路新利 劉 勇 李 巖 王瑩瑩 安 寧 劉 萌

（1.河北省疾病預(yù)防控制中心艾滋病防治所，河北 石家莊 050021；2.河北省邱縣中心醫(yī)院，河北 邯鄲 057450）

1981年，美國(guó)報(bào)道了全球首例獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）病例[1]。40年來(lái)，人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）廣泛傳播，已成為全球性的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。截至2020年年底，全球有3 770萬(wàn)例HIV感染/AIDS患者[2]。HIV主要分為HIV-1和HIV-2這2種類型，HIV-1是造成全球大流行的主要病原毒株，具有極強(qiáng)的復(fù)制、變異和重組能力，遺傳性復(fù)雜、多樣，是AIDS防治和疫苗研制的主要障礙[3]。本研究對(duì)河北省3例經(jīng)男男同性性接觸感染HIV-1的男男同性戀（men who have sex with men，MSM）病例的血漿樣本進(jìn)行HIV-1近似全長(zhǎng)基因組序列（near full-length genome，NFLG）分析，確定其重組模式，為研究HIV-1遺傳多樣性提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

3例患者（編號(hào)分別為150、110和171）均為MSM，2019年于河北省艾滋病確證中心實(shí)驗(yàn)室確證為HIV-1抗體陽(yáng)性，均通過(guò)不安全的同性性行為感染HIV-1。3人均已婚或同居，年齡分別為43、52和41歲，血液中HIV-1含量分別為5.45×105、3.02×105和2.54×104拷貝/mL，CD4細(xì)胞數(shù)分別為263、479和135個(gè)/μL。所有病例暴露前均未服用暴露前預(yù)防用藥，未進(jìn)行過(guò)抗HIV-1治療。在對(duì)這3例病例進(jìn)行耐藥基因型檢測(cè)時(shí)，初步分析其基因亞型分別為B/C、B/C和01_AE/B。本研究經(jīng)河北省疾病預(yù)防控制中心倫理委員會(huì)審核通過(guò)[IRB（S）-2020-002]。

1.2 方法

1.2.1 HIV-1 RNA提取和目的基因組擴(kuò)增

采集患者靜脈血樣本，離心分離血漿，-80 ℃保存待檢。參照德國(guó)Qiagen公司QIAamp Viral RNA Mini Kit說(shuō)明書(shū)，從140 μL血漿樣本中提取HIV-1 RNA。采用日本TaKaRa公司Prime Script One Step RT-PCR Kit和LA Taq，參照張菲等[4]的方法設(shè)計(jì)引物進(jìn)行NFLG（HXB2：649-9599）擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送北京博邁德基因測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 序列拼接比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析

用CExpress 9.1軟件將每個(gè)患者樣本的所有原始反應(yīng)序列拼接成1條完整的NFLG，使用HIVAlign在線軟件進(jìn)行基因序列比對(duì)（https：//www.hiv.lanl.gov/content/sequence/VIRALIGN/viralign.html），然后通過(guò)BioEdit 7.0軟件進(jìn)行手動(dòng)編輯和校對(duì)。采用MEGA 7.0軟件，基于鄰近法和Kimura 2-parameter model構(gòu)建neighborjoining進(jìn)化樹(shù)，以Bootstrap值≥70%為有意義。不同亞型參考株（A-D、H-K、O、CRF）的NFLG下載自HIV Databases數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.hiv.lanl.gov/）。

1.2.3 NFLG基因組鑲嵌結(jié)構(gòu)分析

首先用HIV Databases數(shù)據(jù)庫(kù)中的jpHMM在線軟件初步分析3條NFLG的基因重組圖譜。然后用SimPlot v3.5.1軟件進(jìn)一步分析NFLG與參考序列的相似性和重組模式，確認(rèn)NFLG的鑲嵌結(jié)構(gòu)和基因重組斷點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果

經(jīng)過(guò)核酸提取、擴(kuò)增和序列測(cè)定，獲得3條HIV-1 NFLG（GenBank序列編碼：ON959789-ON959791）。NFLG 150、NFLG 110和NFLG 171長(zhǎng)度分別為8 966、8 740和8 994 bp。基于這3條NFLG與參考序列構(gòu)建neighbor-joining進(jìn)化樹(shù)，在進(jìn)化樹(shù)上，病例110、150和171的NFLG與其他各參考亞型序列距離較遠(yuǎn)，分別形成了單獨(dú)的分支，其中110和150與CRF07_BC具有共同的根，見(jiàn)圖1。說(shuō)明這3例患者的NFLG可能是新型重組毒株，需要通過(guò)基因重組斷點(diǎn)分析進(jìn)行確認(rèn)。

