■ 秦淑杰 王 秀 白春蘋 江國托

（大連三儀藥業(yè)有限公司，遼寧大連 116036）

隨著我國養(yǎng)牛業(yè)現(xiàn)代化和集約化生產(chǎn)程度的提 高，犢牛腹瀉逐漸成為影響?zhàn)B牛業(yè)的主要疾病，其表現(xiàn)為高發(fā)病率和高病死率，是造成新生犢牛生長發(fā)育不良和死亡的主要因素之一。引起腹瀉的原因主要包括感染性因素和非感染性因素，感染性因素是由細(xì)菌、寄生蟲、病毒等感染引起，其中細(xì)菌感染性腹瀉在犢牛腹瀉中比例為10%～70%，大腸桿菌、沙門氏菌、等是主要的病原菌[1-3]。獸醫(yī)在犢牛腹瀉疾病中大部分使用廣譜抗生素類藥物進(jìn)行治療，導(dǎo)致耐藥性非常嚴(yán)重，而且使用抗生素治療腹瀉的效果并不是很理想，抗生素對于病毒和環(huán)境因素造成的腹瀉，使用后不但沒有效果，反而使腸道正常菌群紊亂致使?fàn)倥８篂a加重。研究表明[4]，用中藥蒲公英、黃連、板藍(lán)根等提取物能有效改善豬流行性腹瀉所致的新生仔豬生長性能下降和腸道損傷，減輕腹瀉。王竹青等[5]研究表明，用生地、枳殼、丹皮等中藥組建復(fù)方在牛病毒性腹瀉治療中可有效提高成年牛及犢牛的治療總有效率。單味中草藥由于活性單一，藥理性質(zhì)差，防治效果不理想。研究發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方通過協(xié)調(diào)多種藥物的活性成分，提高藥物對疾病的控制能力，經(jīng)配伍后，能取長補(bǔ)短，調(diào)整宿主機(jī)體生理狀態(tài)[6]。

我國中藥歷史悠久，源于天然，含有多種營養(yǎng)成分和天然化學(xué)成分，具有抑制胃腸道運(yùn)動(dòng)、抑菌、抗病毒和抗寄生蟲作用[7-9]，是抗生素替代必不可少的開發(fā)領(lǐng)域。因此開發(fā)既能治療因細(xì)菌導(dǎo)致的腹瀉，也能治療由病毒、寄生蟲和應(yīng)激刺激引起的綜合性犢牛腹瀉的復(fù)方中藥，在反芻動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)意義深遠(yuǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

白頭翁、馬齒莧、常山和黃芪均購自大連海王星辰大藥房（批號分別為200901、02920008、210613、210201；產(chǎn)地分別為吉林、河北、安徽宜城、甘肅）。營養(yǎng)瓊脂、瓊脂粉為北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；大腸桿菌K99購于中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；金黃色葡萄球菌為本實(shí)驗(yàn)室分離自腹瀉犢牛糞便。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 中藥復(fù)方合劑的制備

將白頭翁、馬齒莧、常山和黃芪60 ℃烘干，粉碎，按擬定處方比例（2∶1.5∶1∶1）準(zhǔn)確稱量，混勻。按各單因素條件水提，冰箱放置過夜，過濾后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至生藥量1.0 g/mL。

1.2.2 抑菌能力測定

采用牛津杯法，倒入約15 mL 已滅菌的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基于無菌培養(yǎng)皿中，凝固后37 ℃培養(yǎng)24 h備用。將待測致病菌菌懸液加入保溫45～50 ℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，吸取5 mL 于凝固備用的平板上做成菌層，使每個(gè)平板含菌量為1×107CFU。在培養(yǎng)皿上等距放置4 個(gè)牛津杯，分別注入200 μL 藥材提取液，每個(gè)平板設(shè)一個(gè)同體積的硫酸新霉素稀釋液（臨床用量，原粉萬分之四稀釋）作為空白對照，每個(gè)因素提取液設(shè)3 個(gè)平行，于37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，用游標(biāo)卡尺測量并記錄抑菌圈直徑，計(jì)算抑菌能力A，A=提取液抑菌圈直徑均值（mm）/硫酸新霉素抑菌圈直徑均值（mm）[10]。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 單因素試驗(yàn)

