辛 充 徐京平 常 勁 王 凡 王 劍 楊 曉 李振華

(1.遼寧大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,沈陽 110031) (2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所,北京 102206) (3.中國人民解放軍總醫(yī)院,北京 100039)

以冠心病、心力衰竭(心衰)等為代表的心臟疾病是威脅人類健康的頭號殺手,在全球范圍內(nèi)造成了巨大的健康和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),成為日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題并持續(xù)成為領(lǐng)域內(nèi)研究熱點[1]。探索心臟疾病的致病機(jī)制,發(fā)現(xiàn)影響心臟穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵基因,將為心臟疾病治療帶來新的希望。

蛋白質(zhì)O-連接的β-N-乙?；咸前沸揎?O-GlcNAcylation)是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式,在心臟穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮了至關(guān)重要的功能。細(xì)胞內(nèi)的兩種關(guān)鍵酶O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶(O-GlcNAc transferase,OGT)和O-GlcNAc糖苷酶(O-GlcNAcase,OGA) 參與了這一修飾過程[2]。在主動脈引起的心肌肥厚和左冠狀動脈結(jié)扎引起的心肌梗死大鼠模型中,O-GlcNAcylation水平都有顯著升高,提示O-GlcNAcylation異常升高可能在心臟疾病發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵功能[3]。研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞特異性敲除蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5(Prmt5)會影響Oga的轉(zhuǎn)錄及剪切,使Oga基因表達(dá)下降和O-GlcNAcylation水平異常升高,最終導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病,而通過腺相關(guān)病毒AAV9恢復(fù)心肌細(xì)胞內(nèi)Oga基因的表達(dá)可以緩解Prmt5敲除小鼠的擴(kuò)張型心肌病表型[4]。然而,目前尚缺乏利用建立成體心肌細(xì)胞特異性O(shè)ga敲除小鼠,來研究OGA對心臟功能影響的報道。

CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種古老的細(xì)菌適應(yīng)性免疫系統(tǒng),是細(xì)菌抵御外來病原入侵的的防御體系,基于其識別并切割特定核酸序列的特性,現(xiàn)已被改造并廣泛應(yīng)用于各物種的基因組編輯[5]?；贑RISPR/Cas9的基因編輯技術(shù)與傳統(tǒng)基因打靶技術(shù)相比,具有成本低、操作簡單、耗時少等特點,可用于快速構(gòu)建基因敲除模式生物[6]。然而,生殖細(xì)胞的基因編輯會帶來前所未有的倫理挑戰(zhàn),因此,利用腺相關(guān)病毒AAV作為CRISPR/Cas9系統(tǒng)的遞送載體,在特定時間、特定體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行編輯的體細(xì)胞基因編輯系統(tǒng)對于構(gòu)建人類疾病小鼠模型及疾病治療具有重要的意義。例如利用AAV9病毒將靶向Myh6基因的sgRNA遞送到心肌細(xì)胞特異性Cas9轉(zhuǎn)基因小鼠心臟內(nèi),建立了成體心肌細(xì)胞特異性基因敲除小鼠模型。[7]因此,AAV介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)可作為我們研制心肌細(xì)胞特異性O(shè)ga敲除小鼠,研究內(nèi)源性O(shè)GA功能的一種有效手段。

本研究旨在利用AAV9介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)在成體小鼠心肌細(xì)胞中特異性敲除Oga基因,快速建立Oga敲除小鼠模型。該模型的建立為研究OGA及其調(diào)節(jié)的O-GlcNAcylation在心臟穩(wěn)態(tài)維持中的功能提供了理想的動物模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:本實驗所使用的α-MHC-Cre轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠由本實驗構(gòu)建,Rosa26-Cas9基因敲入小鼠購于Jackson實驗室(貨號024857),所有小鼠均飼養(yǎng)于SPF級屏障環(huán)境,體質(zhì)量30～32 g,所有實驗操作通過生命組學(xué)研究所動物實驗委員會批準(zhǔn),實驗動物使用許可證號【SYXK(軍)2020-0002】。

