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兔泰澤病原體實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的建立

2024-01-10 13:36許中衎邢壯壯王學(xué)文劉銘赫李林姣范學(xué)政馬麗穎
關(guān)鍵詞:病原體質(zhì)粒特異性

董 浩 李 楠 許中衎 邢壯壯 王學(xué)文 劉銘赫 李林姣 范學(xué)政 馬麗穎

(1.中國(guó)食品藥品檢定研究院,北京 102629)(2. 中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081)

泰澤病(Tyzzer’s disease)是由泰澤病原體(毛樣芽孢桿菌,Clostridiumpiliforme)感染引起的一種潛伏期長(zhǎng)、發(fā)病迅速、致死率高的傳染病。1917年Tyzzer在日本舞蹈小鼠 (Japanese waltzing mice)身上首次發(fā)現(xiàn)了該病。該病原的宿主廣泛,目前已發(fā)現(xiàn)兔、大鼠、倉(cāng)鼠、麝鼠、貓、犬、郊狼、馬及羅猴等多種動(dòng)物可以被感染[1-3]。在我國(guó),已有多篇關(guān)于兔、大鼠和小鼠感染泰澤病原體的報(bào)道[4-7]。值得注意的是,有文獻(xiàn)報(bào)道泰澤病原體具有感染人的可能性,從產(chǎn)前婦女和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)人員的血清樣本中均檢測(cè)到了泰澤病原體的陽(yáng)性抗體[4,8]。

對(duì)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)兔來(lái)說(shuō),泰澤病原體也是其必須排除的病原之一。由于泰澤病原體不能在無(wú)細(xì)胞的體外培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),使得難以獲得該病原的純培養(yǎng)物,因此只能使用感染泰澤病原體動(dòng)物組織樣品制備血清學(xué)實(shí)驗(yàn)所需的抗原或抗體,這無(wú)疑會(huì)對(duì)血清學(xué)檢測(cè)方法的特異性造成一定的影響。同時(shí),血清學(xué)檢測(cè)方法對(duì)窗口期或者隱性感染的動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)時(shí),常會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。除此之外,有研究者認(rèn)為泰澤病原體與梭菌屬的細(xì)菌之間存在一定的交叉反應(yīng),因此建議ELISA、IFA這類檢測(cè)病原抗體的方法最好只用于泰澤病原體感染初步篩查,其確診還需要采用血清學(xué)以外的檢測(cè)方法進(jìn)一步檢測(cè)、驗(yàn)證[9]。

由于泰澤病原體主要以隱性感染的形式存在于易感動(dòng)物體內(nèi),這無(wú)疑是對(duì)盡早發(fā)現(xiàn)和剔除感染動(dòng)物帶來(lái)了一定的困難??紤]到糞口途徑是泰澤病原體在動(dòng)物之間自然傳播的主要方式,本研究擬以兔的糞球作為檢測(cè)樣本,建立一種實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法,應(yīng)用于兔泰澤病原體的快速檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 樣品和菌種來(lái)源

布魯菌病S2疫苗株的基因組和35株魏氏梭菌臨床分離株均由國(guó)家動(dòng)物布魯菌病參考實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。多殺巴氏桿菌(CVCC 1676)、鼠傷寒沙門(mén)菌(CVCC 2220)、金黃色葡萄球菌(CVCC 4098)、綠膿桿菌(CVCC 2000)和肺炎克雷伯菌(CVCC 4079)均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌株保藏管理中心。70份家兔的糞球樣品采自某普通級(jí)兔飼養(yǎng)機(jī)構(gòu)。

1.2 主要試劑與儀器

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(西安天隆科技有限公司);GoTag Probe qPCR Master Mix(Promega公司);質(zhì)粒提取試劑盒(Omega公司);TE緩沖液(北京索萊寶科技有限公司);GeneRotex全自動(dòng)旋轉(zhuǎn)式核酸提取儀(西安天隆科技有限公司);NanoDrop2000【賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司】;Roche LightCycler480 II 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(羅氏公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1前期文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的驗(yàn)證根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]報(bào)道的泰澤病原體nested-PCR檢測(cè)方法,合成相應(yīng)的引物序列(TZ-1、TZ-2、TZ-3和TZ-4)并進(jìn)行了10份普通級(jí)實(shí)驗(yàn)兔的糞球樣品的檢測(cè)。將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,并使用Blast數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。

1.3.2引物探針的設(shè)計(jì)與合成:根據(jù)1.3.1的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果,針對(duì)泰澤病原體特異性的196 bp 16S rRNA序列,采用Primer-BLAST在線軟件設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物(TZ-F和TZ-R)和1條TaqMan 探針(TZ-Probe),用于泰澤病原體的檢測(cè)。引物和探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物和探針序列詳見(jiàn)表1。

表1 引物和探針列表Table 1 List of primers and probes

1.3.3質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備:根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]中提供的泰澤病原體特異性的196 bp 16S rRNA序列,由武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司合成了含有上述序列的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(pUC-TZ196)。將含有pUC-TZ196陽(yáng)性質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞,培養(yǎng)至穩(wěn)定期后,使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pUC-TZ196。利用Nanodrop2000測(cè)定質(zhì)粒的濃度,并按照公式拷貝數(shù)=(6.02×1023×濃度)/(堿基數(shù)×660)×10-9,換算質(zhì)粒拷貝數(shù)。使用TE緩沖液對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

