陸庭嫣 顧丹鳳 王亞虹 葛亞芳 楊海鷗

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國際和平婦幼保健院檢驗(yàn)科 上海市胚胎源性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200030）

陰道分泌物顯微鏡鏡檢（白帶常規(guī)）是女性細(xì)菌性陰道病（bacterial vaginosis，BV）、外陰陰道假絲酵母菌?。╲ulvovaginal candidiasis，VVC）、滴蟲性陰道炎（trichomonas vaginitis，TV）和炎癥細(xì)胞評(píng)估的常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目[1]。近年來，隨著檢驗(yàn)技術(shù)自動(dòng)化和智能化的不斷發(fā)展，白帶常規(guī)檢測(cè)經(jīng)歷了從人工鏡檢到半自動(dòng)干化學(xué)分析，再到全自動(dòng)有形成分聯(lián)合干化學(xué)檢測(cè)的發(fā)展過程[2-5]，檢測(cè)效率逐步提升。然而，干化學(xué)酶檢測(cè)具有局限性[6-9]，白帶有形成分具有多樣性[10]，為了驗(yàn)證和了解各種檢測(cè)模式對(duì)疾病篩查的準(zhǔn)確性和敏感性，本研究結(jié)合實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有儀器設(shè)備，對(duì)不同檢測(cè)模式的臨床漏診率和實(shí)驗(yàn)室復(fù)檢率進(jìn)行分析，建立優(yōu)選檢測(cè)模式顯微鏡復(fù)檢規(guī)則，并進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集2021年2—5月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國際和平婦幼保健院門診患者陰道拭子1 334份，其中1 064份用于建立規(guī)則的樣本不限制送檢科室來源和患者年齡，連續(xù)隨機(jī)納入，每天不超過50份；270份用于規(guī)則驗(yàn)證的樣本主要選自婦科門診、宮頸門診等陰道炎癥患者較多的臨床科室門診，以確保小樣本量情況下BV、VVC、TV的陽性驗(yàn)證需求。樣本采集部位和方法參照第4版《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[1]。

1.2 儀器和試劑

重慶天海公司BD500白帶檢測(cè)分析儀和配套一次性計(jì)數(shù)板、清洗液。石家莊博洋生物科技公司陰道炎五聯(lián)檢試劑盒。鄭州安圖公司AutowoMO生殖道分泌物干化學(xué)檢測(cè)儀和配套試劑。日本Olympus公司CX41光學(xué)顯微鏡。革蘭染液（珠海貝索公司）。

1.3 方法

采集后的樣本由專人負(fù)責(zé)處理，取樣后1 h內(nèi)完成檢測(cè)。將儀器檢測(cè)后的剩余樣本混勻，用一次性滴管等量滴加2張玻片，1張用于人工鏡檢白細(xì)胞計(jì)數(shù)和線索細(xì)胞、菌絲/孢子、滴蟲；1張待自然干燥后用火焰固定，行革蘭染色鏡檢。2種鏡檢分別由1名有經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)技師雙盲完成。根據(jù)說明書要求進(jìn)行操作和結(jié)果判定。

1.3.1 參考方法

依據(jù)國內(nèi)外相關(guān)指南[11-13]推薦的B V、VVC、TV診斷參考方法，本研究將濕片鏡檢聯(lián)合革蘭染色鏡檢（簡(jiǎn)稱聯(lián)合鏡檢）結(jié)果作為不同檢測(cè)模式性能評(píng)估和復(fù)檢方案驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)。濕片鏡檢判斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)第4版《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[1]，革蘭染色鏡檢判斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)Nugent評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[14]。以濕片10個(gè)高倍鏡視野均值為白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果；革蘭染色5～10個(gè)視野區(qū)域內(nèi)Nugent評(píng)分≥7分為BV陽性；以濕片鏡檢或革蘭染色鏡檢任一方法陽性為真菌菌絲/孢子陽性；滴蟲以濕片鏡檢陽性為標(biāo)準(zhǔn)，但當(dāng)鏡下活動(dòng)度減弱疑似不確定時(shí)，需補(bǔ)充核酸檢測(cè)進(jìn)行確認(rèn)，并以核酸檢測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)。

1.3.2 檢測(cè)模式

模式1：陰道炎五聯(lián)檢；模式2：儀器法干化學(xué)酶檢測(cè)；模式3：儀器法有形成分分析；模式4：儀器法有形成分分析聯(lián)合陰道炎五聯(lián)檢；模式5：儀器法有形成分聯(lián)合儀器法干化學(xué)酶檢測(cè)。

