朱力鳴 焦 昆 劉 偉 李勝利

(1.首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部,北京 100069)(2. 北京化工大學(xué),北京 100029)

臨床上,因外傷、先天畸形、牙周疾病、開顱手術(shù)等各種原因?qū)е碌墓侨睋p十分常見,尤其在骨科、口腔科、神經(jīng)外科等領(lǐng)域的患者較為集中,上述諸原因造成的大范圍骨缺損是臨床上的一大難題。據(jù)統(tǒng)計,我國每年約400萬人需要進(jìn)行植骨治療[1]。

常見的骨缺損修復(fù)方法有自體骨移植、異體骨移植及人工材料等[2]。根據(jù)骨移植材料在體內(nèi)的骨形成特性,理想的植骨移植材料應(yīng)具有骨生成性、骨誘導(dǎo)性、骨引導(dǎo)性[3]。單純的人工骨材料僅能作為骨引導(dǎo)的支架,缺乏誘導(dǎo)成骨能力,成骨速度慢,效果欠佳,需加入有骨誘導(dǎo)性或骨生成性的移植材料。組織工程學(xué)意在將生物材料、細(xì)胞以及生物活性分子結(jié)合起來,恢復(fù)或改善受損或病變組織的生物功能[4]。傳統(tǒng)的骨組織工程是通過將種子細(xì)胞接種在支架材料上植入骨缺損處進(jìn)行修復(fù),但存在種子細(xì)胞凋亡、引發(fā)免疫炎性反應(yīng)等缺陷,這將削弱修復(fù)效果[5]。人工骨替代材料也具有各自的優(yōu)勢和缺點(diǎn),磷酸鈣陶瓷與骨有著相似的化學(xué)組成,但其溶解性影響破骨細(xì)胞的活性[6],高分子聚合物具有生物活性但機(jī)械強(qiáng)度低[7]。異體骨移植存在發(fā)生免疫反應(yīng)、成骨活性差、可能傳播疾病等問題。同種異體骨則可能有效避免異體移植材料的危害,繼而成為當(dāng)前骨移植材料的重要研究方向。本研究通過動物模型,研究同種異體骨修補(bǔ)骨缺損效果,利用X線觀察實(shí)驗(yàn)動物術(shù)后骨的生長愈合情況,借助組織病理學(xué)觀察評估該移植材料修補(bǔ)骨缺損的有效性,通過與對照組、空白對照組進(jìn)行比較,為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),以期豐富骨缺損修復(fù)的移植材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物:成年普通級新西蘭兔,60只,體質(zhì)量2.2 kg以上,雄性,購自北京富豪實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖中心,實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號【SCXK(京)2019-0015】,飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部,實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號【SYXK(京)2018-0003】,實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量控制及飼養(yǎng)環(huán)境均符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定[8-9]。60只動物隨機(jī)分成3組,分別為實(shí)驗(yàn)組、對照組和空白對照組,每組均20只。對于所有實(shí)驗(yàn)組,分別在手術(shù)后的第1、4、8和12周時取5只動物,稱體質(zhì)量、抽血檢測血常規(guī)指標(biāo)及生理生化指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會審查批準(zhǔn),倫理審批號為:AEEI-2022-083。

1.1.2試劑與儀器:同種異體骨(批號:TZG-S1-211124。型號規(guī)格:松質(zhì)骨小塊,DG-SZGXK,0.5 g;皮質(zhì)骨粒,DG-PZGL-3,0.5 g),由北京桀亞萊福生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供,干燥避光密閉保存,供試品在每次使用前用適量無菌0.9%氯化鈉溶液調(diào)和,并在2～3 h內(nèi)使用完畢。對照品:市售同種骨植入材料。主要儀器:BC-5150全自動血液細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司),日立7000型全自動生化分析儀(日立高科技貿(mào)易上海有限公司),Strong 204精密微型研磨機(jī)(世新精密中國分社)。