1.3.4實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化:用矩陣法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增,篩選引物和探針的搭配濃度,以獲得最佳的擴(kuò)增效果。

1.3.5實(shí)時(shí)熒光PCR特異性實(shí)驗(yàn):分別以SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)兔必須排除的多殺巴氏桿菌、鼠傷寒沙門(mén)菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯菌等滅活細(xì)菌核酸以及布魯菌病S2疫苗株的基因組為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè),并設(shè)置1個(gè)pUC-TZ196質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品陽(yáng)性對(duì)照和1個(gè)空白對(duì)照(水)。

由于泰澤病原體的196 bp 16S rRNA序列在Blast數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)顯示該序列與部分梭菌屬的細(xì)菌同源性較高,因此使用建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)35株魏氏梭菌臨床分離株進(jìn)行了檢測(cè),并設(shè)置1個(gè)pUC-TZ196質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品陽(yáng)性對(duì)照和1個(gè)空白對(duì)照(水)。

1.3.6實(shí)時(shí)熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:將合成的pUC-TZ196質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,使用TE緩沖液進(jìn)行10倍梯度稀釋,模板濃度為3.2×107,3.2×106,3.2×105,3.2×104和3.2×103copies/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè),用Roche LightCycler480 II 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀配套軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7實(shí)時(shí)熒光PCR敏感性實(shí)驗(yàn):將合成的pUC-TZ196質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品使用TE緩沖液進(jìn)行梯度稀釋,模板為濃度3.2×106、3.2×105、3.2×104、3.2×103、3.2×102、3.2×101和3.2×100copies/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。在確定可以獲得S型標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低模板濃度后,再使用TE緩沖液以2的倍數(shù)進(jìn)行梯度稀釋,每個(gè)稀釋度做6個(gè)重復(fù),進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè),以6個(gè)重復(fù)樣品均可以獲得S型特異性擴(kuò)增曲線的最低質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為實(shí)時(shí)熒光PCR方法的最低檢測(cè)限。

1.3.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn):分別采用濃度為3.2×106和3.2×104copies/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn),每個(gè)濃度的模板分別進(jìn)行了批內(nèi)重復(fù)3次和批間重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),以評(píng)估建立方法的重復(fù)性。

1.3.9臨床樣品檢測(cè):采用建立的實(shí)時(shí)熒光PCR法,對(duì)70份普通級(jí)實(shí)驗(yàn)兔的糞球樣品進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí),已報(bào)道的泰澤病原體nested-PCR檢測(cè)方法對(duì)上述樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 前期文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的驗(yàn)證

采用已報(bào)道的泰澤病原體nested-PCR檢測(cè)方法對(duì)10份普通級(jí)實(shí)驗(yàn)兔的糞球樣品的檢測(cè)。結(jié)果顯示,10份糞球樣品的nested-PCR產(chǎn)物中4份擴(kuò)增出196 bp的目的片段。切取2份比較清晰的目的條帶膠塊,送到生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)Blast數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)顯示與毛樣芽孢桿菌(Clostridiumpiliforme)的同源性最高,由于只使用正向引物進(jìn)行測(cè)序,所以最高的一致性為95.71%(圖1)。上述結(jié)果說(shuō)明,擴(kuò)增獲得196 bp產(chǎn)物為泰澤病原體的核酸。

圖1 套式PCR產(chǎn)物測(cè)序的Blast比對(duì)結(jié)果Fig.1 Blast results of sequencing of nested-PCR product

2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

通過(guò)體系優(yōu)化,實(shí)時(shí)熒光PCR的最佳反應(yīng)體系為20 μL:GoTaq? Probe qPCR Master Mix 10 μL,10 μmol/L 的上、下游引物各 0.9 μL,10 μmol/L 的探針0.6 μL,DNA 模板 2 μL,加入無(wú)核酸酶的水補(bǔ)齊 20 μL。反應(yīng)程序確定為:95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s,52 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,45個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)第2步,72 ℃ 20 s,收集FAM熒光信號(hào)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

提取pUC-TZ196質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,換算拷貝數(shù)后進(jìn)行10倍倍比稀釋后作為模板,采用優(yōu)化好反應(yīng)條件的實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在使用3.2×107~3.2×103copies/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板時(shí),泰澤病原體實(shí)時(shí)熒光PCR的擴(kuò)增效率Efficiency為1.908,斜率Slope為-3.565(圖2)。

注:1~5: 3.2×107,3.2×106,3.2×105,3.2×104 和3.2×103 copies/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線。Note:1-5:the amplification curves of 3.2×107,3.2×106,3.2×105,3.2×104 and 3.2×103 copies/μL plasmid standard.