1.1.2實驗試劑:2×PCR Mix(+Dye)(北京普利萊基因技術(shù)有限公司);DNA Maker、核酸染料(北京博邁德基因技術(shù)有限公司);2×SYBR Green MasterMix(TaKaRa公司);Trizol(Sigma公司);異丙醇、三氯甲烷(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);蛋白酶和磷酸酶抑制劑(Roche公司);RIPA蛋白裂解液、十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)電泳上樣緩沖液、WB一抗稀釋液、1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8、1mol/L Tris-HCl pH 6.8(北京普利萊基因技術(shù)有限公司);蛋白分子量標(biāo)志物PageRulerTMPrestained Protein Ladder、PierceTM BCA 蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher);小鼠抗GAPDH單抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);OGA多克隆抗體(Proteintech);聚偏氟乙烯PVDF膜(Millipore公司)。引物合成以及測序結(jié)果均來自南京擎科生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1設(shè)計靶向Oga基因組編碼序列的sgRNA:小鼠Oga基因在小鼠19號染色體上,共有18個外顯子,基因ID為76055。利用gRNA設(shè)計軟件(https://zlab.bio/guide-design-resources),按照sgRNA設(shè)計原則,選擇On-Target和Off-target評分分值較高的6條sgRNA,序列見表1。利用基因敲除效率熒光檢測系統(tǒng),針對目的sgRNA構(gòu)建Cas9及sgRNA共表達(dá)質(zhì)粒和帶有對應(yīng)sgRNA靶序列的報告質(zhì)粒,將其共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,48 h后觀察熒光進(jìn)行sgRNA有效序列篩選。

表1 靶向Oga基因組編碼序列的sgRNA序列Table 1 sgRNA sequences targeting the coding sequence of Oga

對于效率最高的兩個sgRNA(sgOga2和sgOga6)的篩選細(xì)胞,通過提取基因組、sgRNA靶序列所在區(qū)域PCR擴(kuò)增(引物序列見表2),測序,進(jìn)一步證實敲除效果。

表2 sgRNA靶序列所在區(qū)域PCR擴(kuò)增引物序列Table 2 PCR amplification primer of sgRNA target sequence

1.2.2構(gòu)建腺相關(guān)病毒載體:將sgOga2和sgOga6序列克隆到帶有mCherry熒光報告基因的腺相關(guān)病毒sgRNA表達(dá)載體上,構(gòu)建攜帶外源基因的重組質(zhì)粒。然后將重組質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒Ad-Helper Vector和pAAV-rep/capVector共轉(zhuǎn)染HEK293 T細(xì)胞,72 h后細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生大量的重組病毒。裂解細(xì)胞得到病毒并用碘克沙醇法純化病毒,純化完成后置于超濾管進(jìn)行濃縮。得到AAV9-sgOga2-sgOga6-mCherry。最后實時定量PCR法對病毒進(jìn)行滴度測定。

1.2.3心肌細(xì)胞特異性spCas9表達(dá)小鼠的獲得:通過將α-MHC-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠和Rosa26-Cas9敲入小鼠交配獲得F1代雜合子小鼠(α-MHC-Cre,Rosa26-Cas9+/-小鼠),由F1代α-MHC-Cre,Rosa26-Cas9+/-小鼠與Rosa26-Cas9敲入小鼠交配獲得F2代純合子α-MHC-Cre;Rosa26-Cas9+/+小鼠,即心肌細(xì)胞特異性的SpCas9表達(dá)小鼠(α-MHCCas9)。鑒定引物序列信息見表3,PCR條件為:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,32個循環(huán);72 ℃ 5 min。

