■ 杜云龍 楊 濛 欒嘉明 馮 鑫 楊東旭 金英海 張 敏 耿春銀

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133000）

我國玉米秸稈年產(chǎn)量約為2.43億噸，但由于散戶農(nóng)民種植居多，且單獨(dú)處理秸稈的性價(jià)比低，導(dǎo)致大量秸稈被農(nóng)民就地焚燒或者丟棄，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染等問題[1]。玉米秸稈是草食家畜的粗飼料來源之一，是良好且具有飼用價(jià)值的非糧型飼料[2]。然而，由于玉米秸稈中含有較多的木質(zhì)素導(dǎo)致消化率較低、適口性較差的原因，使玉米秸稈的利用受到了很多限制[3]。因此，探究如何提高玉米秸稈的利用率和適口性對(duì)于畜牧業(yè)的發(fā)展尤為重要。

目前，針對(duì)秸稈降解的主要方法為物理法、化學(xué)法、物理化學(xué)法和生物處理法[3]。復(fù)合菌劑發(fā)酵屬于生物處理法，具有耗能少、成本低，可持續(xù)發(fā)展等優(yōu)勢[1]，其作用機(jī)理是通過利用能夠產(chǎn)生纖維素降解酶的細(xì)菌或真菌對(duì)玉米秸稈中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素進(jìn)行水解處理[4]。地衣芽孢桿菌具有極強(qiáng)的抗逆性，能耐受飼料制粒高溫、擠壓與干燥，且能夠分泌纖維素酶、內(nèi)葡聚糖酶等[5]。黑曲霉菌經(jīng)過固態(tài)發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生纖維素酶，在水稻秸稈中添加黑曲霉菌，會(huì)降低樣品中的中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）含量，可極大提高秸稈等飼料品質(zhì)[6]。此外，通過測定經(jīng)黃孢原毛平革菌發(fā)酵后秸稈的木質(zhì)纖維素含量等證實(shí)了其對(duì)玉米秸稈具有較為理想的降解效果[7-9]。據(jù)報(bào)道，混合發(fā)酵效果普遍優(yōu)于單一菌株發(fā)酵，且已有研究表明黑曲霉菌、地衣芽孢桿菌和黃孢原毛平革菌相互組合發(fā)酵飼料并不會(huì)產(chǎn)生拮抗作用[10-12]。由于不同菌種在發(fā)酵玉米秸稈時(shí)所產(chǎn)生的纖維素水解酶種類和速度各不相同，各菌種之間的組合效果也存在差異，因此篩選出優(yōu)質(zhì)的復(fù)合菌種是提高玉米發(fā)酵品質(zhì)的首要步驟。鑒于此目的，試驗(yàn)選取不同復(fù)合菌種對(duì)玉米秸稈進(jìn)行發(fā)酵，通過測定營養(yǎng)成分和分析體外瘤胃發(fā)酵的影響，以篩選出效果最佳的組合，為發(fā)酵玉米秸稈在畜牧業(yè)中的廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和材料

試驗(yàn)選取3 只裝有永久瘤胃瘺管的健康延邊黃牛（母牛）作為瘤胃液供體牛。玉米秸稈和糖蜜由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室提供。地衣芽孢桿菌（菌種編號(hào)CICC 2111，活菌數(shù)為0.18×108CFU/mL）、黑曲霉菌（菌種編號(hào)為CICC 41481，活菌數(shù)為0.28×108CFU/mL）、黃孢原毛平革菌（菌種編號(hào)SHBCCD 23069，活菌數(shù)為0.4×108CFU/mL）。黑曲霉菌使用PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、純化水1 L、自然pH）；地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)基成分為蛋白胨5.0 g、牛肉浸取物3.0 g、NaCl 5.0 g、純化水1.0 L，自然pH；黃孢原毛平革菌培養(yǎng)基成分為馬鈴薯提取液1 L、葡萄糖20 g、KH2PO43 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、維生素B1微量，自然pH。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

