黃中強(qiáng) 代 娣 侯鐵英 林發(fā)全 盧志明 劉小琦 沈敏娜 吳 潔 張平安 周 軍0 肖艷群 王華梁

（1.上海市臨床檢驗(yàn)中心 上海市實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究院，上海 200126；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 沈陽 110001；3.廣東省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510030；4.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 南寧 530021；5.山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)部，山東 濟(jì)南 250021；6.四川省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳中心，四川 成都 610031；7.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032；8.北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100140；9.武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430060；10.海軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201805）

微小RNA（microRNA，miRNA）是穩(wěn)定存在于血漿中的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，可調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生物學(xué)功能，其表達(dá)異常與惡性腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1-2]。有研究結(jié)果顯示，循環(huán)游離miRNA在肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）癌前和腫瘤負(fù)荷極低狀態(tài)等早期階段即可表達(dá)異常，但單一的miRNA檢測(cè)不足以為腫瘤的早期診斷提供證據(jù)，因此針對(duì)多個(gè)miRNA的高靈敏和高特異性的檢測(cè)，對(duì)了解miRNA的生物學(xué)功能、腫瘤的早期診斷和發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)具有重要意義[3-4]。2011年，7種miRNA特定數(shù)學(xué)模型被建立[5]，使多個(gè)miRNA的組合檢測(cè)在輔助判斷肝癌疾病進(jìn)程和治療效果方面起到了至關(guān)重要的作用，在《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2019年版）》[6]中，miRNA首次被提出作為肝癌的新型分子標(biāo)志物，特別是對(duì)于血清甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）陰性人群。當(dāng)前，多個(gè)miRNA的檢測(cè)通常基于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)[7-8]，該方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，分析便捷，且檢測(cè)成本較低，同時(shí)具有較高的靈敏度和特異性。2017年，國產(chǎn)某品牌基于PCR技術(shù)的“7種微小核糖核酸（miRNA）檢測(cè)試劑盒”獲得國家藥品監(jiān)督管理局三類醫(yī)療器械注冊(cè)證，可用于檢測(cè)7種miRNA（miR-21、miR-26a、miR-27a、miR-122、miR-192、miR-223和miR-801），被廣泛應(yīng)用于臨床。為了全面、客觀地評(píng)價(jià)該試劑盒的檢測(cè)性能，本研究采用多中心性能評(píng)估模式評(píng)價(jià)該試劑盒性能。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取我國不同地區(qū)的10家檢測(cè)中心，分別為上海市臨床檢驗(yàn)中心、中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科、廣東省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科、廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科、山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)部、四川省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳中心、復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科、北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科、武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科、海軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，在2021年9月13日—9月17日使用同一批樣本，對(duì)同一批號(hào)試劑進(jìn)行性能評(píng)估，評(píng)估參數(shù)包括精密度、符合率、檢出限和抗干擾能力。10家檢測(cè)中心分別以A、B、C、D、E、F、G、H、I、J編號(hào)，各檢測(cè)中心環(huán)境溫度為19 ℃～25 ℃，濕度為38%～70%。

1.2 試劑與儀器

駿實(shí)生物科技（上海）有限公司“7種微小核糖核酸（miRNA）檢測(cè)試劑盒”（PCR熒光探針法，批號(hào)21071555），試劑盒內(nèi)包含核酸提取試劑和核酸擴(kuò)增試劑。10家檢測(cè)中心所用的檢測(cè)儀器包括：ABI 7500熒光定量PCR儀（美國賽默飛世爾科技公司）、ABI QuantStudio 5熒光定量PCR儀（美國賽默飛世爾科技公司）、Roche Z480Ⅱ熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司）。

用于精密度評(píng)估的陰性和陽性樣本均為美國Integrated DNA Technologies公司合成的寡核苷酸對(duì)照參考品，共10套樣本，每套含陰性樣本和陽性樣本各3支，每支5.00 mL。收集2021年1—3月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院HCC患者臨床血漿樣本10份，作為用于符合率評(píng)估的陽性樣本；收集健康人群血漿樣本10份，作為陰性樣本。每份樣本分裝為10支，共200支樣本，分裝為10套，每套含陰性樣本和陽性樣本各10支，每支500 μL。用于檢出限評(píng)估的樣本為Integrated DNA Technologies公司合成的1份寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)參考品，濃度為5×105拷貝/μL，使用超純水梯度稀釋至50拷貝/μL并分裝為10套，每套1支，每支5.00 mL。用于抗干擾能力評(píng)估的干擾物分別為血紅蛋白、膽紅素和甘油三酯。血紅蛋白購自德國Sigma-Aldrich公司（批號(hào)SLCJ0443），膽紅素購自美國Frontier Scientific公司（批號(hào)JH21-14583），三酰甘油購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司（批號(hào)F17060801）?？垢蓴_能力評(píng)估的樣本為1份弱陽性臨床混合血漿樣本，由駿實(shí)生物科技（上海）有限公司提供，樣本分裝為10套，每套1支，每支3.00 mL。以上評(píng)估所需的樣本和干擾物均-20 ℃冷鏈保存，24 h內(nèi)運(yùn)送至10家檢測(cè)中心。