表3 小鼠基因型鑒定引物序列Table 3 Primer sequences of mice genotype identification

1.2.4基因編輯小鼠的構(gòu)建和鑒定:將AAV9-sgOga2-sgOga6-mCherry以及對照空載病毒以2×1012vg(viral genomes)劑量腹腔注射入1月齡α-MHCCas9小鼠,得到對照小鼠AAV9-Control和敲除小鼠AAV9-sgOga各6只。在小鼠7月齡時,將對照小鼠AAV9-Control和敲除小鼠AAV9-sgOga麻醉,心臟灌流,取出心臟,以及肝、腦、肺、胃組織備用。

1.2.5qPCR檢測:Trizol提取心臟組織的總RNA,測量濃度后取2 μg進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,以Gapdh作為內(nèi)參,在各個組織中分別對Oga表達(dá)情況進(jìn)行qPCR檢測并統(tǒng)計分析。并對心臟組織的cDNA進(jìn)行肥大標(biāo)志基因和纖維化標(biāo)志基因的檢測。反應(yīng)條件如下:50 ℃ 20 s,95 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 45 s,40個循環(huán)。其中擴(kuò)增用引物序列見表4。

表4 qPCR引物序列Table 4 qPCR primer sequences

1.2.6Western blot印記雜交檢測:取各部分組織,加適量的添加了蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液。用組織勻漿機(jī)將組織充分研磨后,超聲打碎DNA,冰上靜置20 min,13 000 r/min 4 ℃離心20 min,取上清。用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度,加入蛋白上樣緩沖液混合,100 ℃煮沸5 min后,-30 ℃ 保存。取30 μg蛋白樣本進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉溶液封閉1 h,加入1∶1 000稀釋的一抗,4 ℃孵育過夜,PBST洗滌3次,每次5 min,加入1∶1 000稀釋的二抗,室溫孵育1 h,PBST洗滌8 min,共洗3次。在膜上滴適量ECL發(fā)光液覆蓋稍作反應(yīng),使用化學(xué)發(fā)光儀拍照。

1.2.7組織學(xué)染色:將取出的心臟組織置于4 %的多聚甲醛固定液中4 ℃固定12 h,脫水,石蠟包埋,切片厚度為5 μm,放置在載玻片上備用。將石蠟切片于二甲苯中脫蠟,梯度乙醇復(fù)水,用于HE和Masson染色。

1.2.8超聲心動圖分析:使用異氟烷麻醉小鼠,將胸前區(qū)毛發(fā)剃去后,將小鼠置于溫度恒定的操作臺上,利用超聲影像系統(tǒng)對小鼠心臟各腔室室壁厚度及收縮、射血等指數(shù)進(jìn)行測量與分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 靶向Oga基因組編碼序列的sgRNA的篩選

CRISPR/Cas9激活的sgRNA效率熒光檢測系統(tǒng)原理如圖1A所示,檢測系統(tǒng)包括一個報告質(zhì)粒和一個表達(dá)質(zhì)粒,如果候選sgRNA有效,則可以與另一個已經(jīng)確定有效的sgRNA共同作用,分別在其對應(yīng)報告質(zhì)粒靶序列上進(jìn)行切割,敲除我們?nèi)藶樘砑拥耐怙@子,使N端和C端EGFP外顯子正確切割從而表達(dá),細(xì)胞會產(chǎn)生綠色熒光,EGFP陽性的細(xì)胞越多表示gRNA敲除效率越高,反之亦然。

注:A.CRISPR/Cas9激活的候選sgRNA效率熒光檢測系統(tǒng)原理圖,SD:剪切供體,SA:剪切受體;B.構(gòu)建6條候選sgRNAs表達(dá)及報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)細(xì)胞的熒光檢測圖(×20);C.Sanger測序驗證sgOga2和sgOga6對Oga靶序列的有效切割。Note:A. Schematic showing the CRISPR/Cas9-activated fluorescent reporter system to detect the efficiency of a candidate sgRNA, SD: splicing donor, SE: splicing acceptor; B. Fluorescent microscopy images of cells co-transfected with six candidate sgRNAs and their corresponding reporter plasmids(×20); C. Sanger sequencing confirmed the effective cleavage of targeting sites by the sgOga2 and sgOga6.