1.2 方法

1.2.1動物模型制備方法:將兔稱重,全麻(麻醉劑:舒泰+速眠新,使用劑量分別為:舒泰0.03 mL/(kg·bw),速眠新0.1 mL/(kg·bw),保定,取側(cè)臥位,備皮(半徑約3 cm),碘酊消毒,鋪無菌巾。避開皮下血管,切開皮膚、皮下組織及筋膜,切口為2.0 cm,分離肌群,暴露股骨外側(cè)面。在股骨近心端之外緣、大轉(zhuǎn)子下緣1 cm處,用直徑4 mm球頭精密研磨機(jī)制備骨缺損,深度以不打穿髓腔、目視隱約可見紅色骨髓為度(防止骨髓腔開放后暴露的髓內(nèi)干細(xì)胞自愈合能力的干擾),此時,骨缺損深度約為1 mm,骨缺損體積約為5.24 mm3。制造骨缺損時予以0.9%沖洗降溫。同樣的方法處理對側(cè)股骨。在實(shí)驗(yàn)組和對照組每只兔的左股骨缺損區(qū)填充皮質(zhì)骨粒,右股骨缺損區(qū)填充松質(zhì)骨小塊,輕壓填緊,盡量使材料與孔密合,分層縫合?？瞻捉M動物進(jìn)行上述同樣手術(shù),不填充任何材料。術(shù)后對動物肌注青霉素鈉溶液3 d,劑量為每天80萬單位/只,肌注對乙酰氨基酚注射液3 d,劑量為2.5 mg/(kg·bw)。

1.2.2影像學(xué)檢查:在術(shù)后1、4、8和12周時進(jìn)行X線檢測骨缺損區(qū)。對各組缺損愈合情況進(jìn)行評估和影像學(xué)評價。

1.2.3病理檢查:包括尸體大體檢驗(yàn)和器官組織切片的顯微觀察檢驗(yàn)。

1.2.3.1 尸體檢查:由病理專業(yè)人員對研究期間死亡或者被處死的所有動物的尸體進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.2.3.2 組織病理學(xué)檢查:對每組的5只動物行安樂死,切取骨缺損區(qū)組織作為標(biāo)本,10%甲醛常溫固定,標(biāo)本常規(guī)脫鈣、脫水、包埋后行HE染色,分析材料植入后降解、缺損部位的骨形成情況,成骨細(xì)胞、炎性細(xì)胞浸潤情況等。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用IBM SPSS Statistics 22軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計。統(tǒng)計方法為方差分析或雙樣本獨(dú)立t檢驗(yàn),確定各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異的比較是否有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 影像學(xué)觀察結(jié)果

術(shù)后1周X線檢查結(jié)果顯示,空白對照組骨缺損明顯。實(shí)驗(yàn)組與對照組影像學(xué)結(jié)果高度相似,左右側(cè)骨缺損明顯,因分別在骨缺損處植入皮質(zhì)骨粒和松質(zhì)骨,故缺損處仍顯示較大密度,與空白對照組顯著不同(圖1)。

注:L:左側(cè);R:右側(cè)。Note: L:left; R:right.

術(shù)后4周,空白對照組,骨缺損較1周時變淺,但仍清晰可見。實(shí)驗(yàn)組骨修復(fù)情況與空白對照組差別不太明顯,缺損區(qū)可見低密度骨痂,缺損斷端仍較為明顯。對照組骨修復(fù)情況亦類似于實(shí)驗(yàn)組,左右側(cè)差別同樣不明顯(圖2)。

注:L:左側(cè);R:右側(cè)Note: L:left; R:right.

術(shù)后8周時,實(shí)驗(yàn)組動物骨修復(fù)較4周時有顯著變化,骨痂影密度較高,和正常骨質(zhì)差別不太大,個別可見斷端。在缺損區(qū)周圍尚可見散落填充物顆粒。左右側(cè)骨恢復(fù)情況區(qū)別不明顯。對照組可見缺損,缺損區(qū)內(nèi)可見與正常皮質(zhì)骨密度不同影像,缺損區(qū)周圍仍可見散落之填充物顆粒。上述兩組動物骨修復(fù)速度優(yōu)于空白對照組動物(圖3)。

注:L:左側(cè);R:右側(cè)。Note: L:left; R:right.

至術(shù)后12周,實(shí)驗(yàn)組動物骨損愈合較佳,骨密質(zhì)修復(fù)完整,圖像顯示骨損區(qū)顯影密度與周圍皮質(zhì)骨相同。實(shí)驗(yàn)組動物樣本左右側(cè)骨愈合情況差別不明顯。對照組右側(cè)骨愈合情況優(yōu)于左側(cè)骨,與實(shí)驗(yàn)組恢復(fù)速度相似?？瞻讓φ战M動物骨損修復(fù)情況差于前面兩組動物,個別樣本股骨尚能看到輕度缺損(圖4)。

注:L:左側(cè);R:右側(cè)Note: L:left; R:right.