1.3.3 3類初始復(fù)檢方案

目前，我國陰道分泌物自動(dòng)/半自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)的顯微鏡復(fù)檢方案相關(guān)文獻(xiàn)較少，也缺乏相應(yīng)的規(guī)范化文件可供參考。陰道分泌物有形成分和干化學(xué)檢測(cè)的方法和原理與同為體液學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域的尿液有形成分和干化學(xué)分析極為相似，但又與尿液檢測(cè)中細(xì)胞的定量分析要求不同：BV、VVC、TV相應(yīng)病原體在陰道分泌物有形成分中的形態(tài)識(shí)別和確認(rèn)是疾病篩查的重要依據(jù)。《陰道微生態(tài)評(píng)價(jià)的臨床應(yīng)用專家共識(shí)》[15]指出，若形態(tài)學(xué)檢測(cè)與功能學(xué)檢測(cè)結(jié)果不一致，以形態(tài)學(xué)結(jié)果為主要參考指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)室基于陰道分泌物檢測(cè)特性，并參考張時(shí)民[16]和吳曉華等[17]對(duì)尿液有形成分和干化學(xué)分析的基本篩檢規(guī)則，設(shè)立了3類初始復(fù)檢方案。

1）方案1。單獨(dú)進(jìn)行干化學(xué)檢測(cè)時(shí)，BV、VVC、TV任一項(xiàng)目提示陽性時(shí)，進(jìn)入顯微鏡復(fù)檢程序。2）方案2。單獨(dú)使用圖像式有形成分分析儀時(shí)，線索細(xì)胞、真菌菌絲/孢子、滴蟲任一有形成分陽性時(shí)，進(jìn)入儀器圖譜審核程序，如圖譜陽性成分形態(tài)典型，直接判為陽性，反之判為陰性；若圖譜陽性成分形態(tài)不典型或圖像對(duì)焦不清晰難以辨別，則進(jìn)入顯微鏡復(fù)檢程序。3）方案3。有形成分分析和干化學(xué)酶檢測(cè)聯(lián)合使用，2種方法陽性結(jié)果相符或有形成分分析陽性而干化學(xué)酶檢測(cè)陰性時(shí)，以儀器圖譜有形成分結(jié)果為準(zhǔn)，陽性形態(tài)典型者直接判斷為陽性，錯(cuò)誤識(shí)別者判為陰性，陽性形態(tài)非典型或圖像不清晰難以辨別者進(jìn)入顯微鏡復(fù)檢程序。有形成分分析陰性而干化學(xué)酶檢測(cè)陽性時(shí)：查看儀器圖譜“未分類、上皮細(xì)胞、白細(xì)胞”分類欄是否有未被識(shí)別的陽性成分，如有典型的分類錯(cuò)誤或未識(shí)別的陽性成分，則修正結(jié)果為陽性，若未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)陽性成分，則判為陰性。

1.3.4 顯微鏡復(fù)檢程序

1）BV顯微鏡復(fù)檢程序。濕片高倍鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)典型的線索細(xì)胞或大量的雜菌成團(tuán)聚集（革蘭染色可見Nugent評(píng)分≥7分的細(xì)菌成團(tuán)聚集的特征，簡(jiǎn)稱為BV相關(guān)細(xì)菌團(tuán)），可以直接判斷為BV陽性，反之為陰性；若濕片高倍鏡鏡檢不典型或難以辨別線索細(xì)胞，則通過Nugengt評(píng)分進(jìn)行二次確認(rèn)。

2）VVC、TV顯微鏡復(fù)檢程序。濕片鏡檢發(fā)現(xiàn)典型的真菌菌絲/孢子、滴蟲者，可直接判斷為VVC陽性、TV陽性；未觀察到則為陰性。

1.3.5 不同檢測(cè)模式性能評(píng)價(jià)

以聯(lián)合鏡檢結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)5種檢測(cè)模式的敏感性、特異性、假陽性率、假陰性率和符合率。選擇敏感性、符合率最高的檢測(cè)模式對(duì)相關(guān)疾病進(jìn)行初篩。

對(duì)濕片鏡檢的白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果和儀器法有形成分分析的白細(xì)胞等級(jí)進(jìn)行一致性評(píng)估：儀器法有形成分分析白細(xì)胞分級(jí)陰性為0級(jí)，+為1級(jí)，++為2級(jí)，+++為3級(jí)；濕片鏡檢白細(xì)胞計(jì)數(shù)0～5個(gè)/高倍鏡視野為0級(jí)、5～15個(gè)/高倍鏡視野為1級(jí)、15～30個(gè)/高倍鏡視野為2級(jí)、≥30個(gè)/高倍鏡視野為3級(jí)。