如圖1B所示,候選的6條sgRNA中,只有sgOga2和sgOga6表達(dá)的細(xì)胞有綠色熒光產(chǎn)生,sgOga6的敲除效率最高,sgOga2的敲除效率次之。為了進(jìn)一步驗證基因組的改變,我們在sgOga2、sgOga6基因組靶序列上下游各約400 bp處設(shè)計PCR引物,以基因組為模板擴(kuò)增出目的DNA,并進(jìn)行了測序。Cas9切割引起DNA斷裂位置發(fā)生非同源末端連接修復(fù),這種修復(fù)方式是完全隨機(jī)的,會大概率的引起插入缺失突變,導(dǎo)致其切割位置的堿基序列不同,從而在測序時出現(xiàn)套峰現(xiàn)象。如圖1C所示,在sgOga2、sgOga6的識別切割位置的下游出現(xiàn)了套峰,說明sgOga2、sgOga6敲除效果很好。

2.2 基于CRISPR/Cas9 AAV9系統(tǒng)的成體Oga敲除小鼠的構(gòu)建

α-MHCCas9小鼠特定基因組位點結(jié)構(gòu)圖及調(diào)控表達(dá)模式如圖2A所示,心肌細(xì)胞內(nèi)Cre重組酶特異性表達(dá),介導(dǎo)Rosa26位點的stop序列敲除并啟始spCas9核酸酶表達(dá),小鼠基因型鑒定如圖2B所示。AAV9-sgOga病毒表達(dá)載體結(jié)構(gòu)模式圖如圖2C所示,sgOga2和sgOga6分別由兩個獨立的U6啟動子啟始表達(dá),表達(dá)載體同時帶有CMV啟動子啟始的mCherry報告基因。

注:A.Cre重組酶介導(dǎo)的Rosa26-Cas9位點重組及相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控表達(dá)模式圖;B.小鼠基因型鑒定結(jié)果;C.AAV9-sgOga病毒表達(dá)載體結(jié)構(gòu)模式圖;D.AAV9遞送實驗?zāi)Ｊ綀D;E.Cre重組酶介導(dǎo)的EGFP和AAV9介導(dǎo)的mCherry表達(dá)的檢測。Control:未注射病毒的野生型小鼠;AAV9:注射病毒的α-MHCCas9小鼠。Note:A. Schematic representation of Rosa26-Cas9 allele before and after Cre-mediated recombination; B.Genotypic analysis of mice indicated;C. Schematic representation of the AAV9-sgOga vector; D. Experimental design of AAV9 delivery; E.Detection of Cre-mediated EGFP and AAV9-mediated mCherry expression. Control: Wild type mice without virus injection; AAV9: α-MHCCas9 mice with virus injection.

如圖2D所示,將AAV9通過腹腔注射的方式遞送到α-MHCCas9小鼠體內(nèi),圖2E展示的Western blot 印記雜交結(jié)果表明,Cre介導(dǎo)的Cas9表達(dá)元件和AAV9介導(dǎo)的sgRNA表達(dá)元件在心臟組織都得到有效的表達(dá),表明成功獲得了同時在心肌細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)Cas9核酸酶和靶向Oga編碼序列sgRNA的小鼠。

2.3 敲除小鼠心臟組織中Oga敲除效率和O-GlcNAcylation表達(dá)水平的驗證

對建立的成體心肌細(xì)胞特異性O(shè)ga敲除小鼠進(jìn)行了基因表達(dá)的驗證,如圖3A所示,Western blot印記雜交結(jié)果顯示注射了AAV9-sgOga的α-MHCCas9小鼠(AAV9-sgOga小鼠)心臟組織的OGA蛋白表達(dá)水平較注射AAV9-Control的α-MHCCas9小鼠(AAV9-Control小鼠)顯著下降,OGA調(diào)控的蛋白O-GlcNAcylation修飾水平也顯著的升高。圖3A的統(tǒng)計結(jié)果及圖3B的qPCR結(jié)果表明,構(gòu)建的6只Oga敲除小鼠心臟OGA蛋白及mRNA表達(dá)均顯著下降,成模率100%。同時,在大腦、肺、腎等其他組織中沒有檢測到OGA表達(dá)水平的顯著差異(圖3C)。以上結(jié)果表明,本實驗成功建立了成體心肌細(xì)胞特異性O(shè)ga敲除小鼠,實現(xiàn)了對心臟O-GlcNAcylation蛋白修飾水平的調(diào)控。