玉米秸稈發(fā)酵試驗(yàn)：將保存于超低溫冰箱中的試驗(yàn)菌株取出置于4 ℃冰箱內(nèi)緩慢解凍，以5%比例分別接種于對(duì)應(yīng)液體搖菌管，于160 r/min、37 ℃恒溫培養(yǎng)搖床中活化兩代，每代培養(yǎng)12 h?；罨蟮木暌韵嗤慕臃N比例接種于250 mL三角瓶液體培養(yǎng)基,于相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h。

將玉米秸稈切斷至1～2 cm，按照表1 進(jìn)行處理，每個(gè)處理組3 個(gè)重復(fù)，對(duì)照組僅添加等量純化水。將10 mL 混合菌懸液（兩種菌懸液各5 mL）均勻噴于100 g 玉米秸稈中，水分調(diào)節(jié)至70%。將樣品裝入自封袋中，使用真空包裝機(jī)抽真空并封口，于室溫下發(fā)酵21 d 后開袋取樣，進(jìn)行玉米秸稈的發(fā)酵品質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)以及酶的測定[13]。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及處理組編號(hào)（按照質(zhì)量比例）

體外產(chǎn)氣試驗(yàn)：試驗(yàn)共分為4 個(gè)處理組：對(duì)照組（CON）、黑曲霉菌+黃孢原毛平革菌組（HB）、黑曲霉菌+地衣芽孢桿菌組（HD）、地衣芽孢桿菌+黃孢原毛平革菌組（DB），每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù)。采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以粉碎為80目的發(fā)酵玉米秸稈200 mg為發(fā)酵底物。在試驗(yàn)當(dāng)天于晨飼前通過瘺管采集瘤胃內(nèi)容物，使用4層紗布過濾后收集于密封充滿CO2的錐形瓶內(nèi)，參照Menke體外產(chǎn)氣法[14]配置人工瘤胃培養(yǎng)液，在39 ℃恒溫和厭氧條件穩(wěn)定轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。發(fā)酵48 h時(shí)取出冰浴終止發(fā)酵，測定產(chǎn)氣參數(shù)及發(fā)酵參數(shù)等指標(biāo)，發(fā)酵期間記錄各組產(chǎn)氣量變化情況。

體外消化試驗(yàn)：試驗(yàn)處理與體外產(chǎn)氣試驗(yàn)一致，采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以粉碎為80 目的發(fā)酵玉米秸稈1 g 為發(fā)酵底物。發(fā)酵48 h 時(shí)取出后冰浴終止發(fā)酵，進(jìn)行體外消化率指標(biāo)的測定。

1.3 玉米秸稈發(fā)酵指標(biāo)測定

1.3.1 發(fā)酵品質(zhì)的鑒定

發(fā)酵后的玉米秸稈采用傳統(tǒng)青貯評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定[5]，挑選3 名實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物科學(xué)系同學(xué)經(jīng)培訓(xùn)合格后上崗，主要從氣味、結(jié)構(gòu)、色澤進(jìn)行評(píng)定，然后將得分匯總后分為優(yōu)良（16～20 分）、尚好（10～15 分）、一般（5～9分）、劣質(zhì)（0～4分）4個(gè)等級(jí)，詳見表2[15]。

表2 發(fā)酵品質(zhì)鑒定

1.3.2 營養(yǎng)成分及pH測定

將發(fā)酵后的玉米稈秸稈采用四分法取出15 g，放入裝有135 mL去離子水的燒杯中，在4 ℃中靜置24 h充分浸提后過濾后獲得浸提液，用于測定相關(guān)指標(biāo)。pH使用pH計(jì)測定[15]。干物質(zhì)（DM）采用GB/T 6435—2014進(jìn)行測定；粗蛋白（CP）采用FOSS 8400型全自動(dòng)凱氏定氮儀進(jìn)行測定；粗纖維（CF）采用GB/T 6434—2006 進(jìn)行測定；酸性洗滌纖維（ADF）采用NY/T 1459—2007進(jìn)行測定，中性洗滌纖維（NDF）采用GB/T 20806—2006 進(jìn)行測定，可溶性糖（WSC）采用由繼紅等[16]的研究方法進(jìn)行測定。

