薛亞澤 何 勁 唐紹軍
(義烏復(fù)元私立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,浙江 金華 322000)
急性腦梗死(acute cerebral infarction,ACI)是腦組織血液供應(yīng)不足引起的局部缺血和缺氧所導(dǎo)致的一系列神經(jīng)功能障礙癥狀,其致殘和致死率較高[1]。目前,ACI常用的診斷方法為電子計算機斷層掃描(computed tomography,CT)和磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI),但對于早期有缺血病灶和體內(nèi)有金屬支架的患者存在一定的局限性,因此有必要尋找更有效的檢測指標(biāo)。另外,ACI的病情復(fù)雜多變,臨床亟需可有效監(jiān)測病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)[2]。微小RNA(microRNA,miRNA)可通過結(jié)合mRNA的3'-非翻譯區(qū)來參與調(diào)控靶基因的表達,其在血清等體液中以穩(wěn)定形式存在,因此可通過檢測其表達來評估機體的生理病理狀態(tài)。有研究結(jié)果顯示,老年急性缺血性腦卒中患者血清miR-150-5p水平異常降低,且與神經(jīng)功能缺損程度有關(guān)[3-4]。潛伏轉(zhuǎn)化生長因子結(jié)合蛋白(latent transforming growth factor-beta binding protein,LTBP)2作為LTBP家族成員之一,在機體動脈損傷、彈性纖維凝聚和細胞黏附中具有重要作用。有研究結(jié)果顯示,冠心病患者血清LTBP2水平顯著升高,可能參與了冠心病的發(fā)生[5]。冠心病具有和ACI相似的發(fā)病機制,均是由血流受阻造成細胞缺血、缺氧,最終導(dǎo)致組織器官壞死。LTBP2與ACI發(fā)生的關(guān)系尚未見報道。因此,本研究擬探討ACI患者血清miR-150-5p和LTBP2水平與ACI病情嚴(yán)重程度的關(guān)系,以期為ACI的臨床監(jiān)測提供參考。
選取2018年5月—2021年2月義烏復(fù)元私立醫(yī)院確診的ACI患者121例(ACI組),其中男67例、女54例,年齡(62.01±7.36)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):1)符合ACI臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[6];2)經(jīng)CT或MRI確診;3)初次發(fā)病。排除標(biāo)準(zhǔn):1)有惡性腫瘤史;2)合并意識障礙;3)近期進行過手術(shù)或有創(chuàng)傷史。根據(jù)ACI患者發(fā)病48~72 h內(nèi)的腦梗死體積,分為小梗死(梗死體積≤4 cm3)組(38例)、中梗死(梗死體積為>4~≤10 cm3)組(43例)、大梗死(梗死體積>10 cm3)組(40例);采用美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(the National Institute of Health Stroke Scale,NIHSS)[7]評估ACI患者神經(jīng)功能缺損程度,將ACI患者分為輕度(NIHSS評分<5分)組(40例)、中度(NIHSS評分5~20分)組(42例)、重度(NIHSS評分>20分)組(39例)。選取同期義烏復(fù)元私立醫(yī)院體檢健康者128名(正常對照組),其中男70名、女58名,年齡(60.27±8.49)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):無基礎(chǔ)疾病,體格檢查和相關(guān)實驗室檢測提示身體健康。2個組之間年齡、性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)義烏復(fù)元私立醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2021042912),所有研究對象及其家屬均簽署知情同意書。
反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號638314)購自上海百賽生物技術(shù)股份有限公司。熒光定量PCR試劑盒(貨號T427S/L)購自廣州英贊生物科技有限公司??俁NA提取試劑盒(貨號AR1200-50T)購自上海吉至生化科技有限公司。Lepgen-96實時熒光定量PCR儀購自北京樂普診斷科股份有限公司。
1.3.1 一般資料收集和樣本采集
收集所有研究對象的一般資料,包括年齡、性別、體重指數(shù)(body mass index,BMI)、飲酒史、吸煙史、高血壓史。采集ACI患者入院6 h內(nèi)和正常對照組體檢當(dāng)日清晨空腹靜脈血5 mL,1 007×g離心15 min,分離血清,-80 ℃保存待測。
1.3.2 血清miR-150-5p及LTBP-2 mRNA檢測
采用總RNA提取試劑盒提取血清樣本中的總RNA,采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)。引物由深圳華大基因公司設(shè)計、合成,引物序列見表1。分別以U6和β-actin作為miR-150-5p和LTBP-2的內(nèi)參。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性15 min;95 ℃變性15 s,65 ℃退火延伸45 s,40個循環(huán)。反應(yīng)體系:cDNA(50 ng/μL)2 μL,SYBR Green Master Mix(2×)10 μL,上游引物(10 μmol/L)0.5 μL,下游引物(10 μmol/L)0.5 μL,加ddH2O至20 μL。采用2-ΔΔCt法計算miR-150-5p和LTBP-2 mRNA相對表達量。
表1 引物序列
1.3.3 Targetscan網(wǎng)站預(yù)測
采用Targetscan在線軟件(http://www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測miR-150-5p與LTBP-2之間的結(jié)合位點。
采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示,2個組之間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗。采用Pearson相關(guān)分析評估ACI患者miR-150-5p與LTBP-2的相關(guān)性。采用Logistic回歸分析評估ACI發(fā)生的影響因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