2.2 組織病理學(xué)結(jié)果

術(shù)后1周,解剖取材時肉眼可見,供試品植入物和對照品植入物與原有骨組織尚未有效結(jié)合,在取材過程中均可輕易脫離創(chuàng)面,在周圍肌肉組織內(nèi),部分動物樣本可見少量散落填充物。3組動物的組織學(xué)觀察結(jié)果相似,創(chuàng)面殘留菲薄骨質(zhì),表面有殘留造模時所致壞死組織及炎性滲出,炎癥不明顯(圖5)。

圖5 術(shù)后1周實(shí)驗(yàn)組、對照組及空白對照組骨組織切片(HE,×100)Fig.5 Bone section of experimental group, control group and blank control group 1 week after operation(HE,×100)

術(shù)后4周,剖檢時在實(shí)驗(yàn)組和對照組可見植入物與骨組織結(jié)合較為緊密,手術(shù)區(qū)無炎性癥狀。組織學(xué)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組骨缺損區(qū)尚無成型之新生骨組織,可見不連續(xù)骨小梁,小梁周邊有大量成骨細(xì)胞,同時可見脂肪細(xì)胞、新生血管及纖維結(jié)締組織。對照組情況相似?？瞻讓φ战M與前面兩組相比,成骨細(xì)胞數(shù)量、小梁量均偏少。3組動物骨損區(qū)內(nèi)均未見明顯組織壞死和炎性細(xì)胞浸潤(圖6)。

圖6 術(shù)后4周實(shí)驗(yàn)組、對照組及空白對照組骨組織切片(HE,×100)Fig.6 Bone section of experimental group, control group and blank control group 4 week after operation(HE,×100)

至術(shù)后8周,實(shí)驗(yàn)組動物樣本中,供試品吸收較好。顯微鏡下觀察骨小梁更加粗大、密集,但排列尚不規(guī)則,新生骨表面成骨細(xì)胞密集排列,成骨性肉芽組織浸潤,周邊有較為豐富的毛細(xì)血管。對照組與此相似?？瞻讓φ战M與實(shí)驗(yàn)組相比,骨小梁略纖細(xì),成骨性肉芽組織偏少(圖7)。

圖7 術(shù)后8周實(shí)驗(yàn)組、對照組及空白對照組骨組織切片(HE,×100)Fig.7 Bone section of experimental group, control group and blank control group 8 week after operation(HE,×100)

術(shù)后12周,各組動物新生骨大量形成。相較于空白對照組,實(shí)驗(yàn)組動物樣本的新生骨組織內(nèi)出現(xiàn)類似骨髓組織。骨小梁的連續(xù)性更好,排列更加規(guī)則,表面形成致密骨板(圖8)。

圖8 術(shù)后12周實(shí)驗(yàn)組、對照組及空白對照組骨組織切片(HE,×100)Fig.8 Bone section of experimental group, control group and blank control group 12 week after operation(HE,×100)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以成年雄性兔為實(shí)驗(yàn)材料,制作骨缺損疾病模型,填充皮質(zhì)骨?；蛩少|(zhì)骨小塊以探究骨修復(fù)效果。結(jié)果表明:動物使用供試品,較使用同類市售產(chǎn)品和不使用填充材料者,生長狀態(tài)良好,骨組織修復(fù)速度快,愈合效果好。

骨的愈合一般需經(jīng)歷纖維性骨痂、骨性骨痂及骨痂改建等過程[10]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,供試品用于實(shí)驗(yàn)動物兔后,經(jīng)過12周的生長恢復(fù),骨損區(qū)結(jié)構(gòu)基本符合正常骨組織的組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn),皮質(zhì)致密,排列規(guī)律[11]。病理學(xué)觀察結(jié)果表明,供試品能夠刺激間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞,促進(jìn)成骨細(xì)胞產(chǎn)生骨膠纖維和有機(jī)骨基質(zhì),加速鈣鹽的沉積,推進(jìn)骨細(xì)胞的形成及骨痂成熟,具備理想的植骨材料應(yīng)兼具骨生成性、骨誘導(dǎo)性及骨引導(dǎo)性之特征,是較為有效的骨移植材料。本研究為增加臨床上骨缺損修復(fù)過程中的移植材料奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),對植骨材料庫的豐富及擴(kuò)容提供了研究支撐,但該受試材料的生物力學(xué)特性及其他生物學(xué)性能,尚需進(jìn)一步研究探討。