魏學(xué)軍，李雪營(yíng)，林先燕

(黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州 都勻 558013)

鐵莧菜作為常用中藥材被《中國(guó)藥典》(2020版)收錄，其功能以清熱利濕、收斂止血為主，主要含鞣質(zhì)、黃酮類、生物堿類等成分，臨床用途廣泛。在貴州苗族聚集區(qū)，因其內(nèi)服治療喘咳、腹瀉、紅白痢疾，外用止血的療效顯著，被《中華本草》(苗藥卷)收載，苗藥名為“海蚌含珠”[1]?，F(xiàn)有研究表明[2-4]，鐵莧菜中所含鞣質(zhì)的水解產(chǎn)物沒(méi)食子酸具有止瀉、平喘、抗菌消炎和止血的生物活性，這進(jìn)一步驗(yàn)證了該民族地區(qū)將其水煎服治療喘咳、腹瀉、紅白痢疾等癥狀的科學(xué)合理性。為保證其湯劑制備的應(yīng)用療效和質(zhì)量，本文以沒(méi)食子酸得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)黔產(chǎn)鐵莧菜水煎法的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，以期為實(shí)際應(yīng)用提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)性理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 Agilent 1260 Infinity II型液相色譜系統(tǒng)(北京安捷倫公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海碩光公司)；低速離心機(jī)(德國(guó)HERAEUS)；真空干燥箱(上海金山公司)；電子天平(瑞士METTLER)。沒(méi)食子酸對(duì)照品(購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110831-201906)，乙腈為色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，水為自制重蒸餾水，其他試劑均為AR級(jí)。鐵莧菜原藥材(樣品編號(hào)202007)采自黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校原云宮校區(qū)植物園試驗(yàn)田地，經(jīng)本校中藥教研室李香教授鑒定為大戟科植物AcalyphaaustralisL.的干燥全草。

1.2 方法

1.2.1 生品的制備[5]將凈制后的新鮮鐵莧菜摘取全葉，切成寬絲；根、莖切段，干燥后混勻即得。

1.2.2 供試品溶液的制備 稱取干燥至恒重過(guò)3號(hào)篩的鐵莧菜生品粉末1 g，按相關(guān)工藝提取，合并提取液，經(jīng)過(guò)濾、離心后定容至100 ml容量瓶中，冷藏備用。

1.2.3 沒(méi)食子酸含量測(cè)定的色譜條件 色譜柱選擇Diamonsil C18(5 μm，250 mm × 4.6 mm)，以乙腈-0.05%磷酸溶液(4∶96)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，室溫，流速控制為1 ml.min-1，進(jìn)樣量取10 μl。沒(méi)食子酸對(duì)照品和供試品色譜見(jiàn)圖1。

圖1 沒(méi)食子酸對(duì)照品(A)和供試品(B)HPLC色譜圖

1.2.4 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品22.01 mg，用流動(dòng)相定容至100 ml量瓶中，搖勻即得對(duì)照品貯備液；另取1 ml貯備液用流動(dòng)相定容至10 ml量瓶中，搖勻即得對(duì)照品溶液。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密移取不同體積分?jǐn)?shù)對(duì)照品溶液按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品溶液濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=3.522 3×107C-1 025.493 5(r=0.999 9)。對(duì)照品在0.022 0～0.220 1 μg范圍線性關(guān)系良好。

1.2.6 方法學(xué)考察 取對(duì)照品溶液10 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，峰面積RSD值2.13%，說(shuō)明儀器精密度高。另取對(duì)照品溶液10 μl，按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件分別在 0、30、60、120、180、240 min測(cè)定，峰面積RSD值2.61%，說(shuō)明對(duì)照品溶液在240 min內(nèi)穩(wěn)定。另稱取干燥至恒重過(guò)3號(hào)篩的鐵莧菜生品粉末1 g，5份，按實(shí)驗(yàn)號(hào)1條件制備供試品溶液，微孔濾膜過(guò)濾，按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，峰面積RSD值2.07%，說(shuō)明該方法重現(xiàn)性好。取已知含沒(méi)食子酸量的鐵莧菜生品粉末1 g，5份，按實(shí)驗(yàn)號(hào)1條件制備供試品溶液，微孔濾膜過(guò)濾，按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，對(duì)照品平均回收率98.82%，RSD值 1.79%。

1.2.7 含量測(cè)定 精密移取不同實(shí)驗(yàn)號(hào)樣品提取所得供試品溶液，微孔濾膜過(guò)濾，按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定并計(jì)算沒(méi)食子酸得率。

1.2.8 因素水平 根據(jù)單因素預(yù)試驗(yàn)考察結(jié)果，固定提取2次，另選取固液比(A)、提取溫度 (B)、提取時(shí)間 (C)作為考察因素，各因素取3個(gè)水平。詳見(jiàn)表1。

表1 因素水平表

1.2.9 工藝優(yōu)選 按實(shí)驗(yàn)號(hào)稱取9份樣品，每份1 g，依據(jù)正交試驗(yàn)安排表進(jìn)行提取并測(cè)定沒(méi)食子酸得率(表2)。數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件包分析處理，以直觀分析結(jié)合方差分析(表3)確定最優(yōu)工藝參數(shù)。

表2 正交試驗(yàn)安排表及結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 提取工藝 從表2的R值和K值作直觀分析，可選擇工藝參數(shù)為A3B3C3。表3方差分析結(jié)果表明，提取溫度(B)對(duì)沒(méi)食子酸得率影響顯著(P<0.05 )，故確定B3；提取時(shí)間(C)和固液比(A)對(duì)得率的影響無(wú)顯著性(P>0.05 )，從節(jié)約溶媒和時(shí)間的角度考慮，提取時(shí)間確定C1、固液比確定A1，得優(yōu)選的最佳提取工藝參數(shù)為A1B3C1。

2.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取干燥至恒重過(guò)3號(hào)篩的鐵莧菜生品粉末5份，每份1 g，按優(yōu)選的最佳提取工藝參數(shù)制備供試品溶液，微孔濾膜過(guò)濾后按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果顯示，沒(méi)食子酸平均得率為2.572 5 mg.g-1，RSD值1.71%，說(shuō)明優(yōu)選的提取工藝科學(xué)合理，重現(xiàn)性好。

3 討論

水煎服是貴州苗族集聚區(qū)采用鐵莧菜治療喘咳、腹瀉、紅白痢疾等癥狀的常用方法，煎煮工藝的合理性，直接決定或影響藥物療效的發(fā)揮。本研究結(jié)果表明，不同煎煮工藝參數(shù)對(duì)指標(biāo)性成分的含量有影響，尤其是煎煮溫度，水溫越高越利于沒(méi)食子酸的溶出。究其原因，可能與沒(méi)食子酸的化學(xué)性質(zhì)有關(guān)，沒(méi)食子酸具有極強(qiáng)的親水性，易溶于水、乙醇，尤其是沸水。

課題組前期的研究結(jié)果表明[6]，以乙醇為提取溶劑，采用回流法按優(yōu)選的工藝參數(shù)提取，沒(méi)食子酸平均得率(7.888 0 mg.g-1)顯著高于本研究水煎法的得率(2.572 5 mg.g-1)。該結(jié)果提示，不同提取方法和工藝對(duì)鐵莧菜中沒(méi)食子酸提取率的影響顯著，因而需要根據(jù)實(shí)際需求選擇科學(xué)合理的提取方法和工藝。