ACI 組與正常對照組BMI、飲酒史、吸煙史、高血壓史差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。
表2 ACI組與正常對照組一般資料比較
與正常對照組比較,ACI組血清miR-150-5p相對表達量顯著降低(P<0.001),LTBP-2 mRNA相對表達量顯著升高(P<0.001)。見表3。
表3 ACI組與正常對照組血清miR-150-5p和LTBP-2 mRNA相對表達量比較
小梗死組、中梗死組和大梗死組血清miR-150-5p相對表達量依次降低(P<0.001),LTBP-2 mRNA相對表達量依次升高(P<0.001)。見表4。
表4 不同梗死體積ACI患者血清miR-150-5p和LTBP-2 mRNA相對表達量比較
輕度組、中度組和重度組血清miR-150-5p相對表達量依次降低(P<0.001),LTBP-2 mRNA相對表達量依次升高(P<0.001)。見表5。
表5 不同NIHSS評分ACI患者血清miR-150-5p和LTBP-2 mRNA相對表達量比較
Targetscan網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果顯示:miR-150-5p和LTBP-2之間存在結(jié)合位點,見圖1。LTBP-2是miR-150-5p潛在的靶基因。
圖1 miR-150-5p與LTBP-2的結(jié)合位點
Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示,ACI組血清miR-150-5p表達與LTBP-2表達呈負(fù)相關(guān)(r=-0.346,P<0.001)。見圖2。
圖2 ACI患者血清miR-150-5p與LTBP-2 mRNA表達的相關(guān)性
將是否發(fā)生ACI作為因變量(未發(fā)生=0,發(fā)生=1),miR-150-5p和LTBP-2 mRNA相對表達量作為自變量(賦值均為實測值)。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示,miR-150-5p表達降低、LTBP-2 mRNA表達升高是ACI發(fā)生的危險因素[比值比(odds ratio,OR)值分別為0.563、1.698,95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)分別為0.445~0.712、1.342~2.148]。見表6。
表6 ACI發(fā)生的危險因素分析
動物實驗結(jié)果顯示,促進血管生成有助于恢復(fù)血液供應(yīng),促進大腦恢復(fù),改善小鼠腦缺血情況[8-9]。miR-150-5p是一個相對保守的miRNA,在調(diào)節(jié)血管生成中具有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn),中風(fēng)模型大鼠腦組織和血清中miR-150相對表達量異常降低[10]。大鼠骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞可分化成血管內(nèi)皮細胞,并分泌多種促血管生成因子,以此促進缺血組織中血管新生,miR-150過表達可提高內(nèi)皮祖細胞的成管能力,除此之外,內(nèi)皮祖細胞遷移至深靜脈血栓中還可促進血栓再通,而miR-150高表達能顯著提高細胞的遷移能力[11]。還有研究發(fā)現(xiàn),缺血性腦卒中患者外周血miR-150-5p相對表達量顯著低于正常對照組(P<0.001),與缺血性腦卒中的發(fā)生密切相關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示,ACI組血清miR-150-5p相對表達量顯著低于正常對照組(P<0.001),且隨梗死體積和NIHSS評分的增加而降低(P<0.001),表明miR-150-5p參與了ACI的發(fā)生,并隨疾病嚴(yán)重程度增加而顯著降低,有作為ACI監(jiān)測指標(biāo)的潛能,連續(xù)監(jiān)測或可用于判斷疾病進展程度。
LTBP-2作為細胞外基質(zhì)糖蛋白,在心臟、大腦中均有表達,其在血管內(nèi)皮損傷和彈性纖維凝聚等方面具有重要作用[13]。冠心病患者血清LTBP-2相對表達量隨疾病嚴(yán)重程度加重而升高[14-15]。冠心病和ACI作為心腦血管疾病中的兩大主要疾病,均是由細胞缺血、缺氧造成組織壞死所導(dǎo)致的,因此本研究檢測了ACI患者血清LTBP-2的表達情況。本研究結(jié)果顯示,相較于正常對照組,ACI組血清LTBP-2相對表達量顯著升高(P<0.001),并隨梗死體積和NIHSS評分的增加而升高(P<0.001)。表明LTBP-2同樣參與了ACI的發(fā)生、發(fā)展,其相對表達量與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān),這為ACI的發(fā)生和治療的機制研究提供了一個新的研究方向。
本研究通過靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)LTBP-2是miR-150-5p潛在的靶基因,兩者呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.346,P<0.001)。提示miR-150-5p與LTBP-2可能共同參與了ACI的發(fā)生。因此,miR-150-5p參與ACI的發(fā)生可能與調(diào)控LTBP-2表達有關(guān)。本研究多因素Logisitc回歸分析結(jié)果顯示,miR-150-5p低表達和LTBP-2高表達均是ACI發(fā)生的危險因素(OR值分別為0.563、1.698,95%CI分別為0.445~0.712、1.342~2.148)。提示miR-150-5p和LTBP-2與ACI的發(fā)生密切相關(guān),因此,miR-150-5p和LTBP-2或可作為ACI臨床監(jiān)測指標(biāo)。
綜上所述,ACI患者血清miR-150-5p呈低表達,LTBP-2呈高表達,二者與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān),或可作為ACI病情監(jiān)測的參考指標(biāo)。本研究為尋找ACI臨床監(jiān)測指標(biāo)提供了一個新的方向,但還需對ACI患者進行隨訪,觀察患者預(yù)后和轉(zhuǎn)歸情況,以期為ACI患者的預(yù)后評估提供更全面的參考。