■ 劉堯君 雷 劍 趙小剛 譙仕彥 卞國(guó)志*

（1.廣東海大集團(tuán)股份有限公司畜牧水產(chǎn)研究中心，廣東廣州 511400；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193；3.清遠(yuǎn)海貝生物技術(shù)有限公司，廣東清遠(yuǎn) 511853）

支鏈氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸。支鏈氨基酸可以通過(guò)改善腸道發(fā)育[1-2]以及提高動(dòng)物采食量[3]、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率[4]、氨基酸利用率[5]和肌肉蛋白的合成[6]來(lái)促進(jìn)動(dòng)物的快速生長(zhǎng)。

異亮氨酸是人和動(dòng)物的一種必需氨基酸。因其具有支鏈結(jié)構(gòu)的中性脂肪族氨基酸，故可以參與調(diào)節(jié)生物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)代謝和生長(zhǎng)發(fā)育等重要的生理功能[7-8]。飼料中添加1%的異亮氨酸可通過(guò)改善斷奶仔豬回腸屏障來(lái)預(yù)防腹瀉的發(fā)生[9]。Goodarzi 等[2]發(fā)現(xiàn)異亮氨酸通過(guò)改善腸道菌群結(jié)構(gòu)來(lái)促進(jìn)斷奶仔豬的生長(zhǎng)。但當(dāng)飼料中缺乏異亮氨酸時(shí)，會(huì)對(duì)育肥豬生長(zhǎng)性能、胴體性狀造成負(fù)面影響[10]。但關(guān)于異亮氨酸對(duì)斷奶仔豬階段的影響研究報(bào)道較少。因此，本試驗(yàn)通過(guò)在斷奶仔豬飼糧中添加不同水平的異亮氨酸，研究其對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)和腸道微生物的影響，為提高斷奶仔豬生長(zhǎng)性能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)選用（28±2） d 斷奶的杜×長(zhǎng)×大健康仔豬180 頭，初始體重（7.82±0.52） g，按照體重隨機(jī)分為6 個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5頭仔豬，分別采食6 種添加不同水平異亮氨酸的試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)期為21 d。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)飼糧

飼糧參考NRC（2012）豬營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)飼組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1，其中對(duì)照組飼糧粗蛋白水平18.50%，異亮氨酸水平為0.78%，其他各組飼糧蛋白水平均為18.50%，異亮氨酸水平依次為0.87%、0.94%、1.01%、1.09%、1.16%。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在廣東海大集團(tuán)高州豬場(chǎng)（中國(guó)廣東）進(jìn)行。試驗(yàn)采用全封閉豬舍，豬舍溫度控制在（25±1） ℃、濕度維持在58%～74%。顆粒料飼喂，自由采食和飲水。按豬場(chǎng)常規(guī)管理程序進(jìn)行驅(qū)蟲和免疫，并觀察、記錄動(dòng)物的健康狀況。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能

分別于試驗(yàn)開(kāi)始和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)以重復(fù)為單位對(duì)仔豬空腹稱重，以重復(fù)為單位記錄采食量，并計(jì)算平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）、飼料轉(zhuǎn)化率（FCR）。

平均日采食量（ADFI，kg）=（給料量-余料量）/（試驗(yàn)天數(shù)×仔豬頭數(shù)）

平均日增重（ADG，kg）=（末重-初重）/（試驗(yàn)天數(shù)×仔豬頭數(shù)）

飼料轉(zhuǎn)化率（FCR）=ADFI/ADG

1.4.2 糞樣收集及處理

在試驗(yàn)第21天，每個(gè)處理組挑選6頭體重一致的仔豬，收集新鮮的糞樣，立刻置于液氮中冷凍。將收集的樣品儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱。

1.4.3 血清采集

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，試驗(yàn)豬禁食12 h，每個(gè)處理選取接近平均體重的豬，前腔靜脈采血，靜置0.5 h 后3 500 r/min 4 ℃離心10 min，取上清，置于-20 ℃保存，用于檢測(cè)血清中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、總抗氧化能力（T-AOC）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL8）、白細(xì)胞介素-22（IL-22）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、干擾素-γ（INF-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、葡萄糖（GLU）、乳酸脫氫酶（LDH）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）、尿素（UREA）、肌酐（CREA）、α-淀粉酶（α-AMY）、三酰甘油（TG）、膽固醇（CHO）。所用試劑盒均為南京建成生物工程研究所有限公司，檢測(cè)方法均按照說(shuō)明書要求操作和計(jì)算。