按擬定處方量稱取藥材，分別對提取溫度（60、70、80、90 ℃）、提取時(shí)間（75、90、105、120 min）、液料比（25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 mL/g）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察其提取液對大腸桿菌的抑菌圈直徑（每個(gè)單因素的四個(gè)條件提取液在同一個(gè)平板上做抑菌試驗(yàn)，無平板底菌濃度誤差，故無需計(jì)算抑菌能力）。根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果來確Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平范圍[11]。

1.3.2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇擬定處方提取液對大腸桿菌的抑菌能力較高的3個(gè)單因素對應(yīng)的參數(shù)作為優(yōu)化中藥復(fù)方合劑提取工藝的水平零點(diǎn)，如表1所示，分別為液料比（A）35∶1 mL/g、提取時(shí)間（B）90 min、提取溫度（C）80 ℃，系統(tǒng)生成17個(gè)試驗(yàn)處理。以提取液對大腸桿菌的抑菌能力和對金黃色葡萄球菌的抑菌能力為評價(jià)指標(biāo)，并采用客觀賦值的CRITIC 加權(quán)法計(jì)算二者的加權(quán)得分[12-13]，采用軟件Design-Expert 12進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化中藥復(fù)方合劑提取的因素與水平

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

以上數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，采用Excel 2010進(jìn)行整理，SPSS 20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥復(fù)方合劑提取條件單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溫度對提取工藝的影響

將提取液料比固定為30∶1 mL/g，提取時(shí)間固定為80 min，考察提取溫度分別為60、70、80、90 ℃時(shí)的提取液對大腸桿菌的抑菌圈直徑，結(jié)果見圖1。

圖1 提取溫度對中草藥提取液抑菌能力的影響

由圖1 可知，提取液對大腸桿菌的抑菌圈直徑隨提取溫度的增加呈先升后降的趨勢。抑菌圈直徑在提取溫度60～80 ℃呈遞增趨勢，80～90 ℃呈下降趨勢，說明一定程度的提高提取溫度有利于有效成分的釋放，但達(dá)到一定溫度也能破壞有效成分，而且提取溫度越高，能量消耗得越多，生產(chǎn)成本越高。故最佳提取溫度為80 ℃，此時(shí)抑菌圈直徑為23.32 mm。

2.1.2 提取時(shí)間對提取工藝的影響

將提取液料比固定為30∶1 mL/g，提取溫度固定為80 ℃，考察提取時(shí)間分別為75、90、105、120 min 時(shí)的提取液對大腸桿菌的抑菌圈直徑，結(jié)果見圖2。

圖2 提取時(shí)間對中草藥提取液抑菌能力的影響

由圖2 可知，提取液對大腸桿菌的抑菌圈直徑隨提取時(shí)間的增加呈先升后降的趨勢。抑菌圈直徑在提取時(shí)間75～90 min 呈遞增趨勢，90～120 min 呈下降趨勢，說明并非提取時(shí)間越長有效成分釋放得越多，相反提取時(shí)間過長，有效成分在長時(shí)間高溫狀態(tài)下分解，影響其抑菌效果。故最佳提取時(shí)間為90 min，此時(shí)抑菌圈直徑為24.86 mm。

2.1.3 液料比對提取工藝的影響

將提取時(shí)間固定為90 min，提取溫度固定為80 ℃，考察液料比分別為25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 mL/g時(shí)的提取液對大腸桿菌的抑菌圈直徑，結(jié)果見圖3。

圖3 液料比對中草藥提取液抑菌能力的影響

由圖3 可知，提取液對大腸桿菌的抑菌圈直徑隨液料比的增加呈先升后降的趨勢。抑菌圈直徑在液料比25∶1～35∶1 呈遞增趨勢，35∶1～40∶1 呈下降趨勢，說明提取溶劑（水）與有效成分的釋放并非正比關(guān)系[14-15]，且隨著提取溶劑的增多，濃縮消耗的能量增大，生產(chǎn)成本提高。故最佳提取液料比為35∶1 mL/g，此時(shí)抑菌圈直徑為25.67 mm。