1.3.6 優(yōu)選檢測(cè)模式復(fù)檢規(guī)則的建立和驗(yàn)證

在初始復(fù)檢規(guī)則的基礎(chǔ)上，再對(duì)優(yōu)選檢測(cè)模式的假陰性結(jié)果進(jìn)行分析，利用有形成分與干化學(xué)項(xiàng)目的對(duì)應(yīng)關(guān)系，調(diào)整復(fù)檢規(guī)則。在復(fù)檢量可接受的情況下，加大儀器陽性報(bào)警提示，以降低假陰性漏檢的概率，從而建立優(yōu)選檢測(cè)模式的復(fù)檢規(guī)則。再根據(jù)國內(nèi)外通用的復(fù)檢規(guī)則評(píng)估指標(biāo)[18-21]評(píng)估優(yōu)選檢測(cè)模式復(fù)檢規(guī)則的真陽性率、假陽性率、真陰性率、假陰性率（漏診率）和復(fù)檢率，驗(yàn)證復(fù)檢規(guī)則的臨床適用性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例或率表示，比較采用配對(duì)四格表χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 聯(lián)合鏡檢結(jié)果

聯(lián)合鏡檢結(jié)果顯示，用于建立復(fù)檢規(guī)則的1 064份樣本中，線索細(xì)胞/Nugent評(píng)分≥7分的BV陽性率為18.80%（200/1 064），真菌菌絲/孢子陽性率為14.10%（150/1 064），滴蟲陽性率為1.03%（11/1 064），BV+TV陽性率為0.38%（4/1 064），BV+VVC陽性率為2.82%（30/1 064）?？傟栃月蕿?0.83%（328/1 064）。

2.2 儀器法有形成分分析和濕片鏡檢的一致性

儀器法有形成分分析與濕片鏡檢結(jié)果一致的樣本有672例，一致率為63.16%（672/1 064），Kappa值=0.474。Kendall相關(guān)分析結(jié)果顯示兩者呈正相關(guān)（r=0.738，P＜0.005），Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示白細(xì)胞分級(jí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。儀器法有形成分分析白細(xì)胞分級(jí)較濕片鏡檢平均高1級(jí)。見表1。

表1 儀器法有形成分分析和濕片鏡檢結(jié)果一致性分析 份

2.3 5種檢測(cè)模式篩查BV、VVC、TV的性能評(píng)估結(jié)果

2.3.1 5種檢測(cè)模式與聯(lián)合鏡檢結(jié)果的一致性

5種檢測(cè)模式中，檢測(cè)結(jié)果與聯(lián)合鏡檢檢測(cè)結(jié)果一致性最高的是儀器法有形成分分析+儀器法干化學(xué)酶檢測(cè)，最低的是單獨(dú)陰道炎五聯(lián)檢。見表2。

表2 5種檢測(cè)模式與參考方法的符合情況

2.3.2 5種檢測(cè)模式篩查BV、VVC、TV的性能比較

5種檢測(cè)模式篩查BV、VVC的敏感性、特異性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。篩查BV敏感性最高的是儀器法有形成分分析+儀器法干化學(xué)酶檢測(cè)，最低的是陰道炎五聯(lián)檢；篩查VVC敏感性最高的是儀器法有形成分分析+儀器法干化學(xué)酶檢測(cè)，2種單獨(dú)干化學(xué)檢測(cè)模式（陰道炎五聯(lián)檢和儀器法干化學(xué)酶檢測(cè)）敏感性均較低；5種檢測(cè)模式篩查TV的敏感性、特異性均較高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.926）。見表3。

表3 5種檢測(cè)模式篩查BV、VVC、TV的性能和總符合率 %

2.3.3 最優(yōu)檢測(cè)模式的確定和性能驗(yàn)證

以敏感性和總符合率最高的儀器法有形成分分析+儀器法干化學(xué)酶檢測(cè)模式為最優(yōu)方法，在初始復(fù)檢規(guī)則的基礎(chǔ)上分析該模式篩查3種疾病的真陽性率、假陽性率、真陰性率、假陰性率（漏診率）、符合率和復(fù)檢率，結(jié)果見表4。