注:A.蛋白質(zhì)印跡檢測心臟組織OGA和O-GlcNAcylation蛋白水平的表達(dá);B.qPCR檢測心臟組織Oga mRNA水平的表達(dá);C.肺、大腦、腎組織中OGA蛋白表達(dá)水平檢測;與AAV9-Control組比較,*P<0.05,** P<0.01。Note:A.Western blot analysis of the protein levels of OGA and O-GlcNAcylation in the heart;B. qPCR analysis of the mRNA level of Ogain the heart; C.Detection of OGA expression in lung, brain and kidney;Compared with AAV9-control,*P<0.05, **P<0.01.

2.4 成體心肌細(xì)胞特異性O(shè)ga敲除小鼠的表型分析

對成體心肌細(xì)胞特異性O(shè)ga敲除小鼠進(jìn)行表型分析,發(fā)現(xiàn)7月齡AAV9-sgOga小鼠心臟外觀與AAV9-Control小鼠相比無顯著異常(圖4A),兩者心臟重量與體質(zhì)量比值(HW/BW)和心臟重量與脛骨長度比值(HW/TL)均無顯著差異(圖4B,C)。圖4D所示的HE染色和圖4E所示的Masson染色結(jié)果表明,AAV9-sgOga小鼠沒有發(fā)生擴(kuò)張、肥大和纖維化等心臟病理性改變。qPCR實驗結(jié)果顯示兩組小鼠心臟組織的肥大標(biāo)志基因和纖維化標(biāo)志基因也沒有明顯變化(圖4F,G)。

利用M型超聲心動圖對心臟收縮功能進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),AAV9-sgOga小鼠左室收縮末期前壁厚度(LVAW;s,圖5A)、左室收縮末期后壁厚度(LVPW;s,圖5B)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVID;s,圖5C)、左室收縮末期容積(LVVol;s,圖5D)、左室射血分?jǐn)?shù)(EF,圖5E)和收縮指數(shù)(FS,圖5F)較AAV9-Control小鼠均無顯著差異,表明AAV9-sgOga小鼠在7月齡時心臟收縮功能無明顯異常。以上結(jié)果表明成體心肌細(xì)胞特異性O(shè)ga敲除小鼠心臟在生理狀態(tài)下沒有出現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)病變和收縮功能異常。

注:A.左室收縮末期前壁厚度;B.左室收縮末期后壁厚度;C.左室收縮末期內(nèi)徑;D.左室收縮末期容積;E.左室射血分?jǐn)?shù);F.左室收縮指數(shù)。Note:A. Left ventricular anterior wall thickness at end systole; B.Left ventricular posterior wall thickness at end systole; C.Left ventricular diameter at end systole; D.Left ventricular volume at end systole; E.Left ventricular ejection fraction; F. Left ventricular fractional shortening.