由單因素試驗(yàn)可見，各因素之間存在交互作用，經(jīng)過提取溫度、提取時(shí)間和液料比的優(yōu)化，抑菌圈直徑由23.32 mm 提升至25.67 mm，因此需要進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.2.1 篩選結(jié)果

利用Design-Expert 12 軟件，以綜合評分（Y）為評價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)并提取中藥復(fù)方合劑，對提取液進(jìn)行大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌能力測定，采用在線SPSSUP 對抑菌能力數(shù)據(jù)進(jìn)行無量綱化處理，選擇CRITIC 權(quán)重法進(jìn)行權(quán)重賦值及分權(quán)[16]，標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)=(該次實(shí)測值-試驗(yàn)最低值)/(試驗(yàn)最高值-試驗(yàn)最低值)×100[13，17]，計(jì)算綜合評分Y 值。得到中藥復(fù)方合劑對大腸桿菌抑菌能力和對金黃色葡萄球菌抑菌能力的權(quán)重系數(shù)分別為53.24%、46.76%。加權(quán)得分公式Y(jié)=0.532 4×大腸桿菌抑菌能力標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)+0.467 6×金黃色葡萄球菌抑菌能力標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)，結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化中藥復(fù)方合劑提取工藝的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 回歸方程的建立及顯著性分析

根據(jù)BoxBehnken響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert12軟件對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析，得到二次多元回歸模型方程：Y=1.38+0.026 5A+0.061 3B+0.015 3C+0.002AB-0.011AC+0.041 3BC-0.067 1A2-0.107 3B2-0.073 9C2，該模型的決定系數(shù)R2=0.950 4，說明通過二次回歸得到的綜合評分模型與試驗(yàn)?zāi)M較好，有較好的預(yù)測性，能準(zhǔn)確反映3 個(gè)因素對中藥復(fù)方合劑提取工藝的影響。回歸模型方差分析見表3。

表3 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化中藥復(fù)方合劑提取工藝的回歸模型方差分析

由表3 可知，二次回歸模型具有較好的顯著性（P=0.000 9），同時(shí)失擬程度不顯著（P=0.535 1），表明模型能夠較好的反映液料比（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）與提取工藝的綜合評分（Y）的變化關(guān)系，該試驗(yàn)不存在失擬因素，所選的因素合理。根據(jù)P值大小可知，提取工藝考察的3 個(gè)因素對中藥復(fù)方合劑抑菌能力的影響程度依次為B＞A＞C，其中提取時(shí)間（B）為極顯著項(xiàng)，P值分別為0.001 2；液料比（A）、提取溫度（C）為不顯著項(xiàng)，P值0.056 5、0.230 3，顯著程度A＞C；二次項(xiàng)中，A2、B2、C2為極顯著項(xiàng)（P＜0.01），表明所選因素與響應(yīng)值并非簡單的線性關(guān)系。對液料比（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）之間的交互作用對中藥復(fù)方合劑提取工藝的影響進(jìn)行響應(yīng)面分析，提取時(shí)間（B）與提取溫度（C）對提取工藝的影響顯著（P＜0.05），液料比（A）與提取時(shí)間（B）的交互作用、液料比（A）與提取溫度（C）之間的交互作用對提取工藝的影響不顯著（P＞0.05）。

按所得模型繪制液料比（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）的交互作用對中藥復(fù)方合劑提取工藝影響的響應(yīng)面圖（圖4～圖6），當(dāng)三維曲面圖陡峭，坡度大時(shí)，說明影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，最高點(diǎn)就是交互因素的最佳條件[18]。模型預(yù)測最佳提取工藝：液料比36.416∶1，提取時(shí)間96.363 min，提取溫度84.142 ℃，此條件下預(yù)測提取液對大腸桿菌的抑菌能力為1.444，對金黃色葡萄球菌的抑菌能力為1.270，綜合評分Y為1.363。

圖4 液料比與提取時(shí)間對中藥復(fù)方合劑提取工藝綜合評分的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖5 液料比與提取溫度對中藥復(fù)方合劑提取工藝綜合評分的響應(yīng)面圖和等高線圖

