組的皮下脂肪細(xì)胞脂滴含量和聚集程度明顯升高(圖8B,圖8C),油紅O染色量化結(jié)果顯示Si-GPR35組的490 nm吸光值顯著升高(圖8D),Bodipy染色量化結(jié)果顯示Si-GPR35組的相對(duì)熒光面積極顯著升高(圖8E),甘油三酯含量檢測(cè)結(jié)果顯示Si-GPR35組的甘油三酯相對(duì)含量極顯著升高(圖8F)。干擾GPR35后,甘油三酯合成標(biāo)志基因AP2、SREBP1、DGAT1表達(dá)極顯著上調(diào),FASN表達(dá)極顯著下調(diào)(圖8G),脂肪分化標(biāo)志基因C/EBPα、C/EBPβ表達(dá)極顯著上調(diào)(圖8I)。綜上所述,干擾GPR35促進(jìn)山羊皮下前體脂肪細(xì)胞分化。

A.GPR35干擾效率檢測(cè);B. 油紅O染色結(jié)果(100×);C. Bodipy染色結(jié)果(100×);D. 油紅量化OD值;E. Bodipy相對(duì)熒光面積;F. 甘油三酯相對(duì)含量;G.甘油三酯合成標(biāo)志基因表達(dá);H.甘油三酯分解代謝標(biāo)志基因表達(dá);I.脂肪分化標(biāo)志基因表達(dá)A. GPR35 overexpression efficiency detection; B. Oil Red O staining results (100×); C. Bodipy staining results(100×); D. OD value quantified by Oil Red; E. Relative fluorescence area of Bodipy; F. Relative triglyceride content; G. The expression of marker genes for triglyceride synthesis; H. The expression of marker genes for triglyceride catabolism; I. The expression of marker genes for adipose differentiation圖8 干擾GPR35對(duì)皮下脂肪分化的影響Fig.8 The influence of interfering GPR35 on subcutaneous adipocytes differentiation

2.9 蛋白互作預(yù)測(cè)

為了探究GPR35調(diào)控山羊皮下脂肪細(xì)胞分化的分子機(jī)制,利用STRING在線網(wǎng)站進(jìn)行蛋白作用分析,結(jié)果顯示山羊GPR35蛋白可能與CXCL17、KYAT1、KYNU、KMO、ARRB2、BCNT、CAPN10、RNPEPL1、WDR64、ST6GAL2等蛋白間存在相互作用(圖9)。

圖9 蛋白互作預(yù)測(cè)Fig.9 Protein interaction prediction

3 討 論

據(jù)報(bào)道,人GPR35基因定位于染色體2q37.3上,分為GPR35a和GPR35b兩個(gè)轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體,其中GPR35a亞型cDNA全長(zhǎng)930 bp,編碼309個(gè)氨基酸[26-27]。本研究以簡(jiǎn)州大耳羊脾組織為模板,以親緣物種牛GPR35基因的mRNA序列為參照設(shè)計(jì)引物,并成功克隆簡(jiǎn)州大耳羊GPR35基因序列,其中CDS區(qū)長(zhǎng)906 bp,共編碼301個(gè)氨基酸殘基,說(shuō)明該基因在人與山羊間存在一定的差異性。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)表明山羊GPR35蛋白存在多個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn),而蛋白質(zhì)磷酸化在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中有著重要作用,這與G蛋白偶聯(lián)受體激活并介導(dǎo)下游信號(hào)通路密切相關(guān)[28-29]。同時(shí)亞細(xì)胞定位和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明該蛋白可能是一個(gè)位于細(xì)胞膜上且功能活躍的跨膜蛋白,該結(jié)果與G蛋白偶聯(lián)受體家族被報(bào)道為一大類(lèi)膜受體統(tǒng)稱一致[30]。

Shore和Reggio[31]研究表明,GPR35基因在人的腎上腺、胃腸道、肺、肝、子宮、膀胱、腎臟等組織中均有表達(dá)。為了探究GPR35基因在山羊各組織中的表達(dá)規(guī)律,利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)山羊內(nèi)臟組織、肌肉組織、脂肪組織進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果表明,該基因在所檢測(cè)的17種組織中均有表達(dá),因此該基因具有廣譜表達(dá)的特征,該結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。該基因在脾臟組織的相對(duì)表達(dá)量最高,而在大腸、小腸以及瘤胃中較低,這與Okumura等[32]的研究表明的GPR35高表達(dá)于人的腸胃和肺中存在差異,推測(cè)是該基因在不同物種中具有表達(dá)差異性。