表4 最優(yōu)檢測(cè)模式的檢測(cè)性能

2.4 最優(yōu)檢測(cè)模式假陰性結(jié)果分析及其初始復(fù)檢規(guī)則的調(diào)整

漏檢BV的88份樣本中，有16份儀器法有形成分分析未檢出線索細(xì)胞；儀器法干化學(xué)酶檢測(cè)脯氨酸氨基肽酶（±），但無報(bào)警提示；1份唾液酸苷酶弱陽性樣本有報(bào)警提示，但圖譜審核陰性。為降低BV漏檢率，補(bǔ)充了1條復(fù)檢規(guī)則，見表5規(guī)則4。63份漏檢VVC的樣本中，有12份儀器法干化學(xué)酶檢測(cè)乙酰氨基葡萄糖苷酶（+）或（±）、葡萄糖苷酶和凝固酶同時(shí)（+）或（±），且提示VVC或TV陽性報(bào)警，但儀器法有形成分分析均未檢出真菌菌絲/孢子、滴蟲，儀器圖譜審核也未發(fā)現(xiàn)陽性成分。為降低VVC漏檢率，補(bǔ)充了1條復(fù)檢規(guī)則，見表5規(guī)則5。

表5 最優(yōu)檢測(cè)方法復(fù)檢規(guī)則

2.5 復(fù)檢規(guī)則驗(yàn)證

270份樣本驗(yàn)證結(jié)果提示，有67份需復(fù)檢，其中9份需行革蘭染色復(fù)檢BV，總復(fù)檢率為24.81%（67/270），假陰性率較初始規(guī)則低。復(fù)檢規(guī)則驗(yàn)證結(jié)果見表6。

3 討論

傳統(tǒng)的濕片鏡檢白帶常規(guī)是篩查女性下生殖道感染性疾病（BV、VVC、TV）和炎癥評(píng)估最簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的方法。但當(dāng)樣本量增多、操作人員的閱片壓力增大時(shí)，閱片經(jīng)驗(yàn)會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響。為解決這一問題，適用于大樣本量的各類半自動(dòng)/全自動(dòng)分析系統(tǒng)越來越多地應(yīng)用于臨床。

圖像識(shí)別式白帶有形成分分析儀采用光鏡高倍（40×10）分辨率形態(tài)學(xué)檢查原理，通過計(jì)算機(jī)軟件對(duì)圖像進(jìn)行圖形比對(duì)，識(shí)別各類有形成分，并分類、計(jì)數(shù)[22]。然而，白帶成分的多樣性、復(fù)雜性，以及高倍鏡下細(xì)胞、菌群識(shí)別能力的局限性，會(huì)導(dǎo)致某些成分的漏判或誤判。

陰道分泌物干化學(xué)分析儀基本均可測(cè)定陰道酸堿度、評(píng)估乳酸桿菌功能、檢測(cè)微生物代謝產(chǎn)物。對(duì)于BV、VVC、TV的判斷主要是測(cè)定其相對(duì)應(yīng)的陰道微生物代謝產(chǎn)物和酶的活性[23]，但是某些標(biāo)記的酶多種微生物均能產(chǎn)生，如氨基葡萄糖苷酶在滴蟲和白念珠菌中均存在，只能依據(jù)pH值來區(qū)分[24]。但pH值的檢測(cè)結(jié)果往往又受到陰道沖洗、陰道給藥、經(jīng)期、試紙質(zhì)量、標(biāo)本放置時(shí)間等較多因素的影響[25]，可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的陽性提示。

本研究設(shè)計(jì)了5種白帶常規(guī)檢測(cè)模式，基本涵蓋了臨床實(shí)驗(yàn)室常用的陰道分泌物自動(dòng)/半自動(dòng)分析模式。通過參考方法的評(píng)估，最終證實(shí)儀器法有形成分分析+儀器法干化學(xué)酶檢測(cè)模式篩查BV、VVC、TV的敏感性和符合率優(yōu)于單獨(dú)的干化學(xué)檢測(cè)或單獨(dú)的有形成分分析，通過建立聯(lián)合檢測(cè)模式復(fù)檢規(guī)則，可進(jìn)一步降低假陰性率。聯(lián)合檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)在于儀器有形成分的自動(dòng)識(shí)別和分類大大減輕了人工鏡檢的視覺疲勞和操作人員的主觀性識(shí)別差異，掃描成像的各成分形態(tài)圖譜可自動(dòng)分類并進(jìn)行溯源回顧，有助于對(duì)陽性結(jié)果的確認(rèn)審核；而搭配了干化學(xué)酶法的相對(duì)應(yīng)項(xiàng)目陽性報(bào)警又能彌補(bǔ)儀器有形成分識(shí)別分類錯(cuò)誤或漏檢的可能。但是儀器法干化學(xué)酶檢測(cè)的檢測(cè)能力可能會(huì)因試劑品牌有較大差異，且不同檢測(cè)原理的有形成分分析儀間形態(tài)識(shí)別能力也可能會(huì)存在差異。不同實(shí)驗(yàn)室使用不同的儀器、試劑和檢測(cè)方法時(shí)，應(yīng)依據(jù)可行標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估不同儀器特性和不同檢測(cè)方法的敏感性、特異性，制定個(gè)性化的復(fù)檢規(guī)則，盡可能降低臨床漏診率。