1.3.3 纖維素酶活性的測定

使用北京索萊寶科技有限公司試劑盒測定浸提液中的酸性木聚糖酶（ACX）、外切β-1,4-葡聚糖酶（C1）、濾紙酶（FPA）、β-葡萄糖苷酶（β-GC）活性。

1.4 體外產(chǎn)氣指標(biāo)的測定

1.4.1 產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣參數(shù)

于發(fā)酵0、2、4、6、8、10、12、16、20、24、30、36、48 h分別記錄體外產(chǎn)氣管的數(shù)值（mL），發(fā)酵48 h 后將樣品從水浴搖床中取出后迅速置于冰水中以終止發(fā)酵。

凈產(chǎn)氣量（mL）=某時(shí)間段產(chǎn)氣量（mL）-該時(shí)間段空白產(chǎn)氣量（mL）

產(chǎn)氣量采用?rskov[17]提出的產(chǎn)氣模型計(jì)算。

式中：Y——發(fā)酵底物在t時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量（mL）；

b——潛在產(chǎn)氣量（mL）；

c——產(chǎn)氣速率（mL/h）；

t——培養(yǎng)時(shí)間（h）；

利用SPSS 22.0 中非線性回歸程序進(jìn)行產(chǎn)氣參數(shù)的估算。

1.4.2 48 h發(fā)酵液發(fā)酵參數(shù)

體外產(chǎn)氣停止發(fā)酵后，使用發(fā)酵液測定相關(guān)指標(biāo)。pH 使用pH 測定儀測定；使用Broderick 等方法測揮發(fā)性脂肪酸（VFA）；參考馮宗慈等[18]的方法測定發(fā)酵液中NH3-N的含量；參考楊平平等[19]的方法測定發(fā)酵液中乳酸含量。

1.5 體外消化率的測定

將纖維濾袋用純化水清洗3次后放入105 ℃烘干箱內(nèi)烘至恒重并稱重記錄數(shù)值，用于計(jì)算干物質(zhì)（DM）體外消化率（IVDMD），粗蛋白（CP）含量測定使用FOSS 8400 型全自動(dòng)凱氏定氮儀進(jìn)行測定；酸性洗滌纖維（ADF）含量采用NY/T 1459—2007進(jìn)行測定，中性洗滌纖維（NDF）含量采用GB/T 20806—2006進(jìn)行測定。

IVDMD（%）=[（樣品DM重-殘?jiān)麯M重）/樣品DM重]×100

某營養(yǎng)物質(zhì)體外消化率（%）=[(樣品DM 重×樣本中該物質(zhì)含量-殘?jiān)麯M 重×該物質(zhì)的含量)/樣品DM重×樣品中該物質(zhì)的含量]×100

1.6 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan’s 法進(jìn)行多重比較，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同復(fù)合菌種發(fā)酵對(duì)玉米秸稈感官品質(zhì)的影響

由表3 可知，CON 組和HD 組的發(fā)酵秸稈評(píng)分為2 級(jí)，DB、HB組均為1級(jí)。

表3 不同復(fù)合菌種發(fā)酵對(duì)玉米秸稈感官品質(zhì)的影響

2.2 不同復(fù)合菌種發(fā)酵對(duì)玉米秸稈營養(yǎng)成分及pH的影響

由表4 可知，不同復(fù)合菌種發(fā)酵對(duì)玉米秸稈DM無顯著差異（P＞0.05），CON 組pH 顯著高于其他試驗(yàn)組（P＜0.05），各試驗(yàn)組的CP 均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），CF、ADF、WSC 含量各試驗(yàn)組均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），DB 組和HB組NDF 含量均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