1.4.4 糞便微生物16S rRNA測(cè)定與分析

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，用無(wú)菌防爆試管收集每只豬的新鮮糞便后迅速放于液氮中，用于微生物16S rRNA測(cè)定與分析。具體操作步驟如下。

① 新鮮糞便基因組DNA 的提?。何? mL CABT 裂解液和1 g 樣品置于2 mL 無(wú)菌EP 管，加入適量溶菌酶，渦旋1 min 使樣品充分混合，65 ℃水浴10 min；12 000 r/min、4 ℃離心10 min 取上清，加入酚（pH 為8.0）∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）50 μL 上述條件離心10 min；取上清至1.5 mL 離心管，加入氯仿∶異戊醇（24∶1）50 μL上述條件離心10 min；取上清至1.5 mL 離心管，加入異丙醇，-20 ℃沉淀，上述條件離心10 min；棄上清，使用1 ml 75%乙醇洗滌2次，小心吸取上層液體，室溫晾干；加入ddH2O溶解DNA；

② PCR擴(kuò)增：提取的DNA使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的純度和濃度，取適量的樣品于離心管中，使用無(wú)菌水稀釋樣品至1 ng/μL。使用引物341F（5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’）和806R（5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’）對(duì)V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)展，擴(kuò)展體系如下。

模板：稀釋后的基因組DNA（1 ng/μL）10 μL；引物：341F、806R（0.2 μmol/L），各1 μL；酶和緩沖液：Phusion Master Mix，15 μL；水：超純水，2 μL；

PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性1 min；30 個(gè)循環(huán)（包括98 ℃，10 sec；50 ℃，30 sec；72 ℃，30 sec）；72 ℃，5 min。擴(kuò)展的PCR 產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)并割膠回收目標(biāo)條帶。

③ Illumina Novaseq 測(cè)序平臺(tái)：使用Nova Seq 6000 PE250進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.4.5 新鮮糞便微生物16S rRNA信息分析

將原始的fastq文件使用QIIME2處理，使用dada 2插件進(jìn)行質(zhì)控、修剪、去噪和拼接。去除嵌合體后，得到最后的特征序列表格；隨后使用QIIME2-featureclassifier 將該特征序列比對(duì)到預(yù)先訓(xùn)練好的13.8 版本的GREENGENE 數(shù)據(jù)庫(kù)，得到物種分類信息表；使用QIIME2-feature-table插件去除線粒體序列。

1.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

采用SAS 9.4 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，LSD 多重比較，結(jié)果以平均值表示，P＜0.05 表示具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧異亮氨酸水平對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，與0.78% Ile水平相比，0.87%、0.94%、1.01%、1.09%、1.16% Ile 水平對(duì)斷奶仔豬的末重、平均日采食量、平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率均無(wú)顯著影響（P＞0.05）。當(dāng)飼糧Ile 水平為1.01%時(shí)，仔豬末重最高，高于0.78% Ile 水平2.89%，但差異不顯著（P＞0.05）。且飼糧Ile 水平為1.01%時(shí)，其飼料轉(zhuǎn)化率為所有試驗(yàn)組中最低，但與其余各組差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 飼糧異亮氨酸水平對(duì)斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表3 可知，與0.78% Ile 水平相比，0.87%、0.94%、1.01%、1.09%、1.16% Ile 水平對(duì)斷奶仔豬血清T-AOC、SOD、GSH-Px 和MDA 均 無(wú)顯著 差異（P＞0.05）。以上結(jié)果表明不同飼糧Ile水平對(duì)斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)均無(wú)負(fù)面影響。