前人的相關(guān)研究表明,GPR35對(duì)脂肪有一定的調(diào)控作用,如在GPR35被敲除的小鼠肝細(xì)胞中基礎(chǔ)脂質(zhì)水平升高,GPR35抑制肝細(xì)胞中的脂質(zhì)積聚[33],同時(shí)有研究表明敲除小鼠的GPR35基因會(huì)減少小鼠運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的脂肪組織褐變[19]。脂肪主要分為白色脂肪和褐色脂肪,脂肪組織褐變即讓白色脂肪變?yōu)楹稚?而褐色脂肪負(fù)責(zé)產(chǎn)熱和耗能,能夠有效降低葡萄糖和脂質(zhì)水平[34]。在山羊中肌內(nèi)脂肪的含量與肉質(zhì)風(fēng)味呈正相關(guān),脂肪沉積的順序?yàn)閮?nèi)臟脂肪、皮下脂肪,最后是肌間和肌內(nèi)脂肪[34-36]。因此綜合前人的研究,猜想該基因在山羊上可能具有同樣的效果,即GPR35基因可能對(duì)山羊皮下脂肪細(xì)胞分化存在調(diào)控作用。構(gòu)建的山羊皮下脂肪時(shí)序表達(dá)譜的結(jié)果表明,與誘導(dǎo)分化前相比(0 h),誘導(dǎo)分化后山羊GPR35基因的相對(duì)表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì),因此推測(cè)其對(duì)山羊皮下脂肪細(xì)胞分化有一定的調(diào)控作用。

為探究GPR35在山羊皮下脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮的具體作用,本試驗(yàn)過(guò)表達(dá)山羊GPR35后發(fā)現(xiàn)皮下脂肪細(xì)胞脂滴含量和聚集程度明顯下降。而干擾GPR35后皮下脂肪細(xì)胞脂滴含量和聚集程度明顯提升,該結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致,即GPR35的表達(dá)會(huì)抑制脂質(zhì)的積累和生成[19,33]。C/EBPα和C/EBPβ為CCAAT-增強(qiáng)子結(jié)合蛋白家族的一員[37],該家族和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)家族在脂肪分化過(guò)程中具有促進(jìn)作用,其中C/EBPα與PPARγ在脂肪分化過(guò)程中協(xié)同作用通過(guò)上調(diào)LPL、FABP4、PLIN1的表達(dá)來(lái)促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化,而C/EBPβ參與PPARγ的誘導(dǎo)表達(dá)[38-40],即C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ的表達(dá)與脂肪細(xì)胞的分化呈正相關(guān)。SREBP1是類(lèi)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白家族的一員,該家族與膽固醇、脂肪酸、三酰甘油和磷脂合成息息相關(guān),在脂肪細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SREBP1會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的甘油三酯水平升高,降低胰島素的作用,該基因的表達(dá)與脂肪生成呈正相關(guān)[41]。AP2被稱為脂肪酸結(jié)合蛋白4(FABP4),在小鼠和兔中敲除FABP4會(huì)減少高脂環(huán)境誘導(dǎo)的肥胖模型相關(guān)代謝功能對(duì)其的影響并增加其對(duì)胰島素的敏感性[42-43]。本研究在過(guò)表達(dá)和干擾GPR35后,C/EBPα、C/EBPβ、AP2、SREBP1的表達(dá)量分別顯著下調(diào)和上調(diào),該結(jié)果表明GPR35對(duì)山羊皮下脂肪細(xì)胞分化存在抑制作用,該作用可能是通過(guò)調(diào)控C/EBPα、C/EBPβ、AP2、SREBP1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的,但其具體的調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步試驗(yàn)來(lái)探究。

為進(jìn)一步探索GPR35抑制山羊皮下前體脂肪細(xì)胞分化的作用機(jī)制,利用STRING在線網(wǎng)站進(jìn)行蛋白互作預(yù)測(cè)分析,結(jié)果顯示GPR35蛋白可能與CXCL17 、KYNU、KYAT1等蛋白存在相互作用。值得關(guān)注的是作為GPR35配體的CXCL17在蛋白互作預(yù)測(cè)顯示它們存在相互作用,因此推測(cè)山羊GPR35可能與CXCL17通過(guò)蛋白互作調(diào)節(jié)山羊脂肪細(xì)胞分化。而山羊CXCL17是否會(huì)對(duì)脂肪細(xì)胞分化有影響以及CXCL17和GPR35是否會(huì)共同調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化還未知,這也是本課題組下一步研究的方向。

4 結(jié) 論

總而言之,本研究試驗(yàn)結(jié)果表明過(guò)表達(dá)山羊GPR35基因抑制山羊皮下脂肪細(xì)胞的分化,干擾山羊GPR35基因促進(jìn)山羊皮下脂肪細(xì)胞的分化,GPR35是山羊皮下脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的一個(gè)負(fù)向調(diào)控因子,這種作用可能是通過(guò)調(diào)控C/EBPα、C/EBPβ、AP2、SREBP1的表達(dá)或與CXCL17蛋白相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本試驗(yàn)結(jié)果將為深入研究山羊脂肪細(xì)胞脂質(zhì)沉積和分子育種提供基礎(chǔ),為完善山羊GPR35的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與機(jī)制提供新的理論依據(jù)。