表4 不同復(fù)合菌種發(fā)酵對(duì)玉米秸稈營養(yǎng)成分及pH的影響

2.3 不同復(fù)合菌種對(duì)發(fā)酵玉米秸稈的纖維素酶活性的影響

由表5可知，試驗(yàn)組的ACX、FPA、β-GC活性均顯著高于CON 組（P＜0.05）。HD 組和DB 組的C1活性顯著高于其他組（P＜0.05），其中DB組活性最高。

表5 不同復(fù)合菌種對(duì)發(fā)酵玉米秸稈的纖維素酶活性的影響(U/g)

2.4 不同復(fù)合菌種發(fā)酵對(duì)玉米秸稈體外發(fā)酵產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣參數(shù)的影響

由表6 可知，在發(fā)酵2、4、6、12 h 時(shí)各組產(chǎn)氣量無顯著差異（P＞0.05），8、10 h時(shí)CON 組的產(chǎn)氣量顯著低于HD 組（P＜0.05），16 h 時(shí)HD 組產(chǎn)氣量顯著高于CON 組和HB 組（P＜0.05），20 h 時(shí)HD、DB 組產(chǎn)氣量顯著高于其他試驗(yàn)組（P＜0.05），24、30、36、48 h 時(shí)DB 組產(chǎn)氣量均顯著高于CON、HB組（P＜0.05）。

表6 不同復(fù)合菌種對(duì)發(fā)酵玉米秸稈體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響（mL）

由表7 可知，DB 組的潛在產(chǎn)氣量顯著高于其他3組（P＜0.05），而HB 組顯著高于CON、HD 組（P＜0.05）；HD組的產(chǎn)氣速率顯著高于其他各組（P＜0.05）。

表7 不同復(fù)合菌種對(duì)發(fā)酵玉米秸稈體外產(chǎn)氣參數(shù)的影響

2.5 不同復(fù)合菌種發(fā)酵對(duì)玉米秸稈體外發(fā)酵48 h 發(fā)酵參數(shù)的影響

由表8可知，各試驗(yàn)組pH較CON組顯著降低（P＜0.05），其中HD 組pH 最低；HD、DB 組的氨態(tài)氮含量（NH3-N）顯著高于CON 組（P＜0.05）；HB 組的乳酸含量顯著高于CON 組（P＜0.05）；DB 組的總揮發(fā)性脂肪酸（T-VFA）含量顯著高于其他組（P＜0.05），CON 組顯著低于其他各組（P＜0.05）；DB 組的乙酸比例顯著高于CON 組和HB 組（P＜0.05），CON 組顯著低于其他各組（P＜0.05）；HB組的丙酸比例顯著高于其他各組（P＜0.05），CON 組顯著低于其他各組（P＜0.05）；HB 組的異丁酸比例顯著高于其他組（P＜0.05）；CON 組的丁酸比例顯著高于其他各組（P＜0.05）；HD 組的異戊酸比例顯著高于DB、HB 組（P＜0.05）；戊酸比例數(shù)值上各組之間均存在顯著差異（P＜0.05），其中HD 組數(shù)值最大；HB組的乙酸/丙酸值顯著低于其他組（P＜0.05）。

表8 不同復(fù)合菌種發(fā)酵對(duì)玉米秸稈體外發(fā)酵48 h發(fā)酵參數(shù)的影響

2.6 不同復(fù)合菌種發(fā)酵對(duì)玉米秸稈營養(yǎng)物質(zhì)體外消化率的影響

由表9 可知，各試驗(yàn)組的干物質(zhì)體外消化率（IVDMD）、粗蛋白體外消化率（IVCPD）均顯著高于CON 組（P＜0.05）；DB 組的中性洗滌纖維體外消化率（IVNDFD）顯著高于其他組（P＜0.05）；DB 組的酸性洗滌纖維體外消化率（IVADFD）顯著高于CON 組（P＜0.05）。