表3 飼糧異亮氨酸水平對(duì)斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響（n=6）

2.3 飼糧異亮氨酸水平對(duì)斷奶仔豬血清免疫指標(biāo)的影響

由表4可知，當(dāng)飼糧Ile水平為1.01%時(shí)，血清IgA水平顯著高于0.87%、0.94%、1.09%、1.16 Ile 水平（P＜0.05），但與0.78% Ile 水平無(wú)顯著差異（P＞0.05）。飼糧Ile 水平為1.01%時(shí)血清IgA 水平高于其他各水平，表明飼糧中Ile 水平為1.01%時(shí)有利于提高斷奶仔豬的免疫力。但飼糧Ile 水平對(duì)斷奶仔豬血清中促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α、INF-γ、IL-22 均無(wú)顯著影響（P＞0.05）。以上結(jié)果表明飼糧Ile 水平為1.01%可以改善斷奶仔豬的免疫功能。

表4 飼糧異亮氨酸水平對(duì)斷奶仔豬血清免疫指標(biāo)的影響（n=6）

2.4 飼糧異亮氨酸水平對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

由表5可知，飼糧Ile水平為0.94%時(shí)，UREA水平顯 著 高 于0.78% Ile 水 平（P＜0.05），但 與0.87%、1.01%、1.09%、1.16% Ile 水平無(wú)顯著差異（P＞0.05）。飼糧Ile 水平對(duì)機(jī)體氮代謝和糖類代謝指標(biāo)均無(wú)顯著影響（P＞0.05），表明飼糧Ile 水平對(duì)機(jī)體的氮代謝和糖類代謝均無(wú)作用。

表5 飼糧異亮氨酸水平對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響（n=6）

2.5 飼糧異亮氨酸水平對(duì)斷奶仔豬腸道菌群的影響

由圖1 可知，在門水平，斷奶仔豬糞便菌群主要由擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、螺旋體門（Spirochaetes）和厚壁菌門（Firmicutes）這四種的菌群組成，其中擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）為優(yōu)勢(shì)菌群，共占糞便菌群的90%以上。由圖2 可知，在屬水平，Ile 水平為0.94%時(shí)，富集到較多的羧酸菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1），norank_f_Muribaculaceae，螺旋體屬（Treponema）；Ile 水平為1.01%時(shí)，與0.78% Ile 組相比，提高了有益菌Norank_f_norank_o_Clostridia_UCG_014的豐度。

圖1 飼糧異亮氨酸水平對(duì)斷奶仔豬糞便菌群結(jié)構(gòu)的影響（門水平）

圖2 飼糧異亮氨酸水平對(duì)斷奶仔豬糞便菌群結(jié)構(gòu)的影響（屬水平）

3 討論

3.1 飼糧異亮氨酸對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

以玉米-豆粕型為基礎(chǔ)的飼料配方中，一般不會(huì)出現(xiàn)Ile 的缺乏。當(dāng)以血粉替代部分豆粕作為基礎(chǔ)飼糧的蛋白質(zhì)來(lái)源配制Ile 缺乏的飼糧時(shí)，隨著飼糧Ile水平的提高，斷奶仔豬和肥育豬的平均日增重、平均日采食量和肉料比顯著提高[11-13]。Lordelod 等[14]發(fā)現(xiàn)在以玉米-小麥-豆粕型低蛋白飼糧飼喂斷奶仔豬時(shí)，通過(guò)補(bǔ)充0.13% Ile 可以提高其生長(zhǎng)速度。Ma 等[15]研究發(fā)現(xiàn)添加0.13% Ile 可以提高肉雞的平均日采食量和平均日增重。本試驗(yàn)中，飼糧Ile 水平對(duì)保育仔豬的平均日采食量和平均日增重均沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響。與羅燕紅等[10]和邱磊[16]的研究結(jié)果一致。這可能是由于本試驗(yàn)采用的飼糧為玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，沒(méi)有設(shè)計(jì)出Ile缺乏的對(duì)照組。

3.2 飼糧異亮氨酸水平對(duì)斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

劉恒晨[17]研究表明，飼糧中添加0.4% Ile 后顯著提高了AA 肉雞血清中GSH-Px 水平，增強(qiáng)了機(jī)體的抗氧化能力。宮碧霜等[18]發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.5% Ile后顯著提高了小鼠血清中T-GSH 活性并顯著降低了MDA 含量，提高了小鼠機(jī)體的抗氧化能力。但Dong等[19]研究發(fā)現(xiàn)，給28 周齡的羅曼褐蛋雞飼喂Ile 水平為0.56%、0.67%、0.78%、0.86%和0.96%飼糧12周，對(duì)其血液和肝臟中的T-AOC、SOD 和MDA 均無(wú)影響。本試驗(yàn)中，不同水平的Ile 并未改善斷奶仔豬體內(nèi)抗氧化功能。