圖1 基于NFLG的neighbor-joining進(jìn)化樹(shù)

2.2 NFLG jpHMM在線軟件分析結(jié)果

基于HXB2參考株的基因位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)與參考株CRF07_BC的基因組圖譜相比，病例110和150的jpHMM基因組圖譜右邊的env區(qū)基因重組斷點(diǎn)基本一致，但是在gag-pol區(qū)存在差異，病例150的jpHMM基因組圖譜分別在gag區(qū)1 270～1 411位點(diǎn)和pol的3 011～3 311位點(diǎn)缺少2個(gè)C和B的基因重組斷點(diǎn)，初步判定其可能為有C亞型和B亞型參與重組的新型重組毒株。病例110的jpHMM基因組圖譜在gag區(qū)1 270～1 411位點(diǎn)沒(méi)有重組斷點(diǎn)，并且在pol區(qū)的3 108±119位點(diǎn)有基因缺失，說(shuō)明該病例存在多種亞型毒株重組的可能。jpHMM基因組圖譜顯示病例171的NFLG與CRF01_AE一致。見(jiàn)圖2。

圖2 近似全長(zhǎng)基因組的jpHMM重組分析

2.3 近似全長(zhǎng)基因組基因相似性分析

采用SimPlot v3.5.1軟件對(duì)這3條NFLG和不同亞型的標(biāo)準(zhǔn)參考毒株進(jìn)行基因相似性分析，并確定基因重組斷點(diǎn)位置。結(jié)果顯示，NFLG 150是由CRF01_AE和CRF07_BC這2個(gè)循環(huán)重組形成的新型二代重組毒株，該序列的基因重組模式是2個(gè)CRF01_AE亞型片段分別插入到CRF07_BC亞型基因組骨架中，在BootScan圖譜上，插入重組位點(diǎn)1個(gè)在gag區(qū)的740～800位點(diǎn)，另1個(gè)在env區(qū)的8 320～8 400位點(diǎn)，見(jiàn)圖3。然而，由于插入的2個(gè)CRF01_AE片段均較短，分別約為60和80 bp，如果進(jìn)行基因亞區(qū)進(jìn)化樹(shù)分析難度較大，極有可能會(huì)與CRF07_BC參考序列集聚成簇，因此本研究未對(duì)其進(jìn)行基因亞區(qū)進(jìn)化分析。病例110和171的NFLG BootScan分析圖譜顯示，這2條NFLG分別為CRF07_BC亞型和CRF01_AE亞型，不是新型重組毒株，見(jiàn)圖4。

圖3 病例150的NFLG BootScan分析圖譜

圖4 病例110和171的NFLG BootScan分析圖譜

3 討論

斯坦福大學(xué)HIV公共數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.hiv.lanl.gov/components/sequence/HIV/ search/search.html）顯示，目前全球已有118種CRF和大量的獨(dú)特型重組毒株（unique recombinant form，URF）被發(fā)現(xiàn)。我國(guó)國(guó)家分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，隨著傳播途徑的轉(zhuǎn)變，CRF和URF數(shù)量快速增多，HIV-1亞型毒株的分布也發(fā)生了明顯變化[5]。當(dāng)前，性傳播已成為我國(guó)HIV最主要的傳播途徑，CRF07_BC和CRF01_AE是我國(guó)最主要的流行毒株[6]，它們的共流行和雙重感染為二代重組創(chuàng)造了條件。在上世紀(jì)90年代，CRF01_AE由泰國(guó)通過(guò)異性性傳播傳入我國(guó)，最早在我國(guó)云南、廣西等地區(qū)異性傳播人群和吸毒人群中流行[7-8]。CRF07_BC是在我國(guó)云南地區(qū)吸毒人群中發(fā)現(xiàn)的重組毒株[9]，后來(lái)隨毒品網(wǎng)絡(luò)傳至四川、新疆等地區(qū)。隨著傳播途徑由血液傳播、注射吸毒傳播向性接觸傳播轉(zhuǎn)變，CRF01_AE和CRF07_BC快速向其他人群蔓延，特別是MSM人群。