1.3 方法

采用手工磁珠法提取核酸，所有評(píng)估實(shí)驗(yàn)所需的核酸均重新提取。采用“7種微小核糖核酸（miRNA）檢測(cè)試劑盒”檢測(cè)miR-21、miR-26a、miR-27a、miR-122、miR-192、miR-223和miR-801的相對(duì)表達(dá)量，以miR-1228為內(nèi)參。循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)條件：42 ℃逆轉(zhuǎn)錄60 min→85 ℃預(yù)變性5 min→95 ℃變性15 s→60 ℃退火/延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各miRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.1 精密度

參考美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP15-A2[9]文件計(jì)算精密度。批內(nèi)精密度：對(duì)1個(gè)陰性和1個(gè)弱陽性樣本各重復(fù)檢測(cè)10次；批間精密度：對(duì)1個(gè)陰性和1個(gè)弱陽性樣本每天各重復(fù)檢測(cè)3次，連續(xù)檢測(cè)5 d。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算不同miRNA循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV），用于評(píng)估精密度。

1.3.2 符合率

參考CNAS GL039-2019文件[10]中符合率的驗(yàn)證方法，對(duì)10例HCC患者和10名健康者的臨床血漿樣本進(jìn)行檢測(cè)，比較檢測(cè)結(jié)果與靶值，并計(jì)算總符合率。

1.3.3 檢出限

參考CLSI EP 17-A文件[11]中檢出限的評(píng)估方法，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)參考品（50拷貝/μL）在不同檢測(cè)批次中進(jìn)行20次重復(fù)檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算檢出率。

1.3.4 抗干擾能力

參考CNAS GL039-2019文件[10]中的抗干擾能力驗(yàn)證方法和《WS/T 416—2013 干擾實(shí)驗(yàn)指南》[12]，結(jié)合試劑盒說明書中的性能指標(biāo)，以在弱陽性樣本中加入干擾物質(zhì)溶液（血紅蛋白、膽紅素、三酰甘油）為實(shí)驗(yàn)組，使干擾物的最終濃度分別為血紅蛋白200 g/L、膽紅素1 000 μmol/L和三酰甘油100 mmol/L；以加入等量的0.9%NaCl溶液為對(duì)照組。各組重復(fù)檢測(cè)3次，比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果的差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel 2016軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)算計(jì)量資料的均值和CV，計(jì)數(shù)資料以率表示。采用Logistic回歸分析評(píng)價(jià)各miRNA聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能。試劑說明書中的計(jì)算公式為：Logit=-1.944 9+0.106 33×dCt miR21+0.102 19×dCt miR26a-0.0124 41×dCt miR27a-0.289 02×dC tmiR122-0.327 79×dCt miR192+0.258 55×dCt miR223-0.029 515×dCt miR801。根據(jù)試劑說明書要求，當(dāng)樣本Logit≥-0.5時(shí)，判定為該樣本檢測(cè)結(jié)果為陽性。

2 結(jié)果

2.1 精密度

2.1.1 批內(nèi)精密度

10家檢測(cè)中心對(duì)1個(gè)陰性和1個(gè)弱陽性樣本各重復(fù)檢測(cè)10次，均能全部檢出；10家檢測(cè)中心檢測(cè)8個(gè)miRNA的Ct值的CV均＜5.00%，其中最大值為4.79%，最小值為0.20%。見表1。

表1 批內(nèi)精密度（CV）評(píng)估結(jié)果 %

2.1.2 批間精密度

10家檢測(cè)中心對(duì)1個(gè)陰性和1個(gè)弱陽性樣本每天各重復(fù)檢測(cè)3次，連續(xù)檢測(cè)5 d，均能全部檢出；10家檢測(cè)中心檢測(cè)8個(gè)miRNA的Ct值的CV均＜6.50%，其中最大值為6.38%，最小值為0.45%。見表2。

表2 批間精密度（CV）評(píng)估結(jié)果 %

2.2 符合率

10家檢測(cè)中心檢測(cè)10例HCC患者和10名健康者臨床血漿樣本的總符合率均為100.00%（20/20）。見表3。

表3 10家檢測(cè)中心Logit值結(jié)果

2.3 檢出限

10家檢測(cè)中心對(duì)50拷貝/μL標(biāo)準(zhǔn)參考品進(jìn)行20次重復(fù)檢測(cè)，檢出率均為100.00%（20/20）。見表4。