3.3 飼糧異亮氨酸水平對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

血液生理生化指標(biāo)可以反映機(jī)體生理機(jī)能及代謝狀況。血清中TP、ALB、UREA、ALT 等是衡量機(jī)體氮代謝的主要指標(biāo)。尤其是血清UREA 是蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物，其濃度可以準(zhǔn)確地反映動(dòng)物體內(nèi)氨基酸合成蛋白質(zhì)效率的高低，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)合成和飼料轉(zhuǎn)化效率增加時(shí)，UREA 含量降低，反之則升高[20]。本試驗(yàn)中，隨著飼糧中Ile水平的增加，UREA 含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，表明Ile水平為0.94%不利于斷奶仔豬蛋白質(zhì)的合成和代謝。GLU、α-AMY 和LDH 是衡量機(jī)體糖代謝的主要指標(biāo)。本試驗(yàn)中，Ile 的添加并沒(méi)有引起這些指標(biāo)的差異，表明Ile 對(duì)斷奶仔豬糖代謝無(wú)顯著調(diào)節(jié)作用。

3.4 飼糧異亮氨酸水平對(duì)斷奶仔豬血清免疫指標(biāo)的影響

Ile 不僅是體內(nèi)糖、脂及蛋白代謝的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，同樣也是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要能源物質(zhì)和免疫分子合成底物。大量試驗(yàn)研究了Ile 在多種疾病模型中發(fā)揮了重要的免疫功能。在本試驗(yàn)中，當(dāng)飼糧中Ile水平為1.01% 時(shí)，仔豬血清中IgA 水平顯著高于0.87%、0.94%、1.09%、1.16% Ile 水 平，表 明 添加1.01% Ile可以提高斷奶仔豬的免疫功能，進(jìn)而促進(jìn)斷奶仔豬的生長(zhǎng)發(fā)育。與本研究一致，任曼[21]研究發(fā)現(xiàn)，與飼糧Ile 水平為0.64%相比，飼糧Ile 水平為1.09%可顯著提高斷奶仔豬血液中IgA 的水平，進(jìn)而增強(qiáng)斷奶仔豬的免疫力。

3.5 飼糧異亮氨酸水平對(duì)斷奶仔豬腸道微生物的影響

腸道內(nèi)的微生物由細(xì)菌、真菌和原生體組成。腸道微生物具有促進(jìn)腸道成熟、調(diào)節(jié)免疫、提高生長(zhǎng)性能的作用。正常情況下，腸道微生物維持著動(dòng)態(tài)平衡。其中擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、螺旋體門（Spirochaetes）和厚壁菌門（Firmicutes）是豬糞便微生物門水平中最主要四種菌群[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，與0.78% Ile 水平相比，飼糧中Ile 水平為1.01%時(shí)，增加了斷奶仔豬腸道中有益菌Norank_f_norank_o_Clostridia_UCG_014的豐度。有研究表明Norank_f_norank_o_Clostridia_UCG_014豐度的提高，可以降低結(jié)腸炎的發(fā)生，提高腸道的健康[24]。

4 結(jié)論

在飼糧中添加不同水平的異亮氨酸對(duì)斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能和血清生化指標(biāo)無(wú)顯著影響，表明異亮氨酸對(duì)斷奶仔豬的生產(chǎn)性能無(wú)負(fù)面影響。此外，與0.87%異亮氨酸水平相比，含有1.01%異亮氨酸的飼糧顯著提高斷奶仔豬血清中IgA 水平，進(jìn)而提高斷奶仔豬的健康，這可能是由于異亮氨酸能夠改變腸道微生物組成，增加了腸道有益菌Norank_f_norank_o_Clostridia_UCG_014的豐度。綜合考慮，在本試驗(yàn)條件下，推薦在8～17 kg 斷奶仔豬飼糧中異亮氨酸水平為1.01%。