2005年之前，河北省HIV-1主要以血液傳播為主，B亞型是最主要的流行毒株[10]，隨著傳播方式向性傳播，特別是MSM傳播轉(zhuǎn)變，2005年以后，CRF01_AE逐漸成為河北省最主要的流行毒株，B亞型居第2位[11]。相關(guān)研究結(jié)果表明，隨著CRF01_AE的廣泛傳播，其在我國(guó)已經(jīng)形成7個(gè)流行傳播簇[12]。CRF07_BC的傳播主要經(jīng)歷了2個(gè)指數(shù)增長(zhǎng)階段[9]，分別由07BC_O和07BC_N驅(qū)動(dòng)。07BC_O是原始CRF07_BC傳播簇，在注射吸毒者和異性戀人群中傳播，主要分布在我國(guó)西南和西北地區(qū)；07BC_N是一個(gè)新的群體，主要在我國(guó)北方的MSM中發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的推移呈遞增趨勢(shì)，逐漸取代了07BC_O。與廣西、云南等地區(qū)流行的經(jīng)異性性接觸感染和吸毒人群流行簇不同，河北省CRF01_AE傳播簇主要以MSM流行傳播簇為主[11]，CRF07_BC的主要傳播簇是07BC_N。特別是這些流行簇與北京、遼寧等相鄰地區(qū)的MSM人群緊密相關(guān)，聚集成簇[13]，具有較大的傳播風(fēng)險(xiǎn)。

有研究發(fā)現(xiàn)，一個(gè)地區(qū)同時(shí)流行多種毒株是造成雙重感染、多重感染和新型基因重組的主要原因，如廣西地區(qū)的CRF01_AE/CRF07_BC/CRF08_BC三重重組[14]，貴州、遼寧地區(qū)的CRF01_AE/CRF07_BC雙重重組[15-16]。CRF01_AE和B亞型作為主要流行毒株，經(jīng)過(guò)在河北省省內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間的流行，已經(jīng)形成大量具有不同鑲嵌結(jié)構(gòu)的新型CRF01_AE/B重組體[11]，有的已廣泛流行，轉(zhuǎn)化成為CRF，如發(fā)現(xiàn)于保定地區(qū)的CRF103_01B毒株[17]。然而，CRF01_AE/CRF07_BC二代重組鮮有報(bào)道。從2021年開(kāi)始，連續(xù)在MSM人群中發(fā)現(xiàn)2個(gè)具有不同重組斷點(diǎn)的CRF01_AE/CRF07_BC重組體[18-19]，提示隨著CRF07_BC在河北省新報(bào)告病例中所占比例上升到第2位，有其參與重組的重組毒株將會(huì)越來(lái)越多。

本研究確定了以CRF07_BC 為骨架的CRF01_AE/CRF07_BC重組毒株，重組斷點(diǎn)顯示，2個(gè)小的CRF07_BC基因片段分別在gag區(qū)和env區(qū)插入到CRF07_BC基因組骨架中，明顯不同于2021年報(bào)道的二代重組模式[18-19]，再次確認(rèn)了河北省HIV-1遺傳基因的多樣性和流行情況的嚴(yán)峻。另外，河北省發(fā)現(xiàn)的CRF01_AE/CRF07_BC二代重組毒株均來(lái)自MSM人群，我國(guó)已在MSM人群中發(fā)現(xiàn)6種CRF[17]。目前，河北省HIV傳播仍處于上升期，報(bào)告AIDS病例以青壯年為主，性活動(dòng)活躍，近10年來(lái)性傳播持續(xù)成為主要傳播途徑，占96.9%，其中MSM者占64.2%[20]。在河北省已發(fā)現(xiàn)的HIV-1亞型均已在MSM人群中流行，并且CRF01_AE和CRF07_BC已分別在以MSM為主的性傳播人群中形成6個(gè)和1個(gè)大傳播簇，與鄰省形成緊密傳播關(guān)系[11，13]，這為新型重組毒株的形成和傳播創(chuàng)造了條件。自2013年CRF07_BC超越B亞型成為河北省第2位流行毒株以來(lái)，河北省關(guān)于HIV-1全基因組重組結(jié)構(gòu)的研究缺失，提示應(yīng)加強(qiáng)對(duì)性傳播，特別是MSM人群HIV-1基因多樣性和傳播特征的研究，及時(shí)掌握河北省基因重組毒株流行情況，干預(yù)該人群傳播簇的形成，阻止其向外傳播和形成新的CRF。