表9 不同復(fù)合菌種對(duì)發(fā)酵玉米秸稈營養(yǎng)物質(zhì)體外消化率的影響(%)

3 討論

3.1 復(fù)合菌種發(fā)酵玉米秸稈的效果評(píng)定

感官指標(biāo)是評(píng)價(jià)玉米秸稈發(fā)酵效果的最直接的指標(biāo)，在本試驗(yàn)中HB組和DB組的發(fā)酵感官評(píng)定等級(jí)為1 級(jí)，脈絡(luò)清晰可見，呈黃褐色無異味，從感官上看發(fā)酵效果好于CON組和HD組。

pH 是衡量發(fā)酵飼料品質(zhì)的重要依據(jù)，優(yōu)良的發(fā)酵飼料其pH 應(yīng)在4.2 以下[20]，本試驗(yàn)中3 組復(fù)合菌劑的pH 均小于4.2，且顯著低于CON 組，符合常規(guī)飼料pH 標(biāo)準(zhǔn)。通常粗飼料中NDF 和ADF 的比例越低，則該飼料的木質(zhì)化程度越低，在瘤胃當(dāng)中的消化率就會(huì)升高[21]，試驗(yàn)中3 個(gè)試驗(yàn)組的CF、ADF 的含量均顯著低于CON 組，HB 和DB 組的NDF 含量顯著低于CON組，其中DB組發(fā)酵最為充分，其原因可能是因?yàn)榘l(fā)酵前期地衣芽孢桿菌因其自身的除異菌作用而減少雜菌競爭，故將發(fā)酵底物培養(yǎng)成一個(gè)更為適合黃孢原毛平革菌發(fā)酵的環(huán)境，從而產(chǎn)生木質(zhì)纖維素降解酶使CF、NDF、ADF 降解得更充分[5]。試驗(yàn)中3 個(gè)試驗(yàn)組的粗蛋白比例均顯著高于CON 組，其中DB 組粗蛋白比例最高，發(fā)酵玉米秸稈中粗蛋白含量增加可能是微生物在發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生了菌體蛋白進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量的增加[22-23]。此外，在發(fā)酵飼料中粗蛋白比例增加的原因還可能是微生物在發(fā)酵和擴(kuò)繁時(shí)優(yōu)先利用發(fā)酵底物中的糖類等物質(zhì)來提供能量，減少了發(fā)酵底物總量，從而導(dǎo)致發(fā)酵底物中蛋白質(zhì)含量的表觀值增加，此原理亦可以解釋本試驗(yàn)3 個(gè)試驗(yàn)組中的可溶性糖含量均顯著低于CON組的現(xiàn)象。

ACX酶對(duì)植物中半纖維素的降解起著重要作用，它能將木聚糖降解成低聚木糖混合物及葡萄糖等[24-25]。本試驗(yàn)中，含有黑曲霉菌組的復(fù)合菌發(fā)酵底物中的ACX 酶活性顯著高于CON 組且高于無黑曲霉菌組，這可能與菌種自身產(chǎn)酶特性有關(guān)。從菌種ACX酶活性的角度分析，黑曲霉菌和黃孢原毛平革菌的產(chǎn)酶效果優(yōu)于地衣芽孢桿菌[26]。C1酶和β-GC 酶是能將纖維素完全水解的重要酶系[27]，在本試驗(yàn)中，DB 組中的β-GC 酶活性顯著高于CON 組，C1酶活力顯著高于其他試驗(yàn)組。在發(fā)酵初期，地衣芽孢桿菌可能利用發(fā)酵袋中殘存的氧氣進(jìn)行好氧發(fā)酵產(chǎn)生CO2和水，并隨著時(shí)間推移，發(fā)酵袋中氧氣耗盡，逐漸達(dá)到黃孢原毛平革菌最適發(fā)酵環(huán)境，開始產(chǎn)生大量C1酶[28]。綜上，3 組復(fù)合菌劑均會(huì)加快對(duì)玉米秸稈中粗纖維的降解速率，其中HB組和DB組效果更優(yōu)。