值得強(qiáng)調(diào)的是，參考方法對(duì)于不同檢測(cè)方法敏感性、特異性的評(píng)估是至關(guān)重要的，不能簡(jiǎn)單地參照尿液檢測(cè)儀器評(píng)估的方法，僅僅以濕片鏡檢結(jié)果做為參考。2018年，BV診斷歐洲指南[11]指出：革蘭染色鏡檢是診斷BV的參考方法，雖然Amsel臨床標(biāo)準(zhǔn)中濕片高倍顯微鏡下的線索細(xì)胞與革蘭染色結(jié)果密切相關(guān)，但其敏感性低于革蘭染色鏡檢，因而僅以濕片鏡檢為參考會(huì)造成BV的漏檢。對(duì)于VVC的診斷，2018年歐洲指南[11]和2012年我國VVC診治指南[12]均指出：陰道分泌物濕片和革蘭染色鏡檢檢出芽生孢子、菌絲或假菌絲都可診斷VVC，且革蘭染色鏡檢敏感性略高于濕片鏡檢，基于此，本研究以聯(lián)合鏡檢中任一種方法陽性為陽性標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示，濕片鏡檢與革蘭染色鏡檢篩查BV的敏感性、特異性差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），篩查VVC僅敏感性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.031），進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究參考方法選擇依據(jù)的正確。對(duì)于TV的診斷，2018年歐洲指南[11]和2020年美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)指南[13]均指出：顯微鏡檢查陰道分泌物懸液觀察陰道毛滴蟲是當(dāng)前最常用來診斷TV的方法，但敏感性只有45%～60%，推薦通過核酸檢測(cè)診斷TV?；诖?，本研究確認(rèn)將2種鏡檢方式的結(jié)果聯(lián)合判斷可保證參考方法的準(zhǔn)確性，且必要時(shí)補(bǔ)充核酸檢測(cè)確認(rèn)TV。

參考方法的驗(yàn)證為選擇BV、VVC、TV的顯微鏡復(fù)檢方式提供了依據(jù)。BV的顯微鏡復(fù)檢僅單純依靠濕片高倍鏡檢難以準(zhǔn)確識(shí)別線索細(xì)胞，因?yàn)橛行┘?xì)菌，如大量的陽性球菌或陽性桿菌也會(huì)有上皮細(xì)胞的黏附現(xiàn)象，只有革蘭染色油鏡觀察才能避免線索細(xì)胞假陽性，故本研究確立了BV的顯微鏡復(fù)檢方式為：濕片高倍鏡下難以鑒別時(shí)，行革蘭染色二次確認(rèn)。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然革蘭染色后，識(shí)別真菌菌絲孢子較濕片更容易區(qū)分VVC，敏感性也略高于濕片鏡檢，但2種鏡檢方式的特異性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了使復(fù)檢規(guī)則更適用于實(shí)際操作，本研究設(shè)定了VVC、TV的顯微鏡復(fù)檢只需要濕片低倍鏡或高倍鏡識(shí)別確認(rèn)即可。

本研究中，儀器法有形成分分析的白細(xì)胞分級(jí)較濕片鏡檢平均高1級(jí)，常見原因?yàn)椋?）基底層小圓上皮細(xì)胞在人工鏡檢時(shí)較容易被區(qū)分，但儀器計(jì)數(shù)時(shí)因其大小與白細(xì)胞相近，可能被誤判為白細(xì)胞；2）某些BV陽性的樣本中雜菌黏附成團(tuán)的BV相關(guān)細(xì)菌團(tuán)易被儀器誤判為白細(xì)胞。提示在儀器法有形成分分析白細(xì)胞計(jì)數(shù)等級(jí)與白細(xì)胞脂酶等級(jí)相差較大時(shí)，需通過圖譜確認(rèn)或顯微鏡復(fù)檢確認(rèn)。

綜上所述，現(xiàn)有儀器法干化學(xué)酶檢測(cè)聯(lián)合儀器法有形成分分析可以有效提升BV、VVC、TV檢測(cè)敏感性、降低復(fù)檢率。聯(lián)合鏡檢更適用于BV、VVC、TV的復(fù)檢確認(rèn)。