2.4 特異性實(shí)驗(yàn)

分別以SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)兔必須排除的多殺巴氏桿菌、鼠傷寒沙門(mén)菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯菌等滅活細(xì)菌核酸以及布魯菌病S2疫苗株和35株魏氏梭菌臨床分離株的基因組為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè),同時(shí)以ddH2O為陰性對(duì)照,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,只有pUC-TZ196質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品陽(yáng)性對(duì)照可以產(chǎn)生S型擴(kuò)增曲線,其他細(xì)菌均未出現(xiàn)明顯擴(kuò)增(圖3)。這說(shuō)明該方法的特異性良好。

圖3 實(shí)時(shí)熒光PCR的特異性實(shí)驗(yàn)Fig.3 Specificity test for the real-time PCR

2.5 敏感性實(shí)驗(yàn)

為了測(cè)試實(shí)時(shí)熒光PCR的最低檢測(cè)限,將pUC-TZ196質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品陽(yáng)性對(duì)照分別進(jìn)行10倍倍比稀釋后作為模板,采用優(yōu)化好的實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,3.2×101copies/μL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增可以獲得S型擴(kuò)增曲線,而3.2×100copies/μL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品無(wú)S型擴(kuò)增曲線產(chǎn)生。進(jìn)一步將3.2×101copies/μL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品使用TE緩沖液進(jìn)行2倍倍比稀釋,每個(gè)濃度做6次重復(fù)使用,結(jié)果表明當(dāng)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至8 copies/μL時(shí),6個(gè)重復(fù)樣品均可以獲得S型擴(kuò)增曲線,當(dāng)稀釋至4 copies/μL時(shí),僅1個(gè)重復(fù)樣品可以獲得S型擴(kuò)增曲線,說(shuō)明建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法的最低檢測(cè)限為8 copies/μL。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

為了測(cè)試實(shí)時(shí)熒光PCR的重復(fù)性,分別采用濃度為3.2×106,3.2×104copies/μL的兩種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表2所示,批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均小于3%。這說(shuō)明建立的實(shí)時(shí)熒光PCR具有良好的重復(fù)性。

表2 實(shí)時(shí)熒光PCR的批內(nèi)和批間重復(fù)實(shí)驗(yàn)Table 2 In-batch and inter-batch replications of real-time PCR

2.7 臨床樣品檢測(cè)

利用建立的實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)采自某家兔飼養(yǎng)機(jī)構(gòu)的70份糞球樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,70份家兔糞球樣品,實(shí)時(shí)熒光檢出59陽(yáng)性,套式PCR檢測(cè)出55份陽(yáng)性,實(shí)時(shí)熒光PCR比套式PCR多檢出了4份陽(yáng)性樣品,兩種方法的符合率為94.29%。

3 討論

由于無(wú)法進(jìn)行泰澤病原體的體外純培養(yǎng),所以在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中依然沒(méi)有該病原的基因組全序列,這無(wú)疑是給泰澤病原體的分子生物學(xué)檢測(cè)方法的建立帶來(lái)了困難。2003年,我國(guó)的研究者們?cè)?jīng)報(bào)道了泰澤病原體的基因組DNA提取方法,但是未見(jiàn)后續(xù)基因組學(xué)方面的研究數(shù)據(jù)[11]。目前,在泰澤病原體的分子檢測(cè)方法中,主要是以其16S rRNA中的特異性196 bp序列作為檢測(cè)靶標(biāo)[12-13]。

通過(guò)對(duì)該196 bp序列的blast比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)其與某些梭菌屬的細(xì)菌以及金黃色葡萄球菌具有較高的同源性,因此本研究中使用了35株魏氏梭菌臨床分離株和金黃色葡萄球菌對(duì)建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行了特異性的檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法特異性良好,不與上述菌株發(fā)生交叉反應(yīng)。

與參考文獻(xiàn)[10]建立的套式PCR相比,本研究中建立實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法極大的簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作的流程,不僅減少了一次加樣過(guò)程,還省去了電泳的操作流程,使得檢測(cè)環(huán)節(jié)從約4 h縮短至僅1 h,節(jié)省了大量的人力和時(shí)間。與參考文獻(xiàn)[12]建立的反向斑點(diǎn)雜交方法相比,實(shí)時(shí)熒光PCR方法在操作簡(jiǎn)便性和檢測(cè)的高通量性方面也是具有較大的優(yōu)勢(shì),更利于在各種檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行推廣。

從本研究中檢測(cè)的70份臨床樣品的陽(yáng)性比例來(lái)看,在該兔的飼養(yǎng)群中,泰澤病原體感染比較嚴(yán)重。根據(jù)與該兔飼養(yǎng)機(jī)構(gòu)的飼養(yǎng)人員溝通,該兔群近期未發(fā)生腹瀉和突然死亡病例,這也說(shuō)明在兔中泰澤病原體也是可以長(zhǎng)期隱性感染而不發(fā)病的。

綜上所述,本研究建立了一種可以用于兔泰澤病原體檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光PCR方法,其有比較理想的敏感性、特異性和重復(fù)性,對(duì)于臨床樣品檢測(cè)效果也明顯優(yōu)于已報(bào)道的套式PCR方法。因此,該方法可用于兔的泰澤病原體的核酸檢測(cè),對(duì)提升我國(guó)兔泰澤病原體檢測(cè)能力具有較大意義。

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