表4 10家檢測(cè)中心檢出限樣本的Logit值結(jié)果

2.4 抗干擾能力

10家檢測(cè)中心對(duì)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組樣本的檢測(cè)結(jié)果均為陽性，與對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果一致。進(jìn)一步對(duì)Logit值進(jìn)行分析，并計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的相對(duì)偏差，結(jié)果顯示，10家檢測(cè)中心的相對(duì)偏差均＜20.00%，其中檢測(cè)中心E檢測(cè)100 mmol/L三酰甘油干擾樣本的偏差最大，為19.93%。見表5。

表5 10家檢測(cè)中心抗干擾能力評(píng)估結(jié)果

3 討論

原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率高，患者5年整體生存率僅為14.1%，約70%的肝癌患者就診時(shí)已處于中晚期，因此肝癌的早期診斷和治療是提升肝癌患者存活率的關(guān)鍵[13-14]。

近年來，循環(huán)游離miRNA作為新型的肝癌基因檢測(cè)分子標(biāo)志物，其組合檢測(cè)對(duì)于輔助肝癌早期診斷具有較高價(jià)值，如采用7種血漿miRNA聯(lián)合檢測(cè)可準(zhǔn)確地診斷早期肝癌，敏感性較傳統(tǒng)肝癌標(biāo)志物AFP提高約30%，對(duì)于血清AFP陰性人群也可準(zhǔn)確診斷（敏感性為77.7%，特異性為84.5%）[5]。由于檢測(cè)結(jié)果會(huì)受到檢測(cè)系統(tǒng)、人員能力、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境等因素的影響，單一實(shí)驗(yàn)室對(duì)試劑檢測(cè)性能的評(píng)價(jià)具有一定局限性，本研究采用多中心性能評(píng)估模式，選取10家檢測(cè)中心，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、檢測(cè)系統(tǒng)和檢測(cè)人員均不相同，可代表我國臨床PCR實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力。但10家檢測(cè)中心所用的擴(kuò)增儀均為國外進(jìn)口，缺乏國產(chǎn)主流品牌，因此在后續(xù)的評(píng)價(jià)中將加以完善。

精密度作為評(píng)估檢測(cè)系統(tǒng)的主要性能指標(biāo)之一，可反映實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)系統(tǒng)的重復(fù)性，尤其是檢測(cè)人員的規(guī)范化操作水平。本研究精密度評(píng)估結(jié)果顯示，評(píng)估的試劑盒8個(gè)miRNA對(duì)應(yīng)Ct值的批內(nèi)CV＜5.00%，批間CV＜6.50%，均能達(dá)到試劑盒說明書中廠家聲明的指標(biāo)，說明該試劑盒的檢測(cè)重復(fù)性較好；但10家檢測(cè)中心的CV范圍較寬（批內(nèi)CV為0.22%～4.42%，批間CV為0.45%～6.38%），說明不同實(shí)驗(yàn)室之間精密度差異較大。

本研究參考CNAS GL039-2019文件[10]的性能驗(yàn)證方法，選取臨床確診肺癌患者和健康對(duì)照者的血漿樣本用于符合率評(píng)估，10家檢測(cè)中心的總符合率均為100.00%。檢出限是指能可靠檢出分析物的最低實(shí)際濃度，是體現(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)靈敏度的主要指標(biāo)之一，CLSI EP17-A文件[11]指出，檢出限測(cè)定需在不同日期和不同批次內(nèi)對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)數(shù)據(jù)不少于20個(gè)，由于目前缺乏miRNA相關(guān)的定值標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，本研究選用人工合成的寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)參考品作為檢出限評(píng)估樣本；結(jié)果顯示，10家檢測(cè)中心的檢出率均為100.00%（20/20），與廠家聲明的指標(biāo)相符。在臨床檢驗(yàn)過程中，檢測(cè)結(jié)果經(jīng)常會(huì)受到異常樣本的影響，本研究評(píng)估了肝癌患者常見的溶血、脂血和黃疸樣本對(duì)miRNA檢測(cè)結(jié)果是否存在影響，結(jié)果顯示，含干擾物的樣本均能正常檢出，且與對(duì)照樣本的相對(duì)偏差＜20.00%，表明血紅蛋白200 g/L、膽紅素1 000 μmol/L和三酰甘油100 mmol/L對(duì)檢測(cè)無明顯影響。

綜上所述，7種miRNA檢測(cè)試劑的精密度、符合率、檢出限和抗干擾能力表現(xiàn)良好，可滿足不同地區(qū)、不同實(shí)驗(yàn)室和不同檢測(cè)系統(tǒng)的使用需求和預(yù)期用途。但在臨床應(yīng)用中，因檢測(cè)過程以手工法為主，應(yīng)特別注意規(guī)范檢測(cè)人員操作，以降低隨機(jī)誤差對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，在規(guī)范的質(zhì)量管理體系下保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

致謝：感謝武漢大學(xué)人民醫(yī)院、北京協(xié)和醫(yī)院、四川省人民醫(yī)院、復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院、中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、海軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院、廣東省人民醫(yī)院、廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院的配合和協(xié)助，感謝所有作者在實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)處理等方面作出的支持和幫助。