3.2 復(fù)合菌種發(fā)酵玉米秸稈對(duì)瘤胃體外發(fā)酵效果的影響

產(chǎn)氣量可判斷飼糧在瘤胃中可發(fā)酵程度，通常產(chǎn)氣量越高，底物的營養(yǎng)價(jià)值越高[29]。本試驗(yàn)中，DB 組的48 h產(chǎn)氣量和理論最大產(chǎn)氣量均顯著高于其他組，說明DB 組對(duì)玉米秸稈的發(fā)酵程度更強(qiáng)，使其營養(yǎng)價(jià)值更高。

在反芻動(dòng)物瘤胃中，pH 正常范圍為5.5～7.5，NH3-N 的適宜范圍為10～50 mg/dL[30]。體外產(chǎn)氣試驗(yàn)的結(jié)果表明，各組的pH 和NH3-N 含量均在正常范圍內(nèi)，說明使用復(fù)合菌劑發(fā)酵玉米秸稈對(duì)瘤胃發(fā)酵pH無不良影響，瘤胃發(fā)酵環(huán)境正常。動(dòng)物的營養(yǎng)消化吸收與VFA都有著密切的關(guān)系，成年反芻動(dòng)物大部分的能量來源是以VFA 的形式供給[31]。試驗(yàn)表明3 個(gè)試驗(yàn)組的TVFA 顯著高于CON 組，其中DB 組顯著高于其他組，且各試驗(yàn)組的丙酸濃度均顯著高于CON 組，這與胡鴻喆[32]關(guān)于復(fù)合菌制劑的體內(nèi)研究的結(jié)果一致。在瘤胃中丙酸比例越高，可供反芻動(dòng)物正常使用的能量也越高[33]。因此，通過復(fù)合菌劑發(fā)酵的玉米秸稈可能在瘤胃中得到更充分的降解，從而提高瘤胃中丙酸的比例，使機(jī)體供能更多。

消化率是指飼糧中被機(jī)體消化吸收的營養(yǎng)物質(zhì)占全部攝入體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的百分比，通常消化率的大小可反映出飼料營養(yǎng)價(jià)值的差異。試驗(yàn)表明，將經(jīng)復(fù)合菌劑發(fā)酵后的玉米秸稈進(jìn)行體外發(fā)酵與CON 組相比均會(huì)顯著提高DM、NDF、ADF 的體外消化率，以DB組最為顯著，這可能是玉米秸稈經(jīng)發(fā)酵后所產(chǎn)生的酶，將粗纖維水解后，破壞了植物細(xì)胞壁，壁內(nèi)所含的營養(yǎng)物質(zhì)得以釋放，進(jìn)而提高了營養(yǎng)物質(zhì)的消化率[34]。本試驗(yàn)中，3 個(gè)試驗(yàn)組的粗蛋白體外消化率顯著高于CON 組，由于微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的生物酶，可以將粗蛋白分解為更容易被腸道吸收的多肽或寡肽，這可能是本試驗(yàn)中蛋白質(zhì)消化率提高的原因。

4 結(jié)論

綜上，本試驗(yàn)選取的3 組菌劑進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵均會(huì)對(duì)玉米秸稈產(chǎn)生積極影響，其中地衣芽孢桿菌+黃孢原毛平革菌的復(fù)合菌組合，可降低玉米秸稈中的粗纖維、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維的含量，提高玉米秸稈粗蛋白含量和各種營養(yǎng)物質(zhì)在瘤胃中的消化率，與其他復(fù)合菌組合相比，對(duì)玉米秸稈的發(fā)酵效果最優(yōu)。