2.2.3 提取工藝優(yōu)化結(jié)果及驗(yàn)證

為進(jìn)一步確定回歸方程的可預(yù)測性，通過對軟件中最佳的工藝條件進(jìn)行分析并結(jié)合試驗(yàn)生產(chǎn)條件的可操作性，將工藝修正為：液料比37∶1，提取時(shí)間96 min，提取溫度84 ℃，按此工藝條件進(jìn)行中藥復(fù)方合劑提取，平行操作3 次，分別對提取液進(jìn)行大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌能力測定，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，結(jié)果見表4。實(shí)際工藝提取后中藥復(fù)方合劑對大腸桿菌的抑菌能力為1.442 7，與預(yù)測值1.444 相比，相對誤差為0.09%，對金黃色葡萄球菌的抑菌能力為1.271 7，與預(yù)測值1.270 相比，相對誤差為0.13%，綜合評分Y 為1.378 0，與預(yù)測值1.363 相比，誤差為1.10%（＜5%），證明利用響應(yīng)面優(yōu)化得到的提取工藝條件誤差小，準(zhǔn)確性好，因此該方法應(yīng)用于中藥復(fù)方合劑提取工藝的優(yōu)化具有一定的應(yīng)用意義。

表4 中藥復(fù)方合劑提取工藝優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證

3 討論

體外抑菌試驗(yàn)是檢測藥物對各種致病菌的抑菌能力，是進(jìn)行臨床治療的前提和基礎(chǔ)，從側(cè)面體現(xiàn)了藥物的治療效果[19]。本試驗(yàn)篩選的中藥復(fù)方合劑，諸藥合用具有清熱解毒、燥濕止痢、溫中散寒、益氣健脾、固腸消積的功效。方中白頭翁為君藥，清熱解毒、涼血止痢，其有效成分白頭翁皂苷和香豆素類，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有很好的抑菌效果[20]。方中馬齒莧為臣藥，具有清熱解毒、涼血消腫、抗菌抗病毒，用于治療腸炎、熱毒血痢，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及霉菌均有明顯抑制作用，其水煎液可抑制病毒與細(xì)胞結(jié)合、降低病毒載量[21]。方中黃芪含有多種生物活性物質(zhì)、氨基酸和微量元素，能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，提高抗病能力，并且能營衛(wèi)氣血、改善腸道內(nèi)環(huán)境、扶正祛邪、平衡失調(diào)的菌群、清除氧自由基，使腹瀉癥狀迅速改善[22]。方中常山具有殺蟲、除痰消積的功效，能夠治療球蟲病及蓿草不轉(zhuǎn)。

創(chuàng)制新藥過程中，提取工藝對中藥提取效果有直接影響，進(jìn)而影響療效。提取工藝各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系往往是交互的[23]，可以通過響應(yīng)曲面的坡度和等高線的圓率來判斷兩因素交互作用對抑菌能力的顯著程度[24]。本研究通過考察液料比（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C），擬合最佳提取工藝建立響應(yīng)面法進(jìn)行工藝優(yōu)化[25]。以提取液對大腸桿菌的抑菌能力和對金黃色葡萄球菌的抑菌能力為評價(jià)指標(biāo)，并采用客觀賦值的CRITIC加權(quán)法計(jì)算二者的加權(quán)得分，計(jì)算提取工藝的綜合評分（Y）。提取工藝考察的3 個(gè)因素對中藥復(fù)方合劑抑菌能力的影響程度依次為B＞A＞C，其中提取時(shí)間（B）為極顯著項(xiàng)。通過Box-Behnken 試驗(yàn)，得到最佳工藝：液料比37∶1，提取時(shí)間96 min，提取溫度84 ℃。通過此優(yōu)化工藝提取的口服液對大腸桿菌的抑菌能力為1.442 7，對金黃色葡萄球菌的抑菌能力為1.276 7，綜合評分Y為1.378 0。

4 結(jié)論

通過CRITIC 法結(jié)合響應(yīng)面法對中藥復(fù)方合劑提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，可較準(zhǔn)確地預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果，并有效提高其抑菌能力，達(dá)到了優(yōu)化的目的，并為中試和生產(chǎn)提供依據(jù)。