3 討論

近十年來,基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)被開發(fā)并廣泛應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的改變,通過基因組編輯不僅可以敲除特定基因從而研究它們在組織細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中的功能,而且可以精確糾正發(fā)生基因突變的DNA序列從而恢復(fù)蛋白的正常表達(dá)?；蚓庉嫾夹g(shù)雖然強(qiáng)大,但是也存在極大的倫理挑戰(zhàn)和安全隱患,體細(xì)胞基因編輯將基因組編輯限制在特定的體細(xì)胞內(nèi),避免了生殖細(xì)胞基因組編輯帶來的倫理問題,也大大降低了其他組織細(xì)胞基因編輯的風(fēng)險。2018年美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)啟動了體細(xì)胞基因組編輯計劃,旨在開發(fā)高質(zhì)量、安全有效的體細(xì)胞基因組編輯工具,為治療人類遺傳疾病開發(fā)新技術(shù)和新策略。體細(xì)胞基因組編輯技術(shù)也可以被應(yīng)用于小鼠模型的構(gòu)建中,與傳統(tǒng)的基于胚胎干細(xì)胞和DNA同源重組的基因打靶技術(shù)相比,體細(xì)胞基因編輯技術(shù)周期短、成本低、可以更簡單的實現(xiàn)時空表達(dá)的調(diào)控。由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)揮功能需要Cas9蛋白和sgRNA的共同作用,兩者缺一不可,在本研究中,我們利用α-MHCCas9小鼠Cas9蛋白在心肌細(xì)胞表達(dá)的特異性及AAV9病毒對心臟的靶向性,用構(gòu)建的表達(dá)針將Oga編碼區(qū)的sgRNA的AAV9病毒導(dǎo)入α-MHCCas9小鼠中,利用qPCR和Western blot印記雜交檢測到心臟組織內(nèi)Oga的成功敲除及O-GlcNAcylation表達(dá)水平的升高,證實了成功應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)建立了成體心肌細(xì)胞Oga敲除小鼠模型。

以往的研究利用了一系列遺傳修飾小鼠模型揭示了O-GlcNAcylation在心臟穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮了關(guān)鍵而復(fù)雜的功能。O-GlcNAcylation修飾受到OGT和OGA的共同調(diào)節(jié)。心肌細(xì)胞特異性O(shè)gt過表達(dá)能夠引起蛋白過度的O-GlcNAcylation修飾進(jìn)而導(dǎo)致心衰及小鼠死亡。成型的心肌細(xì)胞特異性O(shè)gt敲除小鼠只有12%可以存活到4周齡,表現(xiàn)出嚴(yán)重的心衰表型;成體可誘導(dǎo)的Ogt敲除小鼠在長久缺失Ogt表達(dá)時也會發(fā)生進(jìn)行性的心臟功能異常。此外,可誘導(dǎo)的Ogt敲除小鼠在壓力負(fù)荷狀態(tài)下心室會發(fā)生更嚴(yán)重的收縮功能障礙[8]。這些研究表明,OGT的穩(wěn)定表達(dá)及精確調(diào)控對于心臟正常功能的維持至關(guān)重要。作為O-GlcNAcylation調(diào)控的另一個關(guān)鍵酶,OGA被證實在心臟中過表達(dá)可以預(yù)防或緩解Ogt轉(zhuǎn)基因小鼠、Prmt5敲除小鼠及糖尿病小鼠心臟的異常表型,提示OGA在心臟組織結(jié)構(gòu)和功能維持方面發(fā)揮重要作用。由于以往研究發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞特異性O(shè)ga過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠心臟無顯著異常[9],為了進(jìn)一步研究內(nèi)源性O(shè)ga在心臟穩(wěn)態(tài)維持中的功能,我們對建立的成體心臟特異性表達(dá)Oga敲除小鼠進(jìn)行系統(tǒng)的表型分析,發(fā)現(xiàn)敲除小鼠的心臟組織形態(tài)與功能在基礎(chǔ)水平與對照小鼠相比無明顯異常,該結(jié)果也與此前一項心肌細(xì)胞Oga單倍劑量不足小鼠的研究結(jié)果一致[10]。今后的研究中需要進(jìn)一步關(guān)注在病理條件刺激下Oga敲除對心臟功能的影響。

綜上所述,本研究構(gòu)建的成體心肌細(xì)胞特異性O(shè)ga敲除小鼠為深入研究生理及病理狀態(tài)下,OGA以及O-GlcNAcylation在體內(nèi)心臟穩(wěn)態(tài)維持中的功能提供了良好